載三氧化二砷pH敏感型脂質(zhì)體的制備及體內(nèi)外評(píng)價(jià)

黃劍宇，王永明，王若寧，狄留慶

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中藥高效給藥系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210023)

三氧化二砷(Arsenic trioxide，ATO)由中藥砒石升華純化而來，是傳統(tǒng)中藥礦物藥砒霜的主要成分。《本草綱目》中即有記載用于“蝕癰疽敗肉”[1]，20世紀(jì)70年代開始在治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(Acute promyelocytic leukemia，APL)方面取得了顯著的療效[2]。近年來有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)ATO在治療肝癌、乳腺癌以及腦膠質(zhì)瘤等實(shí)體瘤方面具有良好的活性[3-4]，可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡等途徑抑制實(shí)體瘤的生長(zhǎng)[3,5]。在腦膠質(zhì)瘤的治療方面，研究發(fā)現(xiàn)ATO可阻斷惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中過度表達(dá)的Notch1受體，從而減少膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和復(fù)發(fā)[6-7]；通過靶向結(jié)合髓母細(xì)胞瘤發(fā)生相關(guān)Hh/GLI通路上的GLI1蛋白，抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從而阻斷Hh/GLI途徑[8-9]；通過上調(diào)線粒體細(xì)胞死亡蛋白BNIP3，誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞自噬性死亡等。此外還有對(duì)ATO進(jìn)行臨床研究的報(bào)道，如ATO應(yīng)用于兒童浸潤(rùn)性星形細(xì)胞瘤的Ⅰ期臨床以及與替莫唑胺(TMZ)聯(lián)用治療惡性腦膠質(zhì)瘤的Ⅱ期臨床研究[10-11]。然而ATO為水溶性無機(jī)鹽，體內(nèi)靶向性差，無特異性分布，因而毒性較大，不良反應(yīng)明顯[12-13]。

脂質(zhì)體具有雙層磷脂的類細(xì)胞結(jié)構(gòu)特性，生物相容性佳且載藥能力好，是疏水性藥物及親水性藥物的優(yōu)良載體，并且能一定程度上改變藥物在體內(nèi)的分布，降低藥物的毒性。脂質(zhì)體磷脂雙分子層的類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)使其較其他納米載體更易跨越血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)。利用一些特定的配體(轉(zhuǎn)鐵蛋白[14]、乳鐵蛋白[15]及腫瘤穿透肽[16]等)進(jìn)行修飾后，脂質(zhì)體可以更加高效地跨越BBB從而將藥物遞送至腦膠質(zhì)瘤部位。然而，ATO在水溶液中的存在形式為亞砷酸根(HAsO32-)，離子強(qiáng)度較高，可自由穿透脂質(zhì)體的磷脂雙層，造成脂質(zhì)體的不穩(wěn)定，進(jìn)而產(chǎn)生泄漏[17]。過渡金屬M(fèi)n2+是一種T1造影劑[18]，可增強(qiáng)MRI信號(hào)，此外還能與HAsO32-絡(luò)合反應(yīng)生成MnHAsO3沉淀，而該沉淀具有在酸性條件下分解的特性[19-20]?；诖?，本研究利用了ATO與Mn絡(luò)合生成MnAs沉淀的特性，采用反相微乳法制備納米粒徑的MnAs共沉淀[21-23]，并對(duì)其進(jìn)行疏水性修飾，進(jìn)一步負(fù)載于脂質(zhì)體中，從而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定負(fù)載ATO的目的。其中，MnAs共沉淀對(duì)酸性pH敏感，可在弱酸條件下分解生成Mn2+及HAsO32-，實(shí)現(xiàn)腫瘤酸性微環(huán)境下響應(yīng)釋放的目的。本研究從MnAs共沉淀的制備與疏水性修飾，負(fù)載MnAs共沉淀脂質(zhì)體Liposome/MnAs的構(gòu)建與表征、體外抗腦膠質(zhì)瘤活性評(píng)價(jià)及體內(nèi)安全性等方面考察其特性。

1 材料

Nano-ZS 90激光粒度分析儀，英國(guó)Malvern儀器有限公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；HT7800透射電子顯微鏡(TEM)，日本日立公司；Gallios流式細(xì)胞儀，美國(guó)貝克曼庫爾特公司；Thermo XSERIES 2等離子體質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Fisher公司；Biospec 7T/20 USR核磁共振成像儀，德國(guó)Bruker公司。

