黃芪甲苷通過NLPR3炎性小體調(diào)節(jié)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化早期大鼠血脂及炎癥因子的研究

葛凡，王文愷，朱景天，李子航，孫悅，薛梅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210023)

糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化是由于機(jī)體胰島素分泌不足或胰島素抵抗引起的糖脂代謝紊亂和炎性因子大量釋放，最終導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的出現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化形成[1]，是糖尿病患者死亡的主要原因。動(dòng)脈粥樣硬化是多步驟過程的結(jié)果，脂質(zhì)代謝的改變是其危險(xiǎn)因素和特征。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖水平升高、血脂異常以及伴隨疾病發(fā)展的其他代謝改變幾乎存在于動(dòng)脈粥樣硬化的全過程。膽固醇是眾所周知的引起冠狀動(dòng)脈病變的危險(xiǎn)因素，有研究表明[2]，高脂肪/高膽固醇飲食會(huì)加重動(dòng)脈炎癥和氧化應(yīng)激，并損害內(nèi)皮功能。GK大鼠被喂食高脂飼料后，被證實(shí)發(fā)生類似于糖尿病患者早期動(dòng)脈粥樣硬化的病變，其特征是血管壁脂質(zhì)過度積聚[3-4]。此外，慢性炎癥被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的關(guān)鍵因素之一[5]，也被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病之間的可能聯(lián)系之一。NLRP3炎性小體是目前最具特征的炎性小體[6-7]，由NOD樣受體NLRP3，銜接子ASC和Caspase-1組成，抑制其表達(dá)，能有效減少斑塊的形成，促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定性并改善血管功能[8]。

黃芪甲苷是黃芪的提取物，可通過減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少炎癥，調(diào)節(jié)代謝異常，從而改善脂質(zhì)蓄積并減少血管內(nèi)皮功能損害[9]，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等常見心血管疾病有一定的預(yù)防和保護(hù)作用[10]。本課題組已證實(shí)[2,11-13]，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可影響糖尿病GK大鼠動(dòng)脈粥樣硬化早期脂質(zhì)代謝，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)血管中脂質(zhì)代謝基因Mcp1、Scd1、Fas、Icam1、Cd36有關(guān)；同時(shí)，黃芪甲苷是當(dāng)歸補(bǔ)血湯吸收入血的7種活性成分之一。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸補(bǔ)血湯可通過改善糖尿病大鼠炎癥因子水平，實(shí)現(xiàn)對(duì)其的正向調(diào)控作用。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯主要活性成分黃芪甲苷通過NLPR3炎性小體調(diào)節(jié)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化早期大鼠血脂及炎癥因子的作用機(jī)制，為闡明當(dāng)歸補(bǔ)血湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，擴(kuò)大其臨床應(yīng)用奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)GK大鼠48只，Wistar大鼠12只，體質(zhì)量250～300 g，均為雄性，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。動(dòng)物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)屏障環(huán)境中，自由攝食、飲水。環(huán)境溫度為(20±2)℃，環(huán)境濕度為(50±5)%，12 h/12 h晝夜模式，每天7:00-19:00保持光照。動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)通過南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：202006A028)。

1.2 藥材及試劑

黃芪甲苷，購自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：C17J11Q115731；格列喹酮片，購自北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1191263；鹽酸貝那普利片，購自北京諾華制藥有限公司，批號(hào)：X3059；戊巴比妥鈉，購自德國Merck公司；羧甲基纖維素鈉，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高脂飼料，購自協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司；血糖試紙，購自長沙三諾生物傳感股份有限公司；IL-6、IL-10、CRP、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒，均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Caspase-1/P20/P10抗體，購自美國Proteintech Group公司；NLRP3抗體、ASC抗體，購自美國Affinity Biosciences公司。

1.3 主要儀器

JA31002型電子精密天平，購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；GA-3型血糖儀，購自長沙三諾生物傳感股份有限公司；CL-7200全自動(dòng)生化分析儀，購自日本島津公司；GO1510型酶標(biāo)儀，購自美國賽默飛世爾科技有限公司；DMIL倒置生物顯微鏡，購自德國Leica公司。

