基于化學蛋白組學發(fā)現(xiàn)天然產物作用靶點的方法探析

陳秀珍，嚴馨宇，喻程酈，張毅楠

(南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023)

中醫(yī)藥源自中華民族幾千年的健康養(yǎng)生理念及實踐經驗總結，其產生療效主要依靠天然原材料所含有的各種化學成分對有機體產生藥理作用[1]。從中醫(yī)藥和世界各民族傳統(tǒng)醫(yī)學出發(fā)，或者從隨著科學技術進步發(fā)現(xiàn)的新天然資源出發(fā)，天然產物及其衍生物為藥物研發(fā)提供了重要的資源，創(chuàng)制了許多不可或缺的藥物。與合成類雜環(huán)藥物相比，源于天然產物及衍生物的藥物在結構多樣性、活性獨特性等方面具有顯著優(yōu)勢[2-4]。天然藥物發(fā)現(xiàn)過程中，往往先發(fā)現(xiàn)它們的表型活性，遵循正向藥理學的研究途徑。與使用靶蛋白高通量篩選發(fā)現(xiàn)先導化合物，進而依次推進細胞、組織、動物、人體試驗的小分子合成藥物，具有顯然的區(qū)別。

現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)過程中，一般要明確藥物的具體作用靶蛋白，這有助于深入地闡明藥物的作用機制、識別潛在毒性、克服可能的耐藥機制。因此天然產物表型活性明確后，往往要通過不同手段發(fā)現(xiàn)其作用靶點，從而通過結構改造提高活性和規(guī)避各種毒副作用。與此同時，這個過程還有可能幫助發(fā)現(xiàn)疾病所對應的新作用靶點，是天然藥物開發(fā)應用的關鍵步驟[5-6]。

傳統(tǒng)的X射線晶體衍射、核磁共振技術僅可用于單一蛋白靶點的分析，對從諸如細胞等復雜生物系統(tǒng)中進行靶點分析往往需要借助質譜技術[7-8]。化學蛋白質組學是基于質譜的蛋白質組學的重要分支，包含多種用于捕獲并鑒定天然產物靶蛋白的方法?；诨钚缘牡鞍踪|組分析(Activity-based protein profiling，ABPP)在1999年被提出，最早被用于研究體內絲氨酸水解酶，隨后其潛在的藥物靶標鑒定功能被開發(fā)，并隨著親和探針合成技術的進步，親和探針化學蛋白組學成為鑒定天然產物作用靶點的主流方法[9]。探針的設計合成涉及對天然產物分子的修飾改造，這可能影響小分子的特異性和親和力，因此近年來一些基于蛋白質結構穩(wěn)定性的非修飾探針化學蛋白質組學(Modification-free chemoproteomics)應運而生[10]。本文將對這兩類主要的天然產物作用靶點發(fā)現(xiàn)方法進行綜述，詳細探討它們的原理、實驗流程、優(yōu)缺點和應用范圍，并探討化學蛋白質組學在天然產物靶點鑒定的可能發(fā)展方向。

1 基于親和探針的天然產物靶點發(fā)現(xiàn)方法

親和探針化學蛋白質組學融合了合成化學、細胞生物學和質譜分析等交叉方法，可用于全面捕獲小分子的多個靶標蛋白，它一般包含三個關鍵步驟：①親和探針的設計和合成；②目標蛋白捕獲與親和層析分離；③質譜技術鑒定作用靶點信息。目前已有多種不同類型的探針及靶蛋白捕獲方法被開發(fā)出來，用于捕獲和分離作用靶點。親和探針通常由母核結構(天然產物本身)、反應基團(包括光反應基團、親核反應基團等不同類型)、純化標簽和連接鏈等組成，根據探針所含結構單元的多寡和不同，我們對其進行分類總結(圖1)。

1.1 固定化探針

早期基于親和探針的化學蛋白組學研究，主要利用了待鑒定的天然活性分子與其作用靶點之間的高度特異性親和力。首先，將活性天然產物通過化學反應固定在具備生物相容性的固載基質上(如瓊脂細珠和瓊脂樹脂等)；然后將細胞或組織裂解液與固載基質共同孵育(使用瓊脂細珠時)，或使其層析通過固載基質(使用樹脂材料時)；再使用惰性溶劑洗脫多次，固載化的天然化合物作為誘餌親和吸附難以洗脫的相互作用蛋白；最后通過加熱或高離子強度溶劑洗脫吸附蛋白，使用定量蛋白質組學分析鑒定(圖2a)[11-13]。這種固定化探針技術具有合成簡單，可無差別地分析所有吸附蛋白質的優(yōu)勢，已被應用于多個著名化合物的作用靶點發(fā)現(xiàn)。比如：Schreiber等利用固定化探針技術發(fā)現(xiàn)了FK506和雷帕霉素共同的作用靶點FKBP12[14-15]；Tsukamoto等利用基于固定化探針的化學蛋白質組學方法發(fā)現(xiàn)中藥天然產物黃芩素(Baicalein)通過作用于SAR1B抑制腫瘤細胞自噬[16]；更為著名的例子是Handa等利用沙利度胺(Thalidomide)固定化探針，發(fā)現(xiàn)了Cereblon是其主要的結合蛋白，沙利度胺抑制以Cereblon為核心的E3泛素連接酶活性是其致畸的主要原因[17]。