三氧化二砷，南京中醫(yī)藥大學(xué)資產(chǎn)處申領(lǐng)；二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)，西安瑞禧有限公司；1，2-油?；字徕c鹽(DOPA)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；香豆素6，碧云天有限公司；檸檬酸緩沖鹽溶液，北京雷根生物技術(shù)有限公司；四水合氯化錳、四甲基偶氮唑鹽(MTT)，美國(guó)Sigma公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒，南京建成有限公司；DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素溶液、磷酸緩沖鹽溶液，美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清，美國(guó)Gibco公司。

鼠源性腦膠質(zhì)瘤GL261細(xì)胞，南京貝佳生物公司。C57BL/6小鼠，雌性，6～8周齡，18～22 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005，南京青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 Liposome/MnAs的制備

2.1.1 MnAs共沉淀內(nèi)核的制備及疏水性修飾 吸取環(huán)己烷7.5 mL、曲拉通1.5 mL、正己醇1 mL，磁力攪拌混合10 min，形成透明穩(wěn)定的反相微乳體系。氯化錳溶液100 μL逐滴加入至反相微乳體系中，磁力攪拌。相同摩爾濃度的ATO溶液100 μL逐滴加入，磁力攪拌，生成淡黃色的MnAs共沉淀。

向MnAs共沉淀的反相微乳體系中逐滴加入20 mmol/L的DOPA氯仿溶液100 μL，磁力攪拌2 h。

加入等量的無水乙醇至已疏水性修飾的MnAs共沉淀的反相微乳體系，離心去除有機(jī)溶劑和表面活性劑。無水乙醇洗滌2～3次，即得DOPA疏水性修飾后的MnAs共沉淀。氯仿溶解，冷藏備用。

如圖1A所示，該環(huán)己烷-曲拉通-正己醇反相微乳體系下MnAs共沉淀的最佳反應(yīng)濃度為0.2 mol/L的ATO，濃度過高時(shí)可能離子濃度過高，使得反相微乳制備體系不穩(wěn)定，生成效率反而降低；濃度過低時(shí)則MnAs共沉淀的反應(yīng)效率較低，共沉淀中As3+較少。洗滌后，MnAs共沉淀可被氯仿溶解，溶液呈透明淡黃色(圖1B)，說明MnAs共沉淀已被DOPA較好地修飾，具備疏水性。

A B

圖1 MnAs共沉淀的ATO不同反應(yīng)濃度考察(A)及
疏水性修飾(B)

2.1.2 Liposome/MnAs的制備 稱取DMPC 1.5 mg，加入“2.1.1”項(xiàng)制備的MnAs共沉淀溶液0.5 mL溶解，逐滴加入至超純水中攪拌乳化。超聲破碎(195 W)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑。30 kDa超濾管離心超濾(5 000 r/min,10 min)，除去游離藥物，PBS緩沖液重懸，即得內(nèi)部負(fù)載有MnAs共沉淀的脂質(zhì)體(Liposome/MnAs)。

2.2 Liposome/MnAs的表征

2.2.1 粒徑與Zeta電位 使用動(dòng)態(tài)光散射激光粒度儀對(duì)Liposome/MnAs的粒徑、多分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表1。空白脂質(zhì)體Liposome的粒徑為(196.7±1.75)nm，PDI為0.23±0.03；載藥后的Liposome/MnAs粒徑增大，為(286.43±6.41)nm，PDI為0.3±0.02；Zeta電位載藥前為(-1.81±0.96)mV，載藥后Liposome/MnAs的電位顯著下降至(-14.03±2.03)mV，這可能是引入陰離子脂質(zhì)DOPA疏水性修飾MnAs共沉淀，導(dǎo)致Liposome/MnAs穩(wěn)定性提高，進(jìn)而負(fù)電性進(jìn)一步降低。

表1 Liposome/MnAs及空白載體Liposome的粒徑、PDI和Zeta電位

2.2.2 外觀形態(tài) 取適量的Liposome/MnAs以PBS緩沖液稀釋，滴加至超薄碳支持膜銅網(wǎng)上，靜置后濾紙吸去液體。滴加2%的磷鎢酸溶液進(jìn)行染色，濾紙吸去液體，進(jìn)行TEM掃描。Liposome/MnAs呈現(xiàn)規(guī)整的圓球狀，粒徑為250 nm左右，與粒徑測(cè)量結(jié)果基本吻合(圖2)。

