• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    姜黃素對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠PI3K/AKT/GSK‐3β通路及肥大細(xì)胞活化的影響

    2021-05-26 04:03:58曹立花李麗娟胡曉丹張曉鈿??谑兄嗅t(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科???/span>570100
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:肥大細(xì)胞姜黃異位

    曹立花 李麗娟 胡曉丹 張曉鈿(??谑兄嗅t(yī)醫(yī)院婦產(chǎn)科,???570100)

    子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM)是一種發(fā)生在育齡婦女之間常見(jiàn)的慢性炎癥疾病,給個(gè)人和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1‐2]。目前,手術(shù)是EM治療的常規(guī)方法,但必須權(quán)衡手術(shù)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)和卵巢儲(chǔ)備的潛在減少,給EM的手術(shù)治療帶來(lái)困難,因此開(kāi)發(fā)新藥對(duì)改善臨床EM治療至關(guān)重要[3]。與EM相關(guān)的異常免疫細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等,其中肥大細(xì)胞活化能夠釋放炎癥因子,導(dǎo)致疼痛發(fā)生[4]。姜黃素(curcumin)是姜黃傳統(tǒng)藥物的一種多酚成分,具有抗氧化、抗炎和抗癌活性,能夠改善腦功能、控制肥胖癥和糖尿病,還可用作香料和食用色素[5]。JELODAR等[6]研究證實(shí),姜黃素可以預(yù)防大鼠EM異位灶組織生長(zhǎng)。磷脂酰肌醇3‐激酶(phosphatidylinositol 3‐kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK‐3β)信號(hào)通路的減弱與肥大細(xì)胞活化較少密切相關(guān),但姜黃素對(duì)EM的治療作用及其機(jī)制是否與PI3K/AKT/GSK3β途徑相關(guān)尚不明確[7]。本研究通過(guò)建立EM模型,研究姜黃素對(duì)EM大鼠的治療效果及其對(duì)PI3K/AKT/GSK3β通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,以期為揭示姜黃素的治療機(jī)制提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠70只,雌性未孕,6周齡,體重(200±10)g,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(豫)2017‐0001。實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并遵守3R保護(hù)原則。

    1.1.2 藥品與試劑姜黃素(MF‐008974)購(gòu)自信陽(yáng)市沐凡生物科技有限公司;蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(G1120)、大鼠TNF‐α(SEKR‐0009)、IL‐6(SEKR‐0005)和IL‐1β(SEKR‐0002)ELISA試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司;PI3K(PA5‐86800)、p‐AKT(PA5‐104866)和β‐肌動(dòng)蛋白(β‐actin)(PA1‐183)兔抗大鼠多克隆抗體、AKT兔抗大鼠單克隆抗體(MA5‐14916)、山羊抗兔lgG(H+L)(A32731)和山羊抗小鼠IgG(H+L)(A32723)二級(jí)抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;GSK‐3β(ab185141)和p‐GSK‐3β(ab68476)兔抗大鼠單克隆抗體和購(gòu)自英國(guó)Ab-cam公司。

    1.1.3 主要儀器MA100N型倒置顯微鏡由日本Nikon生產(chǎn);Gel DocTMXR+型凝膠成像儀由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物模型制備參照文獻(xiàn)[8]方法,將大鼠禁食24 h后,腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉,剖開(kāi)大鼠腹部,分離右側(cè)子宮與周圍組織,結(jié)扎兩端子宮血管后,分離子宮內(nèi)膜,修剪為5 mm×5 mm的子宮內(nèi)膜碎片,內(nèi)膜向里移植入大鼠左側(cè)腹部腹壁后,縫合大鼠腹部。術(shù)后連續(xù)5 d向上述各組大鼠腹腔注射容量為4 000 U/只的硫酸慶大霉素注射液,術(shù)后次日開(kāi)始給予大鼠0.1 mg/kg的雌二醇(1%羧甲基纖維素納溶液溶解)灌胃處理,1次/4 d,共灌胃3次,在末次灌胃雌二醇后第4天麻醉大鼠,觀察異位內(nèi)膜形成透明囊狀,內(nèi)有積液和表面血管生成,則造模成功。假手術(shù)組進(jìn)行右側(cè)子宮截取,但不進(jìn)行左側(cè)異位內(nèi)膜移植處理,術(shù)后次日給予等量1%羧甲基纖維素納溶液,其余參照上述造模方法進(jìn)行。