基于固定化探針的化學蛋白質組學方法可以通過與SILAC和TMT等質譜標記技術連用，提高定量的準確性和通量[18-19]。但是固定化探針在純化真正的靶蛋白時，還可能富集到大量的非特異性結合蛋白以及與固載基質或連接鏈具有親和力的蛋白質[20]。這些缺點可通過優(yōu)化洗脫純化方法以及使用陰性對照探針排除，降低非靶蛋白或非特異性結合蛋白的影響[21-23]。例如Pyrcoumin是經典的Wnt信號抑制劑，Waldmann等為了確定其靶點，合成了固定化探針和陰性對照探針，通過比較2組富集蛋白的差異發(fā)現(xiàn)Pyrcoumin是dCTP焦磷酸酶1(DCTPP1)的競爭性抑制劑[22]。天然產物和固載基質之間連接鏈的長度也會影響親和探針與靶蛋白的結合力。使用較短的連接鏈時，空間位阻影響探針與靶蛋白的親和力，使得探針失去生理活性，因此短鏈連接鏈可用于設計陰性對照探針。Inoue等利用這一現(xiàn)象合成了含有不同長度連接基團的探針，并鑒定出Yaku'amide B的靶蛋白FoF1-ATP合成酶[23]。

注：棕色.母體天然產物結構；綠色.反應基團；紫色.光反應基團；黑色.連接鏈

雖然基于固定化親和探針的化學蛋白質組學方法已經能克服非特異性蛋白帶來的影響，但探針固定化后可能改變天然產物的親和力，影響其與靶蛋白的結合，丟失真實的作用靶標信息；同時，由于在提取蛋白的過程中有可能導致蛋白的三維結構、互作狀態(tài)的破壞而影響化合物結合，該方法只可運用于細胞或組織裂解液，無法運用于活細胞[10]。

1.2 基于活性的探針

基于活性的探針(Activity-based probe，ABP)是ABPP技術的核心，也是目前分析蛋白組中目標蛋白功能狀態(tài)和鑒定化合物作用靶點的有力工具[24-26]。相較于固定化探針，ABP探針無須提前固定于基質材料，可以直接運用于活細胞，反映在生理狀態(tài)下的藥物-靶標相互作用[12,27]。標準的ABP探針一般包含反應基團(包含親核或親電等反應中心)和報告基團，二者通過碳鏈或者聚乙二醇鏈進行連接，主要用來監(jiān)測目標蛋白活性。如果在需要尋靶的天然產物中加入反應基團(部分具備共價結合能力的天然產物自身也可攜帶反應基團)，可以組成尋靶的ABP探針，依靠天然產物與靶蛋白親和接近，然后反應基團與靶蛋白結合口袋附近的氨基酸殘基發(fā)生共價反應結合[28]。報告基團部分通常有示蹤標簽(如熒光素)、純化標簽(如生物素)等類別，根據它們不同的特性，可用于蛋白活性分析、標記示蹤或純化富集(圖2b)[29]。Sieber等利用ABP探針揭示Spongiolactone及其衍生物的抗腫瘤細胞增殖多個潛在靶標[30]；Bogyo等設計合成Salinipostin A的ABP探針并鑒定了它在惡性瘧原蟲中發(fā)揮生長作用的多個靶蛋白[31]。

