龍膽苦苷下調(diào)LINC00520對肺癌細胞A549增殖和遷移的影響

薛晴 （蘇州第九人民醫(yī)院內(nèi)科，蘇州 215200）

肺癌是一種惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率。盡管在最近幾十年中肺癌的診斷和治療取得了進步，但是患者的5年總生存率并未顯著提高［1］。約80%的肺癌患者被診斷出處于晚期，預后較差［2］。癌癥細胞遷移影響肺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)，實驗證明選擇抑制癌細胞生長和轉(zhuǎn)移作為肺癌的臨床治療方案［3］。因此，需要進一步研究肺癌轉(zhuǎn)移的潛在分子機制，以確定新的治療方案。既往研究顯示，龍膽根的甲醇提取物以劑量依賴性方式抑制肺癌細胞系HOP‐62和急性單核細胞白血病細胞系THP‐1癌細胞的生長，具有抗增殖特性［4］。龍膽苦苷是中藥龍膽主要的活性成分，能夠抑制肝癌HepG2和SMMC‐7721細胞的增殖，還對上皮性卵巢癌HO8910細胞表現(xiàn)出抗增殖、抗遷移和促凋亡作用［5‐7］。非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）LINC00520位于人類染色體14q22.3，長度約為20 kb，是多種人類癌癥致癌性的重要調(diào)節(jié)劑［8］。資料表明，LINC00520在喉鱗狀細胞癌組織、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中過表達，并且LINC00520可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，但促進細胞凋亡［9‐10］。JIN等［11］在結(jié)直腸癌組織和細胞系中檢測到了高表達的LINC00520，并且這種高表達與患者不良的臨床病理參數(shù)以及較短的總生存期和無病生存期有關。在功能上，LINC00520的干擾導致結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移、集落形成和侵襲的能力顯著降低。然而尚未報道龍膽苦苷和LINC00520在肺癌中的確切作用。因此，本研究針對龍膽苦苷和LINC00520在肺癌細胞A549增殖、遷移中的功能進行考察，并進一步探索LINC00520是否參與龍膽苦苷介導的肺癌細胞增殖、遷移過程。

1 材料與方法

1.1 材料龍膽苦苷（含量97.1%）購自中國食品藥品檢定研究院，細胞A549購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）購自美國Gibco，LINC00520 siRNA si‐LINC00520、陰性對 照si‐NC、LINC00520過 表 達 質(zhì) 粒pcDNA‐LINC00520、pcDNA購 自 上 海 吉 瑪 公 司，Lipo-fectamine2000試劑購自美國Invitrogen公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Bio‐Rad公司，兔抗E‐鈣黏蛋白（E‐cadherin）、兔抗N‐鈣黏蛋白（N‐cadherin）、兔抗甘油醛‐3‐磷酸脫氫酶（glyceraldehyde‐3‐phosphate dehydrogenase，GAP-DH）抗體購自英國Abcam公司，標記羊抗兔IgG/HRP二抗購自北京博奧森公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與實驗分組A549細胞在10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)，并將細胞維持在37℃和5%CO2條件下。處于對數(shù)生長期的A549細胞被分為以下幾組：對照組（正常培養(yǎng)）、龍膽苦苷低、中、高劑量組（10、20、40 μmol/L龍膽苦苷）、si‐NC組（轉(zhuǎn)染si‐NC）、si‐LINC00520組（轉(zhuǎn)染si‐LINC00520）、龍膽苦苷高劑量+pcDNA組（轉(zhuǎn)染pcDNA+40μmol/L龍膽苦苷）、龍膽苦苷高劑量+pcDNA‐LINC00520組（轉(zhuǎn)染pcDNA‐LINC00520+40 μmol/L龍膽苦苷）［7］。龍膽苦苷的給藥時間均為48 h。通過使用Lipo-fectamine2000試劑將si‐LINC00520，si‐NC，pcDNA‐LINC00520和pcDNA轉(zhuǎn)染到A549細胞中。首先，將A549細胞接種于6孔板（1×105個/孔）中培養(yǎng)24 h。當細胞密度達到70%時，按照Lipofectamine2000的指示，將si‐LINC00520，si‐NC，pcDNA‐LINC00520和pcDNA轉(zhuǎn)染A549細胞6 h，轉(zhuǎn)染的A549細胞在含10%胎牛血清的新培養(yǎng)基中再放置24 h。之后，用40μmol/L龍膽苦苷處理轉(zhuǎn)染pcDNA‐LINC00520和pcDNA的A549細胞48 h。轉(zhuǎn)染效率的驗證采用qRT‐PCR進行。