    1.2.2 分組及藥物處理造模成功大鼠為56只,隨機(jī)分為模型組(11只,給予等量蒸餾水灌胃)、姜黃素低(11只)、中(11只)、高(12只)劑量組(分別給予60、120和240 mg/kg姜黃素灌胃)、陽(yáng)性對(duì)照組(11只,給予125 mg/kg孕三烯酮灌胃),灌胃1次/d,連續(xù)21 d。21 d假手術(shù)組(10只,給予等量蒸餾水連續(xù)灌胃)[9]。

    1.2.3 樣品采集末次給藥12 h后,戊巴比妥鈉麻醉各組大鼠,脫頸處死,剖腹,觀察大鼠異位灶個(gè)數(shù),參考文獻(xiàn)[10]方法,評(píng)價(jià)盆腔黏連情況,計(jì)算異灶面積。分別剪取假手術(shù)組正常子宮內(nèi)膜組織和各實(shí)驗(yàn)組異位子宮內(nèi)膜異位灶組織,部分經(jīng)脫水、石蠟包埋后制成切片,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn);其余部分組織分別用PBS清洗后,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.4 HE染色實(shí)驗(yàn)取1.2.3各組大鼠切片,經(jīng)HE染色后,顯微鏡下觀察異位灶組織病理學(xué)變化。

    1.2.5 甲苯胺藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說(shuō)明書步驟,對(duì)1.2.3各組大鼠組織切片染色后,隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)每平方毫米肥大細(xì)胞個(gè)數(shù),取均值。將形態(tài)規(guī)則、邊界清晰的肥大細(xì)胞定義為未脫落肥大細(xì)胞,周圍可見(jiàn)明顯顆粒的肥大細(xì)胞定義為脫落顆粒肥大細(xì)胞。

    1.2.6 炎癥因子ⅠL‐1β、ⅠL‐6和TNF‐α檢測(cè)將1.2.3中-80℃保存的組織制備勻漿液,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)異位灶組織中IL‐1β、IL‐6和TNF‐α水平。

    1.2.7 蛋白免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)將1.2.3中-80℃保存的組織勻漿后,加入RIPA提取各組總蛋白并測(cè)量蛋白含量。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、清洗后,依次加入PI3K、AKT、p‐AKT、GSK3β、p‐GSK3β和β‐actin一抗(1∶1 000)孵育過(guò)夜后,添加二抗(1∶5 000)繼續(xù)孵育2 h,曝光顯影,分析蛋白表達(dá)水平。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量數(shù)據(jù)均采用±s表示,多組間比較行單因素方差分析,進(jìn)一步比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠內(nèi)異灶和盆腔黏連情況除假手術(shù)組外,其余各組內(nèi)異灶個(gè)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;假手術(shù)組無(wú)內(nèi)異灶,與假手術(shù)組相比,模型組EM大鼠內(nèi)異灶面積和盆腔黏連評(píng)分均顯著升高(P<0.05);與模型組相比,姜黃素低、中、高劑量組EM大鼠內(nèi)異灶面積和盆腔黏連評(píng)分依次降低(P<0.05),陽(yáng)性對(duì)照組大鼠上述指標(biāo)均顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表1。

    2.2 異位內(nèi)膜組織病理學(xué)觀察如圖1所示,假手術(shù)組大鼠子宮內(nèi)膜完整,上皮細(xì)胞柱狀排列整齊,腺體自然;模型組大鼠異位內(nèi)膜組織生長(zhǎng)狀態(tài)良好,腺體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均正常;姜黃素低、中、高劑量組大鼠異位子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞形狀逐漸變?yōu)榈貑螌又鶢?,腺體和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,并出現(xiàn)空化現(xiàn)象;陽(yáng)性對(duì)照組上述現(xiàn)象介于姜黃素中劑量組和高劑量組之間。

    圖1 各組大鼠子宮內(nèi)膜異位灶組織HE染色圖片(×200)Fig.1 HE staining pictures of endometriosis tissue in each group(×200)

    圖2 各組大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞浸潤(rùn)情況Fig.2 Mast cell infiltration of heterotopic foci in each group

    表1 各組大鼠EM內(nèi)異灶解剖觀察結(jié)果(±s)Tab.1 Anatomical observation results of EM in rats of each group(±s)

    表1 各組大鼠EM內(nèi)異灶解剖觀察結(jié)果(±s)Tab.1 Anatomical observation results of EM in rats of each group(±s)

    Note:1)P<0.05 vs Sham operation group;2)P<0.05 vs Model group;3)P<0.05 vs Curcumin low dose group;4)P<0.05 vs Curcumin medium dose group.