圖2 基于親和探針的天然產物靶點發(fā)現(xiàn)方法

報告基團所包括的熒光素或生物素等標簽分子存在體積較大、溶解性差的問題，顯著降低了ABP探針透過細胞膜的能力[26,29]。為了解決這一問題，Cravatt等將點擊化學(Click chemistry)技術引入ABP探針設計，用惰性反應基團(如炔基、疊氮等)取代原來的報告基團，再通過后續(xù)化學反應連接報告基團標簽分子[32]。該類探針體積更小，細胞膜穿透力更強，可在完成共價反應后再破壞細胞，運用點擊化學反應(典型的如銅催化的末端炔烴與疊氮化物的1，3-偶極環(huán)加成反應)在細胞裂解液中連接報告基團[32-34]。除此之外，其他課題組還發(fā)展了基于大環(huán)張力炔烴、1,2,4,5-四嗪等具有細胞兼容性的點擊化學反應，可直接運用于活細胞，有效避免破壞細胞后帶來的靶蛋白丟失等缺點，極大地拓展了ABP探針技術的應用[26,29,35-36]。天然產物蓽茇酰胺(Piperlongumine)是一種分離于胡椒科植物蓽茇Piperlongum根部的生物堿類化合物[25]，對腫瘤細胞具有選擇性殺傷作用。張志遠等通過點擊化學方法的ABPP技術進行了靶點的鑒定，發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺通過共價結合抑制GST01蛋白的活性，來達到特異性殺傷癌細胞的作用，并且確認GST01有可能作為治療腫瘤的聯(lián)合用藥靶點。

為了提升定量的準確性，Cravatt將穩(wěn)定同位素標記技術引入ABPP方法，開發(fā)了ABPP-SILAC技術[37]，王初等利用ABPP-SILAC技術找到了中藥化合物黃芩苷(Baicalin)降脂作用的主要靶點CPT1A[38]。而后Cravatt又在ABPP、串聯(lián)正交水解技術(Tandem orthogonal proteolysis,TOP)以及穩(wěn)定同位素標記定量蛋白質組學技術的基礎上建立了isoTOP-ABPP方法，該方法既可用于分析蛋白質中半胱氨酸殘基的反應性，也可用于檢測蛋白質與配體之間相互作用的位點[39]。Nomura等利用isoTOP-ABPP技術發(fā)現(xiàn)了天然產物印苦楝內酯(Nimbolide)在癌細胞中的靶標為E3泛素連接酶RNF114[40]。鑒于SILAC標記試劑較為昂貴，王初等使用二甲基標記方法與TOP-ABPP聯(lián)用，建立了一種快速、高效且更經濟的方法rdTOP-ABPP[41]。Gygi等也在isoTOP-ABPP基礎上，結合使用新的脫硫生物素探針和TMT技術，又開發(fā)了一種更優(yōu)化的SLC-ABPP方法，極大地提高了原有技術的通量[42]。

1.3 光親和探針

ABP中的反應基團需要通過共價反應與相互作用蛋白結合口袋的活性氨基酸(如半胱氨酸、絲氨酸等)殘基結合，如果口袋附近無此類具有親核活性的氨基酸殘基，或是化合物結合于作用蛋白的變構區(qū)域等情況，ABP探針會存在脫靶的情況?？梢钥朔@些弊端的光親和標記(Photoaffinity labeling，PAL)探針應運而生[43-45]。PAL這一概念最早是由Frank Westheimer在1962年提出[46]，后被發(fā)展為一種有效的共價修飾蛋白的方法[47-48]，可用于分析ABP探針無法靶向的蛋白[12,49]。該方法的基本原理是：將探針的反應基團改變?yōu)楣夥磻鶊F，共孵育時探針首先以非共價的方式與作用蛋白發(fā)生親和，然后利用特定波長的光(常用365 nm的紫外線)激發(fā)光反應基團，使之產生高反應活性的中間體，如卡賓、自由基、氮卡賓等(圖2c)。由于這些中間體只有極短的壽命，遠小于探針分子與靶蛋白的親和作用時間，可以迅速地與肽鍵骨架等形成共價鍵，使探針分子共價交聯(lián)到近端的蛋白(最有可能的即是與探針相互親和的作用靶標)[44]。常用的光反應基團有二苯甲酮、芳基疊氮和二氮雜環(huán)[50-51]。天然產物Chamuvarinin是分離自灌木香蕉(Uvaria chamae)的一類四氫吡喃結構，Smith等利用光親和探針確定了其作用靶點是FoF1-ATP合成酶的α-和β-亞基，接著闡明了化合物通過阻斷FoF1-ATP合成酶的氧化磷酸化來抑制細胞ATP的產生[52]。李正球等也利用光親和探針技術成功鑒定了抗腫瘤化合物沙蟾毒素(Arenobufagin)的已知靶點ATP1A1和多個潛在靶點，包括PARP1和RAB6A/6B/39A等[53]。