1.2.2 qRT‐PCR測定LⅠNC00520表達按照制造商指定步驟使用TRIzol試劑從A549細胞中提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄后使用ABI StepOnePlus系統(tǒng)進行擴增 反 應。引 物 如 下：LINC00520正 向5'‐CCT-GCTCCTTCAGGGACATC‐3'和LINC00520反 向5'‐TCCGCCCCTTGCTCAAATAG‐3'；GAPDH正 向5'‐GTCAACGGATTTGGTCTGTATT‐3'和GAPDH反 向5'‐AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT‐3'。GAPDH為內(nèi)參，用2‐ΔΔCt法計算LINC00520相對表達水平。

1.2.3 MTT法檢測細胞活性接種于A549細胞（1×104個/孔）96孔板中以1.2.1中分組處理于37℃孵育48 h。將20μl的MTT（5 mg/ml）溶液添加到孔中，再孵育4 h。隨后，將100μl二甲基亞砜添加至孔中以溶解甲瓚晶體，并使用酶標儀在490 nm的波長處測量光密度OD值。

1.2.4 克隆形成實驗測定細胞克隆形成A549接種在6孔板（50個/孔）中24 h，然后以1.2.1中分組處理。2周后，A549細胞用3∶1甲醇‐乙酸固定，并在室溫下用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。染色板干燥后通過顯微鏡計數(shù)。

1.2.5 Transwell實驗評估細胞遷移將1.2.1處理的A549細胞懸浮于500 μl無血清DMEM培養(yǎng)基。將A549細胞（1×105個）移到Transwell（孔徑為8μm）的上腔室中，并在Transwell下腔室補充500μl含血清DMEM培養(yǎng)基。37℃下孵育48 h，隨后用4%多聚甲醛固定5 min，并在37℃下用0.1%結(jié)晶紫染色30 min。使用Olympus倒置顯微鏡（放大倍數(shù)×200）在至少5個隨機選擇的視野中對遷移的A549細胞進行計數(shù)。

1.2.6 Western blot分 析E‐cadherin和N‐cadherin表達使用含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀分析RIPA裂解緩沖液從A549細胞中提取總蛋白。通過BCA蛋白質(zhì)測定法確定蛋白濃度。在10%十二烷基硫酸鈉‐聚丙烯酰胺凝膠電泳上80 V分離等量蛋白。然后將分離的蛋白在350 mA下轉(zhuǎn)移至PVDF膜2 h。將膜在室溫下用5%封閉液處理1 h，與一抗在4℃孵育過夜：兔抗E‐cadherin（1∶1 000），兔 抗N‐cadherin（1∶1 000）和 兔 抗GAPDH（1∶2 000）。用Tris‐HCl‐Tween緩沖鹽溶液洗膜以去除未結(jié)合的抗體。添加二抗（標記羊抗兔IgG/HRP抗體），并在室溫下孵育1 h。使用ECL顯示蛋白信號，并使用Image J軟件掃描蛋白條帶的強度。以GAP-DH為參照，分析E‐cadherin和N‐cadherin相對蛋白表達。