    Pelvic adhesion score(points)0.00±0.00 5.42±1.001)4.37±0.672)3.26±0.512)3)2.15±0.482)3)4)3.09±0.332)Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 Several different foci(piece)0.00±0.00 4.12±1.031)3.73±0.87 4.02±0.62 3.96±0.74 4.25±0.96 Area of heterotopic lesion(mm2)0.00±0.00 49.65±7.071)38.20±9.112)25.54±8.232)3)16.61±9.322)3)4)23.66±7.282)

    2.3 姜黃素對(duì)EM大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞數(shù)量和活化的影響如圖2所示,假手術(shù)組異位灶組織肥大細(xì)胞及脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)較少,模型組大鼠肥大細(xì)胞數(shù)和脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)明顯增加,而姜黃素低、中和高劑量組大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯差異,脫顆粒肥大細(xì)胞相對(duì)數(shù)量呈減少趨勢(shì);陽(yáng)性對(duì)照組的脫顆粒肥大細(xì)胞相對(duì)數(shù)量介于姜黃素中高劑量組之間。與假手術(shù)組相比,模型組大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞總數(shù)、脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)和脫顆粒肥大細(xì)胞與肥大細(xì)胞總數(shù)比值均顯著升高(P<0.05);與模型組相比,姜黃素低、中、高劑量組大鼠異位灶組織脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)和脫顆粒肥大細(xì)胞與肥大細(xì)胞總數(shù)比值依次降低(P<0.05),見(jiàn)表2。

    2.4 姜黃素治療對(duì)各組大鼠異位灶部位炎癥因子表達(dá)影響與假手術(shù)組相比,模型組EM大鼠異位灶 組 織TNF‐α、IL‐1β和IL‐6表 達(dá)顯 著 增加(P<0.05);與模型組相比,姜黃素低、中、高劑量組EM大鼠異位灶組織TNF‐α、IL‐1β和IL‐6表達(dá)依次減少(P<0.05),陽(yáng)性對(duì)照組上述指標(biāo)顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表3。

    2.5 姜黃素治療對(duì)各組大鼠異位灶組織PⅠ3K、AKT和GSK‐3β蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)組相比,模型組EM大鼠異位灶組織PI3K、p‐AKT和p‐GSK‐3β蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05);與模型組相比,姜黃素低、中、高劑量組EM大鼠異位灶組織PI3K、p‐AKT和p‐GSK‐3β蛋白表達(dá)依次降低(P<0.05),陽(yáng)性對(duì)照組上述指標(biāo)顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表4、圖3。

    表2 各組大鼠異位灶組織中肥大細(xì)胞及脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)比較(±s)Tab.2 Comparison of mast cells and degranulated mast cells in ectopic foci of rats in each group(±s)

    表2 各組大鼠異位灶組織中肥大細(xì)胞及脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)比較(±s)Tab.2 Comparison of mast cells and degranulated mast cells in ectopic foci of rats in each group(±s)

    Note:1)P<0.05 vs Sham operation group;2)P<0.05 vs Model group;3)P<0.05 vs Curcumin low dose group;4)P<0.05 vs Curcumin medium dose group.

    Degranulated mast cells/total mast cells 0.21±0.06 0.46±0.051)0.37±0.022)0.25±0.032)3)0.17±0.022)3)4)0.21±0.032)Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 Total number of mast cells(piece)1.46±0.47 4.13±1.531)3.24±0.51 3.11±0.96 3.96±1.03 4.07±0.88 Number of degranulated mast cells(piece)0.26±0.13 1.69±0.231)0.98±0.262)0.58±0.112)3)0.25±0.132)3)4)0.39±0.092)

    表3 各組大鼠異位灶組織TNF‐α、IL‐1β及IL‐6表達(dá)情況(±s,pg/ml)Tab.3 Expressions of TNF‐α,IL‐1β and IL‐6 in ectopic foci of rats in each group(±s,pg/ml)

    表3 各組大鼠異位灶組織TNF‐α、IL‐1β及IL‐6表達(dá)情況(±s,pg/ml)Tab.3 Expressions of TNF‐α,IL‐1β and IL‐6 in ectopic foci of rats in each group(±s,pg/ml)

    Note:1)P<0.05 vs Sham operation group;2)P<0.05 vs Model group;3)P<0.05 vs Curcumin low dose group;4)P<0.05 vs Curcumin medium dose group.