光親和探針也可以引入點擊化學所需的惰性反應基團，解決前述報告基團造成探針分子量過大、細胞通透性差等問題[44,50,54-55]。Yao等基于點擊化學設計了探針片段含有最少原子數(Minimalist)的光親和探針，驗證了其具有高細胞膜通透性。將其安裝到星形孢菌素(Staurosporine)結構上，可在HepG2細胞中分析潛在的作用靶點[56]。ATP是參與能量代謝的基本物質，但是對于可與ATP作用的蛋白質尚缺乏深層次的分析鑒定，Niethammer等設計了一種與ATP結構差別較小的mipATP光親和探針，結合SILAC定量蛋白組學技術，在肺癌細胞A549裂解物和細胞膜蛋白中發(fā)現(xiàn)了可與之相互作用的多個蛋白，繪制了ATP和蛋白相互作用網絡[57]。不過，光反應基團也依然存在與細胞中含量比較豐富的蛋白(如actin、tubulin等)非特異性結合等問題，實踐過程中需要設計不具備活性的陰性探針排除這些額外的干擾[27,49,58]。

2 基于非修飾探針的天然產物靶點方法

使用親和探針尋找作用靶點的方法具有一定的局限性。具體體現(xiàn)在合成探針分子均需引入報告基團、反應基團等外源修飾，而某些天然產物的結構缺乏合適的修飾位點或者缺乏引入修飾位點的合成方法；同時外源修飾基團也可能會干擾天然產物的藥理活性，導致探針分子發(fā)現(xiàn)的作用靶點與母體化合物相異等。鑒于此，多種基于蛋白質穩(wěn)定性的非修飾探針化學蛋白質組學方法被開發(fā)出來用于天然產物的靶點發(fā)現(xiàn)工作。

大多數蛋白質通過分子內的非共價相互作用折疊成天然構象，細胞中蛋白質處于折疊和未折疊的動態(tài)平衡中，這兩個狀態(tài)之間的自由能差可以反映處于動態(tài)平衡中折疊蛋白質的比例。折疊穩(wěn)定性會影響蛋白質的化學修飾、聚集或降解等行為，而化合物-作用靶點相互結合可改變靶蛋白結構和穩(wěn)定性。因此檢測配體化合物加入前后，蛋白組針對不同物理或化學變化誘導的穩(wěn)定性變化差異，有可能發(fā)現(xiàn)與配體相互作用的蛋白(圖3)。與基于探針的方法相比，這類方法無須對待尋靶分子進行修飾，而且不僅可以檢測直接作用蛋白，還可能檢測間接作用蛋白。

圖3 基于非修飾探針的靶點發(fā)現(xiàn)所提及的天然產物結構

2.1 基于蛋白質氧化還原速率的方法

Fitzgerald等2008年首先提出了一種通過氧化速率檢測蛋白穩(wěn)定性的SPROX方法(圖4a)[59]。蛋白質中的甲硫氨酸殘基在解折疊狀態(tài)，更易于在溶劑中暴露而被氧化。SPROX技術利用不同濃度的化學變性劑(如鹽酸胍、尿素)使蛋白質解折疊，再加入過氧化氫氧化甲硫氨酸，通過測量變性劑濃度與甲硫氨酸的氧化速率關系，計算蛋白穩(wěn)定性的熱力學參數(如親和力)。由于結合化合物的靶蛋白具有更強的結構穩(wěn)定性，在化學變性劑中解折疊速度變慢，相應地使甲硫氨酸殘基被氧化速率變低，因此通過對比可以鑒定化合物的作用靶點。SPROX具有可大規(guī)模評估蛋白質折疊狀態(tài)，并且可能精確測量到化合物與靶蛋白結合的結構域和肽段等優(yōu)點。Fitzgerald等利用與質譜結合的SPROX技術描述了酵母細胞裂解物中327種蛋白質的蛋白質折疊和配體結合特性的能力，并基于此研究了免疫抑制劑環(huán)孢菌素(Cyclosporin A)的蛋白質靶點，除了當時已知的2個靶點外，又確定了它的8個新蛋白質靶標[60]。為了拓寬該方法的使用范圍，2011年Fitzgerald提出使用S-甲基硫代乙?；鶃啺彼猁}(SMTA)改進的SPROX方法[61]。SMTA可修飾在蛋白質中出現(xiàn)頻率更高的賴氨酸殘基,在化學變性劑誘導蛋白質解折疊后，通過分析SMTA修飾賴氨酸速率和化學變性劑濃度可計算評估蛋白質折疊自由能、蛋白質-配體解離常數。利用SMTA-SPROX方法分析了不同的純化蛋白質，由泛素、BCAⅡ、RNaseA、細胞色素C和溶菌酶構成的蛋白質混合物，以及酵母細胞裂解液，發(fā)現(xiàn)改進后的方法與原SPROX方法的鑒定結果具有一定的互補性，聯(lián)合使用可提升靶蛋白鑒定效果。2014年Fitzgerald又將二甲基2-羥基-5-硝基芐基溴化硫(HNSB)標記色氨酸殘基的方法應用于SPROX技術，進一步增加了蛋白組分析中肽段和蛋白質的覆蓋率，并準確測定了N,N',N''-三乙?；鶜と桥c溶菌酶結合的解離常數Kd，成功地檢測到布林唑胺(Brinzolamide)與非兩態(tài)折疊蛋白BCA Ⅱ的結合[62]。

