用HPLC法測定家兔血漿中雙氯芬酸鈉濃度的效果及此藥藥代動力學(xué)的特點(diǎn)

趙宣平，張 瑤，張 磊

（平頂山學(xué)院，河南 平頂山 467000）

雙氯芬酸鈉（DS）是第三代鄰氨基苯甲酸類非甾體類抗炎藥[1]。此藥能抑制環(huán)氧化酶的活性，減少前列腺素的生成，進(jìn)而可起到解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用。過去，臨床上主要是采用DS 治療各種炎性病變或用其對骨科患者進(jìn)行鎮(zhèn)痛治療[2]。近年來，此藥也被臨床上用于對接受耳鼻喉手術(shù)的患者進(jìn)行術(shù)后鎮(zhèn)痛治療[3]。與其他非甾體類抗炎藥相比，DS 的鎮(zhèn)痛、抗炎效果更強(qiáng)且副作用更輕微。但此藥的半衰期較短，在人體內(nèi)的代謝速度較快，且其在肝臟中的首過消除現(xiàn)象較為嚴(yán)重[4]。有研究指出，DS 在人體內(nèi)的生物利用度僅為50% 左右[5]。患者在口服此藥后2 h 左右其血藥濃度就會逐漸下降，為了保持有效的血藥濃度需多次服藥。本文主要是探討采用高效液相色譜（HPLC）法測定家兔血漿中DS 濃度的效果及此藥在家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點(diǎn)。

1 儀器與材料

1100Series 高效液相色譜儀（由美國Agilent 公司生產(chǎn)），TG16X- Ⅱ高速離心機(jī)（由長沙東旺儀器有限公司生產(chǎn)），XK96-A 旋渦混合器（由江蘇新康醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)）。DS 標(biāo)準(zhǔn)品（由南京易亨制藥有限公司生產(chǎn)），甲醇和冰醋酸（均由上海方野化工有限公司生產(chǎn)），乙腈，蒸餾水。家兔購于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，其許可證編號為SCXK（豫）2019-0001，其體重為1.5 ～2 kg。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇:4% 的冰醋酸（濃度比為7:3），檢測波長：276 nm，流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃。

2.2 空白血漿制備

固定家兔，按需對其進(jìn)行抽血。將抽取的血液立即注入內(nèi)部涂有肝素鈉的離心管中，以8000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液（即血漿），并將上清液置于-20℃的冰箱中凍存。

2.3 血樣預(yù)處理

取500 μl 的家兔血漿樣品，在其中加入500 μl 的乙腈。對血漿中的蛋白質(zhì)及大分子脂類物質(zhì)進(jìn)行沉淀，然后對血漿進(jìn)行2 min 的漩渦處理，使其混勻。以4000 r/min 的轉(zhuǎn)速對血漿進(jìn)行10 min 的離心處理，取上清液，并用微孔濾膜對上清液進(jìn)行過濾，備用。

2.4 專屬性測定

取空白血漿和DS 標(biāo)準(zhǔn)品，采用HPLC 法并按照2.1 項下的色譜條件分別對空白血漿和DS 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，DS 在DS 標(biāo)準(zhǔn)品中的保留時間為6.913 min。詳見圖1。

圖1 DS 的高效液相色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

分別配制濃度為0.01 μg/mL、3.01 μg/mL、6.01 μg/mL、9.01 μg/mL、12.01 μg/mL 和15.01 μg/mL 的DS 血 漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，并按照2.3 項下的方法進(jìn)行處理，記錄數(shù)據(jù)并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性方程：Y=11.876X+7.5931，R2=0.997，且DS 的濃度在0.01 ～15.01μg/mL 的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

取0.5 mL 濃度為15 μg/mL 的DS 溶液，在溶液中加入0.5 mL 的空白兔血漿，得到濃度為7.5 μg/mL 的DS 血漿溶液。對DS 血漿溶液進(jìn)行過濾，采用HPLC 法并按照2.1項下的色譜條件分別于一天內(nèi)的不同時間點(diǎn)對DS 血漿溶液進(jìn)行測定，分別記錄其峰面積和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果顯示，DS 血漿溶液在時間1、時間2、時間3、時間4 和時間5 的峰面積分別為102.33、106.35、108.06、102.15和106.51，其峰面積的RSD 為2.5。詳見表1。這一結(jié)果表明該檢測方法的精密度良好。