1.3 統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料表示為±s。采用單因素方差分析進行多組間差異比較，SNK-q檢驗進行組間多重比較，t檢驗進行兩組間差異比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 龍膽苦苷對A549細胞活性和克隆形成的影響如圖1、表1所示，與對照組相比，龍膽苦苷低劑量組A549細胞的活性、克隆形成數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組或龍膽苦苷低劑量組相比，龍膽苦苷中、高劑量組A549細胞的活性、克隆形成數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與龍膽苦苷中劑量組相比，龍膽苦苷高劑量組A549細胞的活性、克隆形成數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 龍膽苦苷對A549克隆形成的檢測Fig.1 Detection of A549 clone formation by gentiopicro-side

2.2 龍膽苦苷對A549遷移及LⅠNC00520表達的影響如表2、圖2所示，與對照組相比，龍膽苦苷低劑量組A549細胞的LINC00520表達量、遷移細胞數(shù)、E‐cadherin蛋白和N‐cadherin蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組或龍膽苦苷低劑量組相比，龍膽苦苷中、高劑量組A549細胞的LINC00520表達量減少，遷移細胞數(shù)減少，E‐cad-herin蛋白水平升高，N‐cadherin蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與龍膽苦苷中劑量組相比，龍膽苦苷高劑量組A549細胞的LINC00520表達量減少，遷移細胞數(shù)減少，E‐cadherin蛋白水平升高，N‐cadherin蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 干擾LⅠNC00520對A549細胞活性和克隆形成的影響如表3、圖3所示，si‐LINC00520組A549細胞活性和克隆形成數(shù)低于si‐NC組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 A549細胞活性和克隆形成的檢測（±s，n=3）Tab.1 Detection of A549 cell viability and clone forma-tion（±s，n=3）

表1 A549細胞活性和克隆形成的檢測（±s，n=3）Tab.1 Detection of A549 cell viability and clone forma-tion（±s，n=3）

Note：Compared with the control group，1）P＜0.05；Compared with the low dose gentiopicroside group，2）P＜0.05；Compared with the me-dium dose gentiopicroside group，3）P＜0.05.

Clone formation number 104.67±3.09 104.67±2.87 79.67±2.361）2）55.67±2.051）2）3）240.519 0.000 Groups OD 490 nm Control Low dose gentiopicroside Medium dose gentiopicroside High dose gentiopicroside F P 1.16±0.08 1.15±0.06 0.85±0.041）2）0.63±0.041）2）3）59.583 0.000

表2 A549遷移細胞數(shù)及LINC00520表達的檢測（±s，n=3）Tab.2 Detection of A549 migration cell number and LINC00520 expression（±s，n=3）

表2 A549遷移細胞數(shù)及LINC00520表達的檢測（±s，n=3）Tab.2 Detection of A549 migration cell number and LINC00520 expression（±s，n=3）

Note：Compared with the control group，1）P＜0.05；compared with the low dose gentiopicroside group，2）P＜0.05；compared with the medium dose gen-tiopicroside group，3）P＜0.05.

N‐cadherin protein 0.77±0.05 0.76±0.05 0.51±0.041）2）0.23±0.021）2）3）111.586 0.000 Groups Control Low dose gentiopicroside Medium dose gentiopicroside High dose gentiopicroside F P LINC00520 1.01±0.04 1.00±0.05 0.71±0.041）2）0.48±0.021）2）3）127.607 0.000 Migration cells Number 230.33±3.30 228.33±4.11 182.33±3.301）2）132.00±2.941）2）3）547.500 0.000 E‐cadherin protein 0.14±0.01 0.14±0.01 0.34±0.021）2）0.58±0.031）2）3）349.867 0.000