圖2 Liposome/MnAs的TEM圖

2.2.3 載藥量和包封率 經(jīng)30 kDa超濾管離心超濾(5 000 r/min,10 min)除去游離藥物的Liposome/MnAs，取0.2 mL，先后加入濃硝酸溶液、30%過氧化氫溶液以及濃鹽酸溶液，加熱消解完全除去有機(jī)物。以超純水稀釋消解液至5 mL后過0.45 μm濾膜。另取MnAs共沉淀溶液0.25 mL，按相同方法加熱消解處理。

設(shè)定ICP-MS儀器測(cè)試參數(shù)：射頻功率1 150 W，等離子體體積流量13 L/min，輔助氣體積流量0.7 L/min，霧化氣體積流量0.9 L/min。根據(jù)以下公式計(jì)算As包封率(Encapsulation efficiency，EE)及載藥量(Loading efficiency，LE)分別為(48.32±5.95)%和(1.47±0.18)%。

We表示除去游離藥物的包封于脂質(zhì)體內(nèi)的藥物量；Wm表示總投藥量；Wt表示載藥脂質(zhì)體的總質(zhì)量。

2.3 Liposome/MnAs的體外pH響應(yīng)性釋放及MRI成像研究

使用pH值為7.4的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)以及pH值為5.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為釋放介質(zhì)，考察Liposome/MnAs中As3+的釋放特性。吸取Liposome/MnAs 0.7 mL，置于預(yù)先處理過的透析袋內(nèi)，檢漏后擠出氣泡，以透析袋夾夾緊，置于100 mL釋放介質(zhì)中，于(37.0±0.5)℃恒溫水浴振蕩(150 r/min)，分別于0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h取樣0.35 mL，并立即加入相同體積相同溫度的相同新鮮釋放介質(zhì)。樣品加入2%硝酸溶液稀釋至5 mL，放置過夜，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液以ICP-MS測(cè)定其中As3+的含量，計(jì)算累積釋藥率，并繪制釋藥曲線。

為進(jìn)一步考察Liposome/MnAs在酸性條件下的MRI成像能力，使用pH值為5.4的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液為溶解介質(zhì)，考察含有不同濃度Mn的Liposome/MnAs在pH5.4條件下的MRI成像能力。吸取Liposome/MnAs 0.1 mL，加入pH5.4的緩沖液0.4 mL混合均勻，于(37±0.5)℃下孵育0、4 h，進(jìn)行體外MRI檢測(cè)。

Liposome/MnAs在不同pH值條件下的釋藥曲線如圖3所示。Liposome/MnAs在pH7.4條件下釋放較為緩慢，24 h后累計(jì)釋藥率為(19.58±5.43)%；而Liposome/MnAs在pH5.4條件下初始釋放速度較快，2 h時(shí)即有(62.31±4.89)%的累計(jì)釋藥率，具備明顯的pH敏感性，而后逐漸趨于平緩，24 h的釋放率為(88.24±5.96)%。Liposome/MnAs在pH5.4下不同時(shí)間、濃度的體外MRI成像能力如圖4所示，體外MRI成像能力呈現(xiàn)濃度依賴性，Mn2+濃度越高，T1成像效果越好，圖像越亮；且進(jìn)一步證明在弱酸性環(huán)境下，兩者可以有效釋放。

圖3 Liposome/MnAs在不同pH值釋放介質(zhì)總體外釋藥曲線

圖4 Liposome/MnAs在pH5.4下不同時(shí)間及濃度的體外MRI成像能力

2.4 Liposome/C6的細(xì)胞攝取及分布

采用親脂性染料香豆素6(Coumarin 6，C6)替代MnAs共沉淀進(jìn)行包載，對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行標(biāo)記，制備得Liposome/C6。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GL261細(xì)胞接種于含蓋蓋玻片的12孔板中，數(shù)量為2×105mL-1，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)12 h后，吸除培養(yǎng)基，加入以無血清培養(yǎng)基配制稀釋的Liposome/C6(香豆素6濃度為1 μg/mL)。37 ℃，5%CO2培養(yǎng)12 h后，吸除含藥培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌2次。加入4%多聚甲醛溶液0.5 mL固定10 min，吸除固定液，PBS緩沖液洗滌2次。DAPI染液室溫染色10 min，吸除DAPI染液，PBS緩沖液洗滌2次。取出蓋玻片置于載玻片上，滴加少量PBS緩沖液防止干燥，共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果如圖5所示，GL261細(xì)胞對(duì)C6標(biāo)記的脂質(zhì)體有較好的攝取趨勢(shì)，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)部分，為進(jìn)一步藥效發(fā)揮奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察GL261細(xì)胞對(duì)香豆素6標(biāo)記載體的攝取及胞內(nèi)分布