1.4 動(dòng)物造模及給藥

將48只GK大鼠隨機(jī)分為模型組，陽性藥(格列喹酮片聯(lián)合鹽酸貝那普利片)組，黃芪甲苷低、高劑量組，每組12只，均給予高脂飼料誘導(dǎo)早期動(dòng)脈粥樣硬化。12只Wistar大鼠作為空白對(duì)照組，給予標(biāo)準(zhǔn)鼠糧。給藥組分別灌胃格列喹酮片(10 mg/kg)及鹽酸貝那普利片(10 mg/kg)，黃芪甲苷(20、40 mg/kg，以0.5%羧甲基纖維素鈉助溶配制成混懸液，終濃度為10 mg/mL)，灌胃體積為10 mL/kg，對(duì)照組及模型組灌胃等量生理鹽水，每日1次，連續(xù)6周。

1.5 體質(zhì)量、空腹血糖測(cè)定

在造模和給藥期間，全程監(jiān)控大鼠體質(zhì)量及血糖，每隔7 d稱體質(zhì)量，記錄并繪制曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食12 h，用血糖儀測(cè)定空腹血糖。

1.6 生化法測(cè)定大鼠血清TC、TG、HDL及LDL的含量

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將動(dòng)物禁食12 h，用戊巴比妥鈉麻醉并腹主動(dòng)脈采血。樣品1 500×g，4 ℃，離心10 min，得到上層血清，-80 ℃冷凍備用。使用自動(dòng)分析儀測(cè)定血清中TC、TG、HDL、LDL的含量。

1.7 大鼠腹主動(dòng)脈病理學(xué)觀察

取大鼠腹主動(dòng)脈，稱質(zhì)量，并將其固定在10%緩沖福爾馬林中。常規(guī)方法對(duì)腹主動(dòng)脈進(jìn)行病理檢查，并用蘇木精-伊紅(HE)染色。進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)估，包括確定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積。

1.8 ELISA法測(cè)定大鼠腹主動(dòng)脈IL-6、IL-10、CRP、TNF-α的含量

采用ELISA法測(cè)定大鼠腹主動(dòng)脈中IL-6、IL-10、CRP、TNF-α的含量，按試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.9 Western blot法檢測(cè)大鼠腹主動(dòng)脈NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表達(dá)情況

將大鼠腹主動(dòng)脈稱質(zhì)量后，加入RIPA蛋白裂解液勻漿，12 000×g，4 ℃，離心15 min，取上清，測(cè)定蛋白濃度后加蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱變性，-80 ℃?zhèn)溆?。根?jù)NLRP3、ASC、Caspase-1的分子量，選擇不同濃度制膠，電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，用一抗封閉緩沖液(5%BSA)室溫?fù)u床封閉1 h，分別置入加有NLRP3、ASC、Caspase-1抗體稀釋液的抗體盒中，4 ℃孵育過夜。次日TBST漂洗3次，加入二抗溶液(羊抗兔二抗)室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，ECL顯色曝光。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行半定量計(jì)算用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠體質(zhì)量、空腹血糖的影響

與對(duì)照組相比，模型組、陽性藥組、黃芪甲苷低劑量和高劑量組大鼠體質(zhì)量增加無顯著差異。與對(duì)照組相比，模型組大鼠空腹血糖顯著升高(P<0.000 1)；與模型組相比，陽性藥組及黃芪甲苷組大鼠血糖均顯著降低(P<0.05～0.000 1)，見圖1。

注:與對(duì)照組比較，####P<0.000 1;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，****P<0.000 1。圖1 黃芪甲苷對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠體質(zhì)量、空腹血糖的影響

2.2 黃芪甲苷對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血清TC、TG、HDL及LDL含量的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清TC、TG、LDL水平顯著升高，HDL水平顯著降低(P<0.001～0.000 1)；與模型組相比，陽性藥組及黃芪甲苷組大鼠血清TC、TG、LDL水平顯著降低，HDL水平顯著升高(P<0.05～0.000 1)，見圖2。

注:與對(duì)照組比較，###P<0.001，####P<0.000 1;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1。

2.3 黃芪甲苷對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠腹主動(dòng)脈病理形態(tài)的影響