    IL‐6 73.49±8.35 135.61±9.921)117.32±7.232)70.58±8.522)3)43.83±9.542)3)4)51.95±8.851)Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 TNF‐α 31.14±6.32 98.78±10.431)70.36±9.182)52.52±10.022)3)12.39±3.222)3)4)29.64±5.131)IL‐1β 0.67±0.09 2.44±0.121)2.05±0.082)0.99±0.082)3)0.37±0.132)3)4)0.59±0.101)

    表4 各組大鼠異位灶組織中PI3K、AKT和GSK‐3β蛋白表達(dá)比較(±s)Tab.4 Comparison of PI3K,Akt and GSK‐3 β protein expression in ectopic foci of rats in each group(±s)

    表4 各組大鼠異位灶組織中PI3K、AKT和GSK‐3β蛋白表達(dá)比較(±s)Tab.4 Comparison of PI3K,Akt and GSK‐3 β protein expression in ectopic foci of rats in each group(±s)

    Note:1)P<0.05 vs Sham operation group;2)P<0.05 vs Model group;3)P<0.05 vs Curcumin low dose group;4)P<0.05 vs Curcumin medium dose group.

    p‐GSK‐3β/GSK‐3β 0.29±0.03 0.83±0.061)0.61±0.022)0.36±0.062)3)0.10±0.022)3)4)0.23±0.032)Groups Sham operation Model Curcumin low dose Curcumin medium dose Curcumin high dose Positive control n 10 11 11 11 12 11 PI3K/β‐actin 0.16±0.03 1.26±0.031)0.98±0.042)0.57±0.062)3)0.21±0.022)3)4)0.34±0.042)p‐AKT/AKT 0.32±0.04 1.18±0.021)0.99±0.072)0.65±0.042)3)0.13±0.032)3)4)0.22±0.022)

    3 討論

    通過(guò)外科手術(shù)將子宮組織移植到腹壁和腸系膜是常見(jiàn)的建立小鼠或大鼠的實(shí)驗(yàn)性異位癥子宮內(nèi)膜模型的方法,該模型的廣泛應(yīng)用對(duì)EM的發(fā)病及治療機(jī)制的研究具有重要意義[10‐11]。研究發(fā)現(xiàn),EM大鼠的惡化程度與內(nèi)異灶體積大小及盆腔黏連變化密切相關(guān)[12‐13]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠內(nèi)異灶個(gè)數(shù)、內(nèi)異灶體積和盆腔黏連相較于假手術(shù)組均顯著升高,提示EM造模成功。此外,模型組大鼠異位內(nèi)膜組織生長(zhǎng)狀態(tài)良好,腺體上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞均正常,表明EM病灶組織生長(zhǎng)未得到有效控制。給予EM大鼠不同劑量的姜黃素治療后,各組大鼠內(nèi)異灶體積和盆腔黏連均相應(yīng)減少,表明姜黃素對(duì)EM具有治療作用,與既往研究結(jié)果一致[6]。

    肥大細(xì)胞在炎癥性疾病中至關(guān)重要,研究表明,肥大細(xì)胞脫顆??梢葬尫叛装Y因子促進(jìn)EM病理性疼痛持續(xù)發(fā)生,且EM病變中的肥大細(xì)胞和活化數(shù)明顯增加[14]。病理水平上EM會(huì)導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)增加,而改善炎癥水平能夠阻止異位灶組織生長(zhǎng)[15]。本研究結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,模型組EM大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞數(shù)、肥大細(xì)胞總數(shù)、脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)和脫顆粒肥大細(xì)胞與肥大細(xì)胞總數(shù)比值、炎癥因子TNF‐α、IL‐1β和IL‐6表達(dá)顯著增加,提示EM大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞及其活化狀態(tài)升高,處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)。給予姜黃素治療后,各組異位灶組織肥大細(xì)胞脫顆粒占比和上述炎癥因子表達(dá)顯著降低,提示姜黃素可抑制EM大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞活化,可能與降低炎癥反應(yīng)相關(guān)。另有研究證實(shí),姜黃素能夠通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)對(duì)高果糖飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征大鼠和中腦動(dòng)脈阻塞大鼠產(chǎn)生治療作用,因此推測(cè)姜黃素可能是EM治療的潛在有效藥物,這可能與降低肥大細(xì)胞活化,抑制炎癥反應(yīng)相關(guān)[16‐17]。