2.5 Liposome/MnAs體外毒性評(píng)價(jià)

選擇鼠源性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261，采用MTT法考察游離ATO及Liposome/MnAs的體外毒性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GL261細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸至5×103個(gè)/孔接種于96孔板，24 h后，吸除培養(yǎng)基，加入以無血清培養(yǎng)基配制稀釋的含有不同摩爾濃度(0.2、0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50 μmol/L)的ATO溶液或Liposome/MnAs的含藥培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸除含藥培養(yǎng)基，加入0.1 mL含MTT(0.5 mg/mL)的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)4 h。吸除含有MTT的培養(yǎng)基，每孔加入0.1 mL DMSO，37 ℃恒溫?fù)u床振搖10 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)在490 nm處的吸光度(A)值，按公式計(jì)算：細(xì)胞存活率=(A給藥-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100%，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

采用Annexin V-FITC/PI試劑盒考察游離ATO及Liposome/MnAs對(duì)GL261細(xì)胞的凋亡作用。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GL261細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸至3×105個(gè)/孔接種于12孔板，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)12 h后，吸除培養(yǎng)基，加入以無血清培養(yǎng)基配制稀釋的游離ATO溶液及Liposome/MnAs(As3+濃度為6.25 μmol/L)的含藥培養(yǎng)基，不加藥物處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照。37 ℃，5%CO2培養(yǎng)12 h后，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次，使用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，離心棄去上清液后加入Binding Buffer 0.5 mL重懸細(xì)胞，300目尼龍篩網(wǎng)過濾細(xì)胞除去細(xì)胞團(tuán)塊，加入5 μL Annexin V-FITC染液和5 μL PI染液輕輕混合均勻，室溫避光孵育10 min，流式上樣檢測(cè)，使用Kaluza軟件對(duì)凋亡檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

細(xì)胞毒性結(jié)果如圖6所示，隨著游離ATO及Liposome/MnAs濃度的增加，GL261細(xì)胞的存活率降低，并且呈現(xiàn)一定的細(xì)胞毒性濃度依賴性。根據(jù)給藥濃度及細(xì)胞存活率計(jì)算IC50值，結(jié)果如表2所示，ATO及Liposome/MnAs對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞GL261均有良好的抑制作用，游離ATO處理GL261的IC50值為4.74 μmol/L，制備為L(zhǎng)iposome/MnAs后，IC50值下降為2.99 μmol/L。表明經(jīng)脂質(zhì)體包載后，IC50值更低，具有更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞活力的能力。

圖6 ATO溶液及Liposome/MnAs對(duì)GL261細(xì)胞的細(xì)胞毒性考察

表2 ATO及Liposome/MnAs對(duì)GL261細(xì)胞的IC50值

細(xì)胞凋亡結(jié)果如圖7所示，以游離ATO溶液及Liposome/MnAs(As3+濃度為6.25 μmol/L)作用于GL261細(xì)胞12 h，2組藥物均表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)GL261細(xì)胞凋亡的作用，Liposome/MnAs與游離ATO溶液相比，促細(xì)胞凋亡率由13.73%上升至21.42%，晚期細(xì)胞凋亡比例明顯上升。表明經(jīng)脂質(zhì)體包載后，Liposome/MnAs的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)可促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)ATO的攝取，具有更強(qiáng)的促進(jìn)GL261細(xì)胞凋亡的能力。