表1 進(jìn)行精密度試驗(yàn)的結(jié)果

2.7 回收率試驗(yàn)

分別配置濃度為6.02 μg/mL、18.02 μg/mL和30.02 μg/mL的DS 血漿溶液（DS 和血漿之比為1:1），并按照2.3 項下的方法進(jìn)行處理。采用HPLC 法并按照2.1 項下的色譜條件分別對各濃度的DS 血漿溶液進(jìn)行5 次測定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各自的濃度及回收率。結(jié)果顯示，當(dāng)DS 血漿溶液中加入DS 的濃度為3.01 μg/mL、9.01 μg/mL 和15.01 μg/mL 時，DS 的回收率分別為99%、105%和96%。詳見表2。

表2 進(jìn)行回收率試驗(yàn)的結(jié)果

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配置濃度為3.01 μg/mL、9.01 μg/mL 和15.01 μg/mL的DS 血漿溶液，將其分別在室溫下放置0 h、12 h、24 h、36 h 和48 h，然后采用HPLC 法并按照2.1 項下的色譜條件分別對DS 血漿溶液進(jìn)行測定，記錄其峰面積和RSD。結(jié)果顯示，不同濃度的DS 血漿溶液在不同時間點(diǎn)的RSD 均小于5%，這表明DS 血漿溶液在48 h 內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.9 家兔血漿中DS 的濃度及DS 在家兔體內(nèi)的主要藥代動力學(xué)參數(shù)

取6 只家兔（雄雌兼有），為其稱重，按照10 mg/kg 的劑量向其大腿肌肉內(nèi)注射DS。分別于注藥后的5 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min、180 min 和240 min 采集其心臟血1 mL。將血液標(biāo)本置于涂有肝素鈉的離心管中，混勻后進(jìn)行離心處理，取血漿。之后按照2.3 項下的方法對血漿進(jìn)行處理，用HPLC 法并按照2.1 項下的色譜條件分別對血漿中DS 的濃度進(jìn)行測定，記錄各項數(shù)據(jù)，繪制藥- 時曲線，并采用DAS2.0 軟件計算DS 在家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果顯示，DS 在家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點(diǎn)為二室模型（指藥物首先進(jìn)入心、肝、腎等中央室并在該室均勻分布，之后再緩慢地分布到肌肉、皮膚、脂肪等周邊室）。詳細(xì)研究結(jié)果見表3、圖2 及表4。

表3 DS 的藥時數(shù)據(jù)表

圖2 DS 在家兔血漿中的濃度-時間曲線圖

表4 DS 在家兔體內(nèi)的主要藥代動力學(xué)參數(shù)

3 討論

本研究為了避免DS 對家兔的胃部產(chǎn)生刺激，故為其肌內(nèi)注射此藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[6]。為了保證采血時間的準(zhǔn)確性，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)對家兔進(jìn)行心臟取血[7]。需要注意的是，在取血時應(yīng)找準(zhǔn)家兔的心室，防止扎入其心臟起搏點(diǎn)而導(dǎo)致其中途死亡。本研究的結(jié)果顯示，采用HPLC 法測定家兔血漿中DS 濃度的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性良好，且不受家兔體內(nèi)內(nèi)源性物質(zhì)及代謝物的干擾。本研究在采用HPLC 法測定家兔血漿中DS 的濃度時所用的流動相為甲醇:4% 的冰醋酸。4% 的冰醋酸易揮發(fā)，因此每次實(shí)驗(yàn)前都要更換最新配置的流動相，以保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

本研究的結(jié)果證實(shí)，采用HPLC 法測定家兔血漿中DS的濃度具有操作簡便、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。DS 在家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點(diǎn)為二室模型。