吳茱萸堿聯(lián)合自噬抑制劑氯喹抗肝癌作用的研究

沈星星,時樂，姚亮宇，牛玉珍,梁濤

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院,江蘇 南京 210023；2.南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

吳茱萸堿(EVO)是從中藥吳茱萸中提取的天然生物堿，除具有較強的抗炎、鎮(zhèn)痛作用外，還有抗腫瘤的作用[1]。有研究發(fā)現(xiàn)EVO在人結(jié)腸癌[2]和人胃癌細胞[3]中能誘導自噬并抑制腫瘤，而在小細胞肺癌中能誘導自噬并對腫瘤有保護作用[4]，推測EVO對不同的腫瘤自噬效果不同。氯喹(CQ)是預防和治療瘧疾的常用藥，最近研究表明，CQ能通過抑制自噬和增強人體免疫力，發(fā)揮抗腫瘤作用。越來越多證據(jù)表明，抗腫瘤藥物與CQ聯(lián)合使用能起到協(xié)同作用，增強抑制腫瘤的能力。肝細胞癌是世界范圍內(nèi)最常見的血管實體瘤之一,具有血管浸潤的特性，而自噬對腫瘤的發(fā)展和血管的生成作用之間的相關性是近年來研究的熱點[5-7]。目前,已有研究證明EVO在人肝細胞癌HCC中可以降低VEGFA的轉(zhuǎn)錄活性,抑制血管生成,發(fā)揮抗肝癌的作用[8]。但EVO對肝癌細胞的自噬作用還未見報道，EVO聯(lián)合CQ對肝癌細胞的活性和血管生成能力的作用也有待探討。

1 材料

1.1 細胞與試劑

人肝癌細胞HepG2購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)來自南京中醫(yī)藥大學袁東平課題組。EVO標準品(HPLC≥98%)，貨號:B21315,上海源葉生物科技有限公司，用DMSO溶解并稀釋至1.25、2.5、5、10、20、40、80 mmol/L作為母液；CQ，美國SIGAM公司，貨號：c6628-25G，用純水溶解并稀釋至25 mmol/L作為母液；VEGFA ELISA試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清,美國Gibco公司；青鏈霉素混合液，貨號：P1400，索萊寶科技有限公司；細胞自噬染色檢測試劑盒(MDC法)，貨號：G0170,索萊寶科技有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒，貨號：P0012,碧云天生物科技研究所；CCK8,貨號:C0038,碧云天生物科技研究所；Matrigel，貨號：356234，美國BD公司；抗熒光淬滅封片，貨號：P0126-25 mL，碧云天生物科技研究所；LC3抗體，貨號：14600-1-AF，美國Proteintech公司；VEGFA抗體，貨號：66828-1-Ig，美國Proteintech公司；P62抗體，貨號：18420-1-AP，美國Proteintech公司；二抗經(jīng)辣根過氧化物酶HRP標記過的羊抗兔或羊抗小鼠IgG(H+L)，貨號：SA00001-2,美國Proteintech公司；SDS-PAGE快速凝膠速配試劑盒，貨號：P0012AC,碧云天生物科技研究所；磷酸酶抑制劑混合液，貨號：KGP602，凱基生物有限公司。

1.2 儀器

恒溫二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，美國STIK公司；倒置熒光顯微鏡，德國Leica公司；垂直電泳槽，美國Bio-Rad公司；凝膠掃描成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；Infinite M200 Pro酶標儀，瑞士TECAN公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HepG2細胞和HUVEC細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中進行常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的HepG2、HUVEC細胞，調(diào)整細胞密度,根據(jù)實驗要求接種于96或6孔板中，待細胞完全貼壁后加入不同藥物進行處理。

2.2 CCK8法檢測

2.2.1 不同濃度EVO對HepG2細胞活性的影響 取對數(shù)生長期HepG2細胞，調(diào)整細胞密度為5 000 mL-1接種于96孔板，每孔100 μL置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入不同濃度的EVO培養(yǎng)12、24、48 h，濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L，每組10個復孔，分別在12、24、48 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標儀(波長450 nm)記錄每孔的吸光度(A)。細胞存活率=A實驗組/A空白對照組×100%。

2.2.2 EVO聯(lián)合CQ對HepG2細胞活性的影響 根據(jù)前期研究及參考文獻[8-9]，將細胞分為空白對照組、EVO組(10 μmol/L)、CQ組(25 μmol/L)、EVO+CQ組(10 μmol/L+25 μmol/L)，每組10個復孔，作用24 h后檢測細胞活性。

2.3 Western blot檢測

取對數(shù)生長期細胞，接種于6孔板，每孔2×105個細胞，加入不同濃度(0、5、10 μmol/L)的EVO，每組3個復孔，培養(yǎng)24 h后提取蛋白，BCA法進行蛋白定量，參考文獻電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉，用LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、VEGFA抗體孵育，以GAPDH為內(nèi)參，用Image J圖像分析軟件進行掃描分析。

2.4 MDC染色

取對數(shù)生長期HepG2細胞，接種于6孔板，每孔2×105個細胞，細胞分組及處理方法見2.2.2，24 h后參考細胞自噬染色檢測試劑盒(MDC法)說明書染色，于倒置熒光顯微鏡(激發(fā)濾光片波長355 nm，阻斷濾光片波長512 nm)下觀察各組細胞染色情況。

2.5 ELISA檢測

取對數(shù)生長期HepG2細胞調(diào)整至合適細胞密度接種于48孔板中，分組和處理同2.2.2,每組10個復孔，培養(yǎng)24 h后，提取各孔細胞培養(yǎng)上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測VEGFA的表達水平。