圖4 基于非修飾探針的天然產物靶點發(fā)現(xiàn)方法

SPROX技術可與定量蛋白組學連用。2013年，F(xiàn)itzgerald使用iTRAQ-SPROX聯(lián)合方法，能在復雜的生物樣品中同時分析數百種蛋白質的配體結合性，并且能同時檢測配體結合的靶蛋白和脫靶蛋白[63]。例如他們通過iTRAQ-SPROX方法定量了格爾德霉素與Hsp90的結合親和力，并發(fā)現(xiàn)了格爾德霉素與Hsp90之間存在的2種不同的結合模式[64]。Walker等又將SPROX與高通量的TMT定量蛋白組方法聯(lián)用，開發(fā)了HR-SPROX方法，能在整個蛋白質組范圍內以更高的分辨率得到變性-氧化曲線，精確地測量局部自由能變化[65]。從SPROX技術的原理可以看出該方法主要局限性在于：①需要蛋白具有可溶性，因此不適用于檢測不可溶的蛋白；②測量蛋白質折疊熱力學參數，估算配體與蛋白質結合的親和力時，需要足夠高的蛋白質和配體濃度；③用于探測蛋白質折疊狀態(tài)的反應可能會干擾蛋白質的折疊特性以及與配體的結合；④SPROX技術實驗過程較為復雜，耗材較多，成本較高。

2.2 基于蛋白質對內切酶敏感性的方法

在蛋白組學實驗中，常常需要在變性條件下對蛋白質進行徹底水解，獲得蛋白質的序列信息。蛋白質的水解程度取決于其肽鍵與蛋白水解酶之間的可及性，暴露于溶劑面的外圍殘基和柔性環(huán)容易被酶切水解，而被折疊包裹在核心區(qū)域的肽鍵較難被水解。因此，限制性蛋白水解(Limited proteolysis，LiP)早先主要被用于研究處于天然狀態(tài)蛋白質的空間結構，或是研究配體、pH、化學試劑誘導的蛋白構象變化[66-69]。當蛋白與配體(包括靶蛋白與天然產物)相互作用時，蛋白與配體結合的區(qū)域因蛋白酶可及性降低，水解受到限制(圖4b)，所以可通過分析有無配體結合時蛋白水解產生肽段的差異定位配體結合肽段和蛋白信息[70-72]。Park和Marqusee在2005年率先報道了可用于監(jiān)測蛋白質與配體結合的方法Pulse proteolysis(PP)，該技術通過不同濃度的變性劑解折疊蛋白質，而與配體結合的蛋白質能保持折疊狀態(tài)，添加蛋白酶后僅未折疊蛋白被水解，之后可通過凝膠電泳或蛋白質組學技術分析差異蛋白(圖4d)[73]。PP即可用于分析純化蛋白，也可用于蛋白混合物的分析[74]。

2009年，Lomenick等首次提出藥物親和力響應靶標穩(wěn)定性(Drug affinity responsive target stability，DARTS)方法(圖4c)，該方法利用蛋白與化合物結合后構象變化導致水解模式的變化來鑒定靶蛋白[75]。其基本原理是化合物和靶蛋白之間形成的疏水鍵、氫鍵或靜電相互作用導致自由能變化，使得蛋白趨向形成有利于化合物結合的構象，以處于更穩(wěn)定的熱力學狀態(tài)。這時靶蛋白對非特異性蛋白水解酶，例如嗜熱菌蛋白酶或鏈霉蛋白酶的水解抵抗力顯著增強，通過質譜分析比較蛋白凝膠上差異條帶即可鑒定被化合物穩(wěn)定的靶蛋白。由于DARTS具有不需要對化合物進行化學修飾或固定，并且可直接用于純蛋白、細胞裂解液、細胞、組織等各種生物體系的優(yōu)點，近年來應用廣泛[75]。何慶瑜等通過DARTS方法發(fā)現(xiàn)抗腫瘤化合物蝙蝠葛蘇林堿(Daurisoline)的作用靶點為Hsp90，進而降解β-catenin，抑制細胞周期蛋白cyclin D1和癌基因c-myc的表達[76]。清熱解毒中藥穿心蓮的主要活性化合物穿心蓮內酯(Andrographolide)的作用靶標DRP1、2'-羥基肉桂醛靶蛋白ATAT3也都通過DARTS技術得到了鑒定[77-78]。白樺脂酸(Betulinic acid，BA)是藥用植物中常見的五環(huán)三萜類化合物，具有抗腫瘤活性，但作用機制不明。李正球等設計了BA的光親和探針，并使用乳腺癌細胞MCF7標記到它的多個可能靶點，但未能明確其直接作用靶蛋白[79]。隨后王志宇等同樣在MCF7細胞中運用DARTS技術，檢測到BA的直接作用蛋白GRP78，初步闡明了其抗腫瘤的分子機制，并發(fā)現(xiàn)了乳腺癌治療的可能新靶點[80]。DARTS方法主要局限性在于：①有些化合物與作用靶點結合并不對其構象產生明顯改變；②部分蛋白質對蛋白水解酶整體敏感性低，無法產生DARTS可監(jiān)測到的變化；③部分靶蛋白與化合物結合后存在增加水解敏感性的可能[81]；④初期DARTS方法利用SDS-PAGE分離樣品篩選差異條帶，難以實現(xiàn)條帶有效分離或難以鑒定低豐度靶蛋白信息。不過最后1個局限性，在引入了MudPIT分析方法和溶液內基于分子量的蛋白分離方法后，得到大大改善[75]。