圖7 ATO溶液及Liposome/MnAs對(duì)GL261細(xì)胞的促凋亡作用考察

2.6 Liposome/MnAs的體內(nèi)安全性考察

建立原位腦膠質(zhì)瘤模型，考察正常給藥周期內(nèi)Liposome/MnAs的體內(nèi)安全性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GL261細(xì)胞，PBS緩沖液重懸分散。C57BL/6小鼠腹腔注射1%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，以小動(dòng)物腦立體定位儀固定。使用75%酒精對(duì)小鼠頭部進(jìn)行消毒，沿內(nèi)眥連線與頭部矢狀中線交匯處縱向切口，棉棒蘸取少量3%H2O2破壞頭骨表面組織，分離暴露顱骨。剝離骨膜，暴露前囟，于前囟后方1.5 mm，右側(cè)2 mm處定位進(jìn)針部位，骨鉆打孔。微量注射器吸取GL261細(xì)胞懸液(每5 μL 5×104個(gè))，進(jìn)針深度3 mm，緩慢注射5 min，待細(xì)胞懸液完全注射進(jìn)入小鼠腦內(nèi)后，停留5 min，緩慢拔出注射器后以醫(yī)用縫合線縫合頭皮。

造模8 d后對(duì)小鼠稱質(zhì)量，按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組，每組3只，分別為生理鹽水組(Saline)、游離ATO組(ATO)及Liposome/MnAs組。其中ATO給藥劑量均為1.5 mg/kg。尾靜脈注射給藥，每10 g給藥0.1 mL，將給藥的第1天作為d0，每2 d給藥1次，共給藥5次。末次給藥24 h后，小鼠脫頸椎處死，解剖分離主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)，于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋切片，HE染色進(jìn)行安全性分析。

荷瘤小鼠心、肝、脾、肺及腎臟的形態(tài)學(xué)變化如圖8所示，同Saline組相比，在給藥周期內(nèi)ATO與Liposome/MnAs組荷瘤小鼠的主要器官?zèng)]有發(fā)現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化或腫大等變化，說明在該ATO濃度下，游離ATO與Liposome/MnAs具有一定的安全性。

圖8 Liposome/MnAs對(duì)荷瘤小鼠主要臟器安全性考察

3 討論

由于ATO在水溶液中的存在形式為無機(jī)的HAsO32-，常規(guī)的負(fù)載方式如脂質(zhì)體及膠束等難以通過疏水作用或共價(jià)鍵間的作用力進(jìn)行有效負(fù)載，進(jìn)而獲得良好的包封率及載藥量。為改善ATO無機(jī)溶液低靶向性帶來的毒副作用，研究者們嘗試了多種方式，如利用離子梯度法制備脂質(zhì)體[17]，將ATO改性為有機(jī)砷膠束[24]，利用介孔二氧化硅制備純無機(jī)納米制劑等等[20,25]，一定程度上增強(qiáng)了ATO的靶向性，進(jìn)而提高了治療實(shí)體瘤的效果。本研究采用可制備出納米尺寸無機(jī)沉淀的反相微乳法[26-27]，選擇具有MRI成像能力的Mn與ATO進(jìn)行反應(yīng)生成水不溶性的MnAs共沉淀，進(jìn)一步疏水性修飾，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ATO的穩(wěn)定包載。Liposome/MnAs具有顯著的pH敏感性，在低pH條件下的釋藥速度顯著增加，具有酸性腫瘤微環(huán)境下響應(yīng)釋放的能力。在酸性pH條件下釋藥后，游離的Mn2+發(fā)揮了MRI成像作用，具有治療及診斷一體化的潛力。Liposome/MnAs相較于游離ATO，對(duì)GL261細(xì)胞顯示出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的能力。此外在一定周期的體內(nèi)給藥后，小鼠的主要臟器無明顯毒性病變，Liposome/MnAs具有一定的安全性。

中藥礦物藥在近年的研究中被發(fā)現(xiàn)具有良好的藥理活性，如砒霜(ATO)、磁石(Fe3O4)及自然銅(FeS2)等。由于這類藥物為無機(jī)物，水溶性佳但脂溶性差、半衰期短、生物利用度不高，在制劑過程中存在難以包載及易泄漏的缺陷。目前臨床使用的ATO的制劑為亞砷酸鈉注射劑，主要用于APL的治療，較短的半衰期及低靶向性限制了其在實(shí)體瘤治療上的應(yīng)用發(fā)展。本研究構(gòu)建的pH敏感型脂質(zhì)體，可有效克服ATO脂溶性差以及半衰期短的缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了“靶區(qū)響應(yīng)釋藥”，為ATO一類半衰期短且治療窗口窄的有毒抗腫瘤礦物藥的遞送系統(tǒng)設(shè)計(jì)提供了參考。