對(duì)照組大鼠未見血栓形成斑塊，各主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑完整。而模型組大鼠出現(xiàn)外膜出血，大量泡沫細(xì)胞聚集，導(dǎo)致內(nèi)膜增厚，平滑肌細(xì)胞增生，形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。陽性藥及黃芪甲苷組大鼠主動(dòng)脈外觀正常，見圖3。

圖3 黃芪甲苷對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠腹主動(dòng)脈病理形態(tài)的影響

2.4 黃芪甲苷對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠腹主動(dòng)脈IL-6、IL-10、CRP、TNF-α含量的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠動(dòng)脈組織中IL-6、CRP、TNF-α水平顯著升高，IL-10水平顯著降低(P<0.000 1)；與模型組相比，陽性藥組及黃芪甲苷組大鼠IL-6、CRP、TNF-α水平均顯著降低，IL-10水平顯著升高(P<0.01～0.000 1)，見圖4。

注:與對(duì)照組比較，####P<0.000 1;與模型組比較，***P<0.001，****P<0.000 1。

2.5 黃芪甲苷對(duì)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化大鼠腹主動(dòng)脈NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001～0.000 1)；與模型組相比，陽性藥和黃芪甲苷的干預(yù)顯著下調(diào)了大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表達(dá)水平(P<0.01～0.000 1)，見圖5。

注：與對(duì)照組比較，###P<0.001，####P<0.000 1;與模型組比較，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1。

3 討論

眾所周知，格列喹酮是臨床常用降糖藥，鹽酸貝那普利對(duì)降低患者血脂水平和機(jī)體炎性反應(yīng)有顯著療效[14-15]，因此實(shí)驗(yàn)選擇二者聯(lián)合作為陽性藥。血脂是糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素，巨噬細(xì)胞中膽固醇酯的積累是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的關(guān)鍵步驟。本研究中，黃芪甲苷可明顯改善大鼠動(dòng)脈損傷，調(diào)節(jié)異常升高或降低的血脂水平，發(fā)揮與鹽酸貝那普利類似的功效，提示黃芪甲苷可通過減少脂質(zhì)積聚，緩解糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化。慢性炎癥是動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病共同的已知特征。在2型糖尿病患者中，炎癥小體活性增加，NLRP3水平升高，促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-18等水平升高[5]。本研究中，黃芪甲苷可明顯降低IL-6、CRP、TNF-α的水平，升高IL-10的水平。IL-6和IL-10可作為較好的抗炎生物標(biāo)志物，用于慢性炎癥性疾病的治療；CRP是一種急性炎癥蛋白，在感染或炎癥部位會(huì)增加至1 000倍[16]，可作為炎癥的衡量指標(biāo)；TNF-α作為最重要的促炎細(xì)胞因子之一，可以促進(jìn)炎癥部位的氧化應(yīng)激，在炎癥、細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中對(duì)免疫系統(tǒng)起著重要作用[17]。Pedersen的實(shí)驗(yàn)證實(shí)[18]，在糖尿病結(jié)合高脂飲食大鼠模型中，IL-6、CRP、TNF-α水平升高，IL-10水平降低，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。表明黃芪甲苷可通過調(diào)控炎癥因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化早期大鼠血脂及炎癥因子水平。NLRP3炎性小體是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過NOD樣受體NLRP3對(duì)有害信號(hào)PAMPs、DAMPs作出反應(yīng)，招募適配蛋白ASC和pro-Caspase-1，從而通過自催化激活Caspase-1，以應(yīng)對(duì)微生物感染和細(xì)胞損傷[19]。最近的研究已經(jīng)證實(shí)，NLRP3炎性小體參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中的炎癥反應(yīng)，而NLRP3基因的沉默可延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[20]。本研究中，黃芪甲苷可顯著下調(diào)糖尿病大鼠NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白的表達(dá)，提示黃芪甲苷可通過調(diào)控NLPR3炎性小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，減輕糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化早期大鼠炎癥狀態(tài)，保護(hù)動(dòng)脈組織。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，黃芪甲苷可調(diào)節(jié)糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化早期大鼠的血脂及炎癥狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈組織的保護(hù)作用，機(jī)制與調(diào)控NLPR3炎性小體相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。本研究為闡明當(dāng)歸補(bǔ)血湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，擴(kuò)大其臨床應(yīng)用提供了重要依據(jù)。