與DARTS相比，PP在膜蛋白分析上更具優(yōu)勢。2014年，Adhikari和Fitzgerald將SILAC標記定量技術引入與PP分析，建立了更準確的定量分析復雜生物背景體系中蛋白-配體相互作用的方法SILAC-PP[82]。之后，F(xiàn)itzgerald等同時使用iTRAQ-SPROX和SILAC-PP兩種技術研究抗癌化合物三白脂素(Manassantin A)的作用靶點，最終確定了28個潛在靶蛋白，為三白脂素A作用機制的探索提供了基礎[83]。2016年，Bizarro等在PP技術基礎上建立了一種新的靶點鑒定方法PePTID，該方法在蛋白水解后不分析未水解蛋白質，而是通過分析酶切產生的肽段評估小分子與靶蛋白的相互作用[84]。PePTID相比于PP方法，實驗流程得到簡化，降低了分析樣品的復雜度，同時減少了所需化合物和蛋白質總量。2017年，Picotti等將限制性酶切與質譜分析結合，開發(fā)了可在復雜蛋白樣品中檢測蛋白質結構變化的方法LiP-MS[85]。LiP-MS可以檢測蛋白質在二級結構層面的細微變化，分辨率達到肽段水平，可精確定位到蛋白質中發(fā)生結構改變的區(qū)域。該方法既可用于發(fā)現(xiàn)藥物靶標，又可檢測與疾病相關蛋白質的結構狀態(tài)，在復雜生物樣本中分析蛋白質聚集信息。與PePTID類似，LiP-MS同樣分析的是酶切后產生肽段的差異，依靠專屬肽段的檢測確定蛋白信息。隨后Picotti等將LiP-MS的應用拓展到代謝物分析，開發(fā)了系統(tǒng)性分析代謝物與蛋白質相互作用以及結合位點的方法LiP-SMap[86]。目前上述檢測肽段的限制性酶切方法的主要局限在于：①與DARTS類似，化合物與靶蛋白結合并非是影響靶蛋白水解敏感性的充分且必要因素；②不同生物樣本的復雜度存在較大差異，每個具體的實驗過程都需要對蛋白酶濃度和酶切時間進行控制，隨機性較大；③僅分析肽段信息導致定量和定性準確性以及對可能的靶蛋白的覆蓋率降低。針對最后這個局限性，在實際應用中可依靠引入代謝標記和化學標記技術增加定量的準確性，同時與其他化學蛋白質組學方法的組合使用也能提升靶蛋白鑒定的范圍和效率[87-88]。

2.3 基于蛋白質熱穩(wěn)定性的方法

Molina等于2013年在熱漂移實驗(Thermal shift assay,TSA)基礎上建立了細胞熱轉移分析(Cellular thermal shift assay,CETSA)方法，用于在細胞或組織中評估藥物與靶蛋白結合能力，進行基于靶點的化合物篩選工作[89]。CETSA方法的原理是化合物與靶蛋白結合后改變蛋白質的熱穩(wěn)定性，使得蛋白質的熔解曲線發(fā)生遷移。但是該方法依靠蛋白免疫印記進行定量，通量低且僅適用于檢測化合物與其已知作用靶點的親和力。隨后，Savitski等結合CETSA方法與定量蛋白組學技術開發(fā)了熱蛋白質組分析(Thermal proteome profiling,TPP)方法(圖4e)[90]。該方法可以從完整細胞或組織中無差別地鑒定小分子化合物直接作用的靶點，并且能計算靶蛋白的熔解溫度(Tm)。隨后Savitski等又提出了2D-TPP策略，將溫度梯度與藥物濃度梯度組合，進行二維正交的熱蛋白質組分析，能更靈敏地測量親和力[91]。他們使用TPP技術鑒別了星形孢菌素(Staurosporine)的作用靶點，所發(fā)現(xiàn)的靶蛋白中有92個與已被報道的Kinobeads鑒定結果重合，還額外發(fā)現(xiàn)2個可能與星形孢菌素不良反應相關的脫靶[91-92]。