    PI3K是細(xì)胞信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)劑,LIN等[18]研究發(fā)現(xiàn),抑制PI3K及其下游激酶AKT表達(dá)能夠抑制肥大細(xì)胞活化。徐南輝等[19]利用肥大細(xì)胞脫顆粒肽誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫顆粒進(jìn)程,發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)明顯升高。GSK3β是AKT下游效應(yīng)分子之一,激活小鼠下丘腦中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白/AKT/GSK3β級(jí)聯(lián)反應(yīng)可觸發(fā)肥大細(xì)胞脫顆粒[20]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠異位灶組織中PI3K蛋白、AKT和GSK3β磷酸化水平相較于假手術(shù)組顯著升高,提示EM大鼠異位灶組織PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。給予姜黃素治療后上述蛋白表達(dá)水平呈劑量依賴性降低,提示姜黃素能夠抑制EM大鼠異位灶組織中PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路激活。在心肺旁手術(shù)誘導(dǎo)的腦損傷中,使用PI3K抑制劑降低AKT和GSK3β磷酸化水平可減輕腦組織的炎癥反應(yīng),抵制腦損傷,因此推測(cè)姜黃素可能通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT/GSK3β途徑降低異位灶組織的炎癥反應(yīng),從而達(dá)到抑制EM異位灶組織生長(zhǎng)的效果,但姜黃素干預(yù)下EM大鼠異位灶組織肥大細(xì)胞活化受到抑制是否與PI3K/AKT/GSK3β途徑相關(guān)尚待更深入的探索[21]。

    綜上所述,姜黃素能夠抑制EM異位灶組織生長(zhǎng),可能與抑制PI3K/AKT/GSK3β信號(hào)通路、降低肥大細(xì)胞活化及炎癥反應(yīng)相關(guān),揭示了姜黃素用于治療EM的潛在價(jià)值。但EM是一種多因素疾病,機(jī)制比較復(fù)雜,因此本課題組將進(jìn)一步聯(lián)合動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)以期提供更多數(shù)據(jù)支持姜黃素在EM病理學(xué)中的治療效果。