2.6 細胞侵襲實驗

HepG2細胞，分組同2.2.2,無血清培養(yǎng)液培育24 h后取其上清液作為HUVECs的條件培養(yǎng)基，將HUVECs分為空白對照組、EVO組、CQ組、EVO+CQ組。取對數(shù)生長期的HUVECs調(diào)整密度為2×105mL-1，接種到Transwell小室并加入上述各組條件培養(yǎng)基，下室加全培養(yǎng)液，之后常規(guī)條件下培養(yǎng)48 h。用PBS洗小室1～2次，風干后，放入約200 μL免疫熒光固定液中，室溫固定30 min后風干，再將小室放入預裝500 μL結(jié)晶紫染色液的孔中，室溫染色30 min。染色結(jié)束后用純水沖洗浸泡數(shù)次，直到洗液顏色清澈，風干。顯微鏡下隨機取9個視野計數(shù)并統(tǒng)計。

2.7 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 不同濃度的EVO對HepG2細胞的影響

由表1可知不同濃度的EVO處理HepG2細胞12 h后對HepG2細胞增殖無明顯抑制作用。當作用24、48 h后，EVO對HepG2細胞增殖有顯著的抑制作用(P<0.01)，其中處理24 h時，EVO對HepG2的抑制作用呈濃度依賴性。同時選擇抑制作用適中的5、10 μmol/L，進行后續(xù)實驗。

表1 EVO對HepG2細胞活性的影響

3.2 EVO對HepG2細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62、VEGFA蛋白表達的影響

由圖1可知，HepG2細胞經(jīng)5、10 μmol/L的EVO作用24 h后，自噬相關蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達增加，P62蛋白的表達降低，說明EVO能增加HepG2細胞的自噬水平，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)。同時與空白對照組相比,EVO(10 μmol/L)組血管生成相關蛋白VEGFA的表達顯著下降(P<0.01)。

注：與空白對照組相比,*P<0.05，**P<0.01。

3.3 EVO聯(lián)合CQ對HepG2細胞活性的影響

如表2所示，與空白對照組相比，EVO組和CQ組能顯著抑制HepG2細胞活性(P<0.01)；與EVO相比，EVO+CQ組對HepG2細胞活性的抑制作用更為顯著(P<0.01)。

表2 EVO聯(lián)合自噬抑制劑CQ對HepG2細胞活性的影響

3.4 EVO聯(lián)合CQ對HepG2細胞自噬的影響

MDC染色結(jié)果如圖2所示，與空白對照組相比，EVO組細胞內(nèi)綠色熒光信號顯著增強，提示細胞內(nèi)有大量自噬小體聚集，自噬被增強。與EVO組相比，EVO+CQ組細胞內(nèi)綠色熒光信號大面積增強，提示LC3自噬小體聚集增多。

圖2 MDC法檢測EVO聯(lián)合CQ對HepG2細胞自噬的影響

3.5 EVO聯(lián)合CQ對HepG2細胞VEGFA表達水平的影響

由圖3可知，與空白對照組相比，EVO組及EVO+CQ組的VEGFA表達水平明顯下降(P<0.05,P<0.01)。與EVO組相比，EVO+CQ組VEGFA的表達水平顯著下降(P<0.05)。

注：與空白對照組相比,**P<0.01，*P<0.05；與EVO組相比,圖3 EVO對HepG2細胞VEGFA表達水平的影響

3.6 EVO的條件培養(yǎng)液對HUVEC細胞侵襲能力的影響

由圖4可知，與空白對照組相比，EVO組和EVO+CQ組細胞侵襲能力顯著下降(P<0.01)。與EVO組相比，EVO+CQ組抑制細胞侵襲能力的作用更為顯著(P<0.01)。

注：與空白對照組相比,**P<0.01;與EVO組相比,##P<0.01。

4 討論

肝細胞癌是一種以新血管生成為特征的惡性腫瘤，是肝癌中最常見的病理類型，其復發(fā)率高，預后多不良，目前臨床上仍然沒有較好的治療方法[10]。有研究表明，肝細胞癌中VEGFA的表達水平直接影響其新血管生成能力[11]，VEGFA的高表達能促進肝癌的進展，降低患者的存活率[12]，所以抗血管生成療法在治療肝細胞癌中得到廣泛的應用。有證據(jù)表明，靶向血管生成的藥物可能會影響腫瘤的自噬途徑[13]，而自噬在腫瘤微環(huán)境中的作用和對血管生成的影響是目前關注的焦點[5-6]，已有研究發(fā)現(xiàn)，當抗血管生成的藥物與自噬抑制藥物聯(lián)合使用時能更有效地抑制腫瘤的進展[9,14]。目前EVO通過抑制血管生成發(fā)揮抗肝癌的作用效果已得到證明[8]，但其在肝癌細胞中的自噬作用及聯(lián)合自噬抑制劑對肝癌細胞的影響還有待進一步研究，因此本文就EVO及EVO+CQ對HepG2細胞的活性、自噬水平和血管生成情況等進行初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EVO能有效抑制HepG2細胞的活性，提高HepG2細胞自噬水平，降低VEGFA的表達水平。當EVO與自噬抑制劑CQ聯(lián)合使用時，其抑制HepG2活性能力增強，自噬小體明顯增多并能顯著降低HepG2細胞VEGFA的表達水平和HUVECs細胞的侵襲能力。這表明EVO與CQ聯(lián)合使用能增強其抗肝癌和抑制血管生成作用，但其中具體作用機制還有待進一步探究。