TPP方法在天然產物靶點發(fā)現(xiàn)中的潛力逐漸被發(fā)掘，Kirsch等通過TPP技術，首次發(fā)現(xiàn)活性天然產物Vioprolides A通過作用于NOP14抑制核糖體的生物合成，從而在急性淋巴細胞白血病中發(fā)揮抗癌作用[93]。又如Emili等在穩(wěn)定同位素標記定量技術和配體濃度依賴的靶標沉淀減少原理上建立了TILS方法，該方法成功地鑒定到多種化合物已知的靶標和未知的相互作用蛋白，并且首次鑒定到天然溴化物6-OH-BDE-47發(fā)揮抗菌作用的靶標是烯酰-?；d體蛋白還原酶(Fabl)[94]。

由于TPP使用了不含去污劑的緩沖液提取蛋白，為了改進其僅檢測小分子與可溶蛋白的相互作用的局限性，2015年Reinhard等發(fā)現(xiàn)可通過在緩沖液中添加合適濃度的溫和去污劑，以增加膜蛋白的提取效率。這使得TPP方法可被擴展分析膜蛋白與配體的相互作用[95]。之前TPP方法分析的是未發(fā)生熱變性的蛋白，而忽略了不溶性沉淀物也能提供的信息。2020年葉明亮等提出了微粒輔助的沉淀篩選MAPS方法(圖4f)[96]。MAPS分析的主體是在熱處理中發(fā)生變性沉淀的蛋白，并且通過微粒聚集沉淀蛋白，為后續(xù)的蛋白酶提供便利。他們使用MAPS技術成功鑒定幾種已知藥物靶標，與經典的TPP方法相比，MAPS在實際操作時可使用更少的蛋白量，易于實現(xiàn)自動化操作和高通量鑒定。除此之外，MAPS也可以通過在緩沖液中添加溫和去污劑來提升其對膜蛋白的分析能力。當前TPP方法主要的局限性在于：①在低豐度和熱穩(wěn)定性變化小的靶蛋白鑒定上受到限制；②與LiP-MS相比，TPP方法無法達到肽段水平的分辨率，因此無法確定靶蛋白與化合物結合的區(qū)域、熱敏感的結構域；③TPP方法相對耗時長、花費高、產生的信息數據量大。

2.4 基于蛋白質在化學試劑中穩(wěn)定性的方法

鑒于TPP方法中許多蛋白質的熱變性是不可逆的，除Tm值以外難以從TPP數據中提取其他的熱力學參數，并且蛋白質與配體結合后的Tm位移大小并不總是與配體結合的親和力相關，F(xiàn)itzgerald等在2018年提出了CPP方法(圖4g)。該方法綜合了SPROX方法中的化學變性和TPP技術中的蛋白質沉淀兩種策略。首先利用化學變性劑鹽酸胍使部分蛋白去折疊，可溶性蛋白質隨變性劑濃度升高而減少，再通過蛋白質沉淀分離折疊和未折疊的蛋白質。與化合物結合的靶蛋白因更易保持折疊狀態(tài)，因此對未沉淀蛋白的分析即可鑒定與化合物作用靶點。與TPP采用的熱變性相比，CPP中化學變性具有可逆性，并且化學變性劑誘導的蛋白質解折疊與折疊自由能之間有著確定的關聯(lián)，可計算藥物-蛋白結合親和力、結合自由能以及相互作用的解離常數；與SPROX技術相比，CPP分析的是完整蛋白，其蛋白質組覆蓋率提高了大約50%，而錯誤發(fā)現(xiàn)率大大降低。使用CPP技術，他們驗證了環(huán)孢菌素(Cyclosporin A)、格爾德霉素(Geldanamycin)和西奈芬凈(Sinefungin)3個化合物的已知作用靶點[97]。2020年，葉明亮等報道了一種新的基于化學沉淀作用靶點的SIPSIP方法(圖4h)。SIP方法采用有機變性劑誘導蛋白沉淀，該方法操作簡便，鑒定結果可以和TPP方法互補，他們使用本方法成功鑒定了甲氨蝶呤、SNS-032等已知靶蛋白和部分潛在的未知靶蛋白[98]。