    猜你喜歡
    肥大細(xì)胞姜黃異位
    Curcumin in The Treatment of in Animals Myocardial ischemia reperfusion: A Systematic review and Meta-analysis
    《大鼠及小鼠原代肥大細(xì)胞表面唾液酸受體的表達(dá)》圖版
    姜黃提取物二氧化硅固體分散體的制備與表征
    中成藥(2018年2期)2018-05-09 07:19:43
    姜黃素對(duì)人胃癌AGS細(xì)胞自噬流的作用
    中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:37
    自發(fā)型宮內(nèi)妊娠合并異位妊娠1 例報(bào)道
    米非司酮結(jié)合MTX用于異位妊娠治療效果觀察
    中西醫(yī)聯(lián)合保守治療異位妊娠80例臨床觀察
    姜黃素與p38MAPK的研究進(jìn)展
    中西醫(yī)結(jié)合保守治療異位妊娠46例
    肥大細(xì)胞在抗感染免疫作用中的研究進(jìn)展
    日本av免费视频播放| 久久久久久久精品精品| 99精品久久久久人妻精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久av网站| h视频一区二区三区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 一级a爱视频在线免费观看| 91精品伊人久久大香线蕉| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲美女黄色视频免费看| 欧美精品一区二区大全| 黄色一级大片看看| avwww免费| 丁香六月天网| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 人人澡人人妻人| 国产精品人妻久久久影院| 看非洲黑人一级黄片| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲av电影在线进入| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品人妻在线不人妻| 婷婷色av中文字幕| 国产黄色视频一区二区在线观看| 午夜福利视频精品| 精品一区在线观看国产| 精品久久久久久电影网| 街头女战士在线观看网站| av网站免费在线观看视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 欧美变态另类bdsm刘玥| 乱人伦中国视频| 日韩一区二区三区影片| 精品久久久精品久久久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 美女主播在线视频| 一区二区三区精品91| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 亚洲第一av免费看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 2021少妇久久久久久久久久久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 成人三级做爰电影| 成人三级做爰电影| 在线观看三级黄色| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国产99久久九九免费精品| 国产精品人妻久久久影院| 少妇被粗大的猛进出69影院| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久精品国产欧美久久久 | 国产精品三级大全| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 色精品久久人妻99蜜桃| av.在线天堂| 日韩一区二区视频免费看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 悠悠久久av| 亚洲熟女毛片儿| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 下体分泌物呈黄色| 2021少妇久久久久久久久久久| 久久韩国三级中文字幕| 9191精品国产免费久久| 天美传媒精品一区二区| 亚洲国产精品一区三区| av天堂久久9| 天堂8中文在线网| 精品第一国产精品| 黄色怎么调成土黄色| 日本av手机在线免费观看| 两个人看的免费小视频| 久久影院123| 午夜久久久在线观看| 亚洲综合色网址| 亚洲综合色网址| 亚洲精品国产色婷婷电影| 青春草亚洲视频在线观看| 一级片'在线观看视频| svipshipincom国产片| 欧美国产精品一级二级三级| 中文字幕最新亚洲高清| 国产亚洲欧美精品永久| 桃花免费在线播放| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 亚洲人成电影观看| 国产黄色免费在线视频| 国产精品偷伦视频观看了| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 波多野结衣一区麻豆| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品国产一区二区久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 一区在线观看完整版| 久久久久久久久久久免费av| 视频区图区小说| 女人精品久久久久毛片| 99re6热这里在线精品视频| 成人影院久久| 国产精品 国内视频| 久久久亚洲精品成人影院| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 免费高清在线观看日韩| 精品酒店卫生间| 国产毛片在线视频| 最近的中文字幕免费完整| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 人成视频在线观看免费观看| 国产免费福利视频在线观看| 免费高清在线观看日韩| 波野结衣二区三区在线| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产精品一区二区在线观看99| 不卡视频在线观看欧美| 日韩一区二区视频免费看| 免费看不卡的av| 日本黄色日本黄色录像| 1024香蕉在线观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 丁香六月天网| 性色av一级| 少妇 在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 婷婷色av中文字幕| 亚洲精品中文字幕在线视频| 欧美成人精品欧美一级黄| 伊人久久国产一区二区| 午夜福利视频在线观看免费| 伊人久久国产一区二区| 波多野结衣av一区二区av| 青春草视频在线免费观看| 两个人免费观看高清视频| 久久婷婷青草| 精品视频人人做人人爽| 精品人妻在线不人妻| 一级黄片播放器| 我的亚洲天堂| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲国产精品一区三区| 免费观看性生交大片5| 看免费av毛片| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲色图综合在线观看| 在线观看免费高清a一片| 亚洲国产最新在线播放| 咕卡用的链子| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 色婷婷久久久亚洲欧美| 一级毛片我不卡| 在线观看免费高清a一片| 一区二区三区乱码不卡18| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产乱来视频区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一级爰片在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 国产欧美亚洲国产| 国产av码专区亚洲av| 色精品久久人妻99蜜桃| 日本午夜av视频| 亚洲国产av新网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 综合色丁香网| 精品国产国语对白av| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 韩国高清视频一区二区三区| 九九爱精品视频在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲国产精品999| 看十八女毛片水多多多| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久99精品国语久久久| 少妇的丰满在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产在线一区二区三区精| 午夜免费观看性视频| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲第一区二区三区不卡| 在线观看免费日韩欧美大片| 成人国产麻豆网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲精品久久午夜乱码| 午夜91福利影院| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 亚洲少妇的诱惑av| 在线精品无人区一区二区三| kizo精华| 国产野战对白在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲国产av新网站| 久久热在线av| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av在线观看美女高潮| 精品人妻在线不人妻| 大香蕉久久网| 十八禁人妻一区二区| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产1区2区3区精品| 国产日韩欧美视频二区| 欧美在线黄色| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 日本av免费视频播放| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲色图综合在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 韩国精品一区二区三区| 国产色婷婷99| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日本wwww免费看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 久久精品亚洲av国产电影网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 卡戴珊不雅视频在线播放| 最近2019中文字幕mv第一页| av在线app专区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 欧美在线一区亚洲| 久久这里只有精品19| 男女国产视频网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 99热全是精品| tube8黄色片| kizo精华| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美国产精品一级二级三级| 亚洲四区av| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 又大又黄又爽视频免费| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 中文字幕高清在线视频| 老司机亚洲免费影院| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日本午夜av视频| svipshipincom国产片| 午夜日韩欧美国产| 欧美亚洲日本最大视频资源| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美激情高清一区二区三区 | 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 久久人人爽人人片av| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 欧美变态另类bdsm刘玥| 大话2 男鬼变身卡| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 青青草视频在线视频观看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲精品视频女| 国产激情久久老熟女| 嫩草影院入口| 亚洲av综合色区一区| 国产午夜精品一二区理论片| 精品免费久久久久久久清纯 | 免费看av在线观看网站| 国产不卡av网站在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久久久精品久久久久真实原创| 欧美久久黑人一区二区| 欧美日韩精品网址| 久久狼人影院| 免费观看人在逋| 最近最新中文字幕免费大全7| 美女福利国产在线| 性色av一级| 欧美黑人欧美精品刺激| 大香蕉久久成人网| 久久ye,这里只有精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 两个人看的免费小视频| 99热全是精品| 欧美变态另类bdsm刘玥| 亚洲av日韩在线播放| 在线观看三级黄色| 午夜日韩欧美国产| 久久人人97超碰香蕉20202| 不卡视频在线观看欧美| 一区在线观看完整版| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品 国内视频| 午夜久久久在线观看| 丝袜脚勾引网站| 精品亚洲成a人片在线观看| 99国产综合亚洲精品| 欧美日韩一级在线毛片| 看免费av毛片| 亚洲精品国产区一区二| 国产成人一区二区在线| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲国产精品国产精品| 免费高清在线观看日韩| 桃花免费在线播放| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久久久人妻| 国产成人一区二区在线| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美精品av麻豆av| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久毛片免费看一区二区三区| 日韩av在线免费看完整版不卡| √禁漫天堂资源中文www| 一级a爱视频在线免费观看| 精品视频人人做人人爽| 天天操日日干夜夜撸| 欧美另类一区| 亚洲五月色婷婷综合| 精品人妻在线不人妻| 欧美精品一区二区大全| 国产精品免费大片| 欧美精品亚洲一区二区| 久久毛片免费看一区二区三区| 日韩大码丰满熟妇| 丰满乱子伦码专区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日韩中文字幕视频在线看片| 毛片一级片免费看久久久久| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品.久久久| 亚洲国产av影院在线观看| 91精品伊人久久大香线蕉| av在线老鸭窝| 丝袜人妻中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 男人舔女人的私密视频| 黄色视频不卡| 性少妇av在线| 丰满少妇做爰视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 人成视频在线观看免费观看| svipshipincom国产片| 一边摸一边做爽爽视频免费| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲国产最新在线播放| 丝袜喷水一区| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 黑人欧美特级aaaaaa片| 丝袜喷水一区| 久久亚洲国产成人精品v| 观看av在线不卡| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 美女午夜性视频免费| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久影院123| 亚洲国产精品国产精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 麻豆乱淫一区二区| 成年人免费黄色播放视频| 操出白浆在线播放| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 一个人免费看片子| 日韩一本色道免费dvd| 最近中文字幕高清免费大全6| 日日啪夜夜爽| 久久99一区二区三区| 丰满迷人的少妇在线观看| 中文字幕制服av| 男女之事视频高清在线观看 | 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产视频首页在线观看| 亚洲av综合色区一区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲av综合色区一区| 天天添夜夜摸| www.