2.5 其他

基于質譜的定量蛋白質組學技術已經成為藥物研發(fā)工作中一種成熟的工具，并且在藥物靶標鑒定方面表現(xiàn)突出。前述多種化學蛋白質組學方法的發(fā)展為天然產物靶蛋白鑒定工作注入了活力，但藥物靶標發(fā)現(xiàn)仍然是一個具有挑戰(zhàn)性的工作，靶點發(fā)現(xiàn)中假陽性結果的排除、靶標與藥理作用關聯(lián)的確認較為困難。多個不同的課題組均根據蛋白在不同情況下的穩(wěn)定性問題，提出了自己的解決方案。

Zubarev等報道了一種突觸藥物作用機制的靶標發(fā)現(xiàn)方法FITExP[99]。其原理依據化合物靶蛋白在細胞凋亡晚期的豐度變化異常大，遠遠超過其他受到調控的蛋白，通過對比幾種使用化合物處理的不同細胞系，可以發(fā)現(xiàn)這些凋亡過程中變化異常的蛋白。他們使用FITExP方法成功鑒定了抗腫瘤藥物甲氨蝶呤、紫杉醇、阿霉素和5-氟尿嘧啶的已知作用靶點。而后，他們于近期聯(lián)合使用了FITExP、TPP和CETSA三種化學蛋白質組學方法研究藥物金諾芬(Auranofin)的作用靶點，通過這些交叉互補的鑒定方法發(fā)現(xiàn)了金諾芬的主要靶標TXNRD1、NFKB2和CHORDC1[100]。

2019年Kubota等報道了一種基于蛋白質組擾動分析的靶點發(fā)現(xiàn)方法PPCP，該方法在蛋白質沉默和基因沉默的基礎上，分析蛋白表達豐度變化與化合物活性之間的關聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)了一些TGF-b通路抑制劑的靶蛋白是羊毛甾醇合成酶(Lanosterol synthase)[101]。

2020年Blake等提出了一種高通量的評估小分子與細胞內蛋白結合能力的方法HIPStA[102]。其依據Hsp90作為伴侶蛋白可協(xié)助多種蛋白質折疊穩(wěn)定的原理，考察加入和不加Hsp90抑制劑前后，這些被折疊蛋白與化合物結合的穩(wěn)定情況，而鑒定化合物的作用靶點。使用本方法，他們成功發(fā)現(xiàn)激酶抑制劑TAK-285的主要作用靶點HER2以及其他可能的作用靶點。

顯而易見的是，與前述物理或化學條件變化引起的蛋白組整體變化不同，上述這些方法可用范圍較窄，僅適用于凋亡、外源控制基因沉默、Hsp90參與的蛋白折疊等定向或特定生物學過程。

3 總結與展望

中藥天然產物是天然藥物發(fā)現(xiàn)的重要來源，但是其發(fā)揮藥理活性的分子機制常常并不清楚，鑒定中藥天然產物的作用靶點對于理解中藥的功效作用和不良反應發(fā)生的原因至關重要。在過去的幾十年中，質譜技術的進步極大地促進了化學蛋白組學的發(fā)展，使得天然產物的靶蛋白鑒定方法取得了巨大突破，本文總結了近年來使用化學蛋白組學技術鑒定天然產物作用蛋白方法的發(fā)展。這些方法各具特色，使用它們已發(fā)現(xiàn)了許多著名天然產物的作用靶點，為理解天然產物作用機制和可能的副作用提供了全面的視角。但具體到每個方法仍存在各自的局限性，僅憑單一方法無法全面解決所有問題。為了提高對蛋白組的整體覆蓋率，并捕獲不同條件下化合物與作用蛋白的動態(tài)變化，可能需要不斷優(yōu)化每個具體方法的操作過程，并進行多個方法的組合使用。除此之外，細胞中不同蛋白豐度差異巨大，現(xiàn)有方法對低豐度蛋白的檢測靈敏度不足，以及從細胞培養(yǎng)、液相分離到質譜檢測等實驗過程都存在一定的不穩(wěn)定性，這些都是需要我們持續(xù)提高的環(huán)節(jié)。相信隨著質譜技術和實驗條件的進步，在未來的發(fā)展中，只有高復現(xiàn)性、高通量、高準確度、自動化操作、適用范圍廣的方法會不斷被科學家開發(fā)出來，更好地為中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新和基于中藥的創(chuàng)新藥物研發(fā)服務。