精华液| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 热re99久久精品国产66热6| 香蕉丝袜av| 久久午夜综合久久蜜桃| 三上悠亚av全集在线观看| 成年美女黄网站色视频大全免费| 制服人妻中文乱码| 国产一区有黄有色的免费视频| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 欧美97在线视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 无限看片的www在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 99香蕉大伊视频| 老司机影院成人| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产一区亚洲一区在线观看| 丝袜在线中文字幕| 国产有黄有色有爽视频| 欧美久久黑人一区二区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 超色免费av| 超碰成人久久| 亚洲久久久国产精品| 亚洲av福利一区| 美女视频免费永久观看网站| 免费观看av网站的网址| 人人澡人人妻人| 男人舔女人的私密视频| 伊人亚洲综合成人网| 美女福利国产在线| 考比视频在线观看| 一区二区av电影网| 水蜜桃什么品种好| 美女高潮到喷水免费观看| 国产成人啪精品午夜网站| 国产爽快片一区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 黄色毛片三级朝国网站| 在线观看免费视频网站a站| 99热国产这里只有精品6| 丝袜脚勾引网站| 国产免费现黄频在线看| 欧美中文综合在线视频| 亚洲图色成人| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲综合精品二区| 男女床上黄色一级片免费看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 天堂俺去俺来也www色官网| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 搡老岳熟女国产| 99热国产这里只有精品6| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久精品人人爽人人爽视色| 久久久久人妻精品一区果冻| tube8黄色片| 看非洲黑人一级黄片| 婷婷色av中文字幕| 亚洲国产欧美一区二区综合| 大片免费播放器 马上看| 欧美黑人欧美精品刺激| 中文字幕高清在线视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 久久性视频一级片| 成年人午夜在线观看视频| 免费高清在线观看日韩| 免费观看性生交大片5| 亚洲人成网站在线观看播放| 各种免费的搞黄视频| 国产精品久久久久久久久免| 男女边摸边吃奶| 精品国产国语对白av| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲av福利一区| 中文字幕亚洲精品专区| 一级片免费观看大全| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 捣出白浆h1v1| www.熟女人妻精品国产| 久久久国产欧美日韩av| 制服诱惑二区| 秋霞在线观看毛片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品一区蜜桃| 成人手机av| 一级a爱视频在线免费观看| 香蕉丝袜av| 亚洲成人手机| 精品少妇黑人巨大在线播放| √禁漫天堂资源中文www| 精品人妻一区二区三区麻豆| 中文字幕人妻熟女乱码| 秋霞在线观看毛片| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲欧美清纯卡通| 国产在线视频一区二区| 久久久精品94久久精品| 午夜影院在线不卡| 成人国语在线视频| 亚洲伊人色综图| 成人国产麻豆网| 成年av动漫网址| 欧美日韩一级在线毛片| 免费黄色在线免费观看| 国产免费福利视频在线观看| 99九九在线精品视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 精品第一国产精品| 国产又色又爽无遮挡免| 国产精品免费大片| 免费少妇av软件| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲少妇的诱惑av| 操美女的视频在线观看| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美精品一区二区免费开放| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲精品国产av成人精品| 看十八女毛片水多多多| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲成人国产一区在线观看 | 极品人妻少妇av视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 欧美精品一区二区免费开放| 久久人人爽人人片av| 日韩av不卡免费在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产成人精品久久久久久| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲人成77777在线视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 男女床上黄色一级片免费看| 国产高清国产精品国产三级| 日韩欧美一区视频在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| av在线app专区| 少妇人妻久久综合中文| av线在线观看网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 91国产中文字幕| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久久精品性色| 人体艺术视频欧美日本| 91精品伊人久久大香线蕉| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 日韩一区二区视频免费看| 大码成人一级视频| 丝袜喷水一区| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲成人免费av在线播放| 国产一区二区在线观看av| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 在线 av 中文字幕| 女性生殖器流出的白浆| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| www日本在线高清视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 精品国产乱码久久久久久男人| 中文字幕色久视频| 亚洲综合精品二区| 国产色婷婷99| 亚洲一区二区三区欧美精品| 一本大道久久a久久精品| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲成人手机| 亚洲人成77777在线视频| 精品国产国语对白av| 人体艺术视频欧美日本| 一本大道久久a久久精品| 制服丝袜香蕉在线| 国产精品久久久久久精品电影小说| 亚洲精品aⅴ在线观看| a级毛片黄视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美成人午夜精品| 国产精品成人在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品在线美女| 午夜av观看不卡| 如何舔出高潮| 亚洲av成人精品一二三区| 97在线人人人人妻| 最新在线观看一区二区三区 | 一本久久精品| 高清黄色对白视频在线免费看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 大话2 男鬼变身卡| 在线 av 中文字幕| 日韩一本色道免费dvd| 秋霞在线观看毛片| 街头女战士在线观看网站| 婷婷成人精品国产| bbb黄色大片| 嫩草影视91久久| 日韩制服骚丝袜av| 欧美av亚洲av综合av国产av | 国产成人系列免费观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产一区二区 视频在线| 岛国毛片在线播放| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲国产日韩一区二区| 看免费av毛片| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产片特级美女逼逼视频| 国产成人精品久久久久久| 最近的中文字幕免费完整| 街头女战士在线观看网站| 美女视频免费永久观看网站| 久久这里只有精品19| 十八禁高潮呻吟视频| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲精品久久成人aⅴ小说|