2.4 干擾LⅠNC00520對A549遷移的影響如表4、圖4所示，干擾LINC00520后，si‐LINC00520組A549細胞的LINC00520的表達量為0.29±0.02，遠遠低于si‐NC組的0.99±0.05。并且，與si‐NC組相比si‐LINC00520組減少遷移細胞數(shù)，提高E‐cadherin蛋白水平，并且降低N‐cadherin蛋白水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.5 過表達LⅠNC00520對龍膽苦苷處理的A549細胞活性和克隆形成的影響如表5、圖5所示，龍膽苦苷高劑量+pcDNA‐LINC00520組A549細胞活性和克隆形成數(shù)均高于龍膽苦苷高劑量+pcDNA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 龍膽苦苷對A549中E‐cadherin、N‐cadherin蛋白表達的影響Fig.2 Effect of gentiopicroside on the expression of E‐cad-herin and N‐cadherin in A549

表3 干擾LINC00520表達的A549細胞活性和克隆形成的檢測（±s，n=3）Tab.3 Activity and clonal formation of A549 cells inter-fering with LINC00520 expression（±s，n=3）

表3 干擾LINC00520表達的A549細胞活性和克隆形成的檢測（±s，n=3）Tab.3 Activity and clonal formation of A549 cells inter-fering with LINC00520 expression（±s，n=3）

Note：Compared with the si‐NC group，1）P＜0.05.

Clone formation number 104.67±3.30 47.67±1.701）26.596 0.000 Groups si‐NC si‐LINC00520 t P OD 490 nm 1.16±0.08 0.50±0.031）13.380 0.000

圖3 干擾LINC00520對A549克隆形成的檢測Fig.3 Detection of A549 clone formation by interference with LINC00520

2.6 過表達LⅠNC00520對龍膽苦苷處理的A549遷移的影響如表6、圖6所示，龍膽苦苷高劑量+pcDNA‐LINC00520組A549細胞的LINC00520的表達量、遷移細胞數(shù)高于龍膽苦苷高劑量+pcDNA組，E‐cadherin蛋白水平低于龍膽苦苷高劑量+pcDNA組，以及N‐cadherin蛋白水平高于龍膽苦苷高劑量+pcDNA組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表4 干擾LINC00520表達的A549遷移細胞數(shù)的檢測（±s，n=3）Tab.4 Detection of A549 migration cells interfering with LINC00520 expression（±s，n=3）

表4 干擾LINC00520表達的A549遷移細胞數(shù)的檢測（±s，n=3）Tab.4 Detection of A549 migration cells interfering with LINC00520 expression（±s，n=3）

Note：Compared with the si‐NC group，1）P＜0.05.

N‐cadherin protein 0.78±0.05 0.13±0.011）22.079 0.000 Groups LINC00520 si‐NC si‐LINC00520 t P 0.99±0.05 0.29±0.021）22.514 0.000 Migration cells Number 230.67±3.30 112.00±2.451）50.010 0.000 E‐cadherin protein 0.13±0.01 0.67±0.041）22.685 0.000

圖4 干擾LINC00520對A549中E‐cadherin、N‐cadherin蛋白表達的影響Fig.4 Effect of LINC00520 interference on the expression of E‐cadherin and N‐cadherin in A549

表5 過表達LINC00520對龍膽苦苷處理的A549細胞活性和克隆形成的檢測（±s，n=3）Tab.5 Detection of cell viability and clone formation of gentiopicroside treated A549 cells by overexpres-sion of LINC00520（±s，n=3）

表5 過表達LINC00520對龍膽苦苷處理的A549細胞活性和克隆形成的檢測（±s，n=3）Tab.5 Detection of cell viability and clone formation of gentiopicroside treated A549 cells by overexpres-sion of LINC00520（±s，n=3）

Note：Compared with the high dose gentiopicroside+pcDNA group，1）P＜0.05.

Groups OD 490 nm High dose gentiopicroside+pcDNA High dose gentiopicroside+pcDNA‐LINC00520 0.63±0.03 Clone forma-tion number 56.00±2.16 1.07±0.051）92.67±2.871）17.682 0.000 t P 13.070 0.000

表6 過表達LINC00520對龍膽苦苷處理的A549遷移細胞數(shù)的檢測（±s，n=3）Tab.6 Number of A549 migration cells treated with gentiopicroside by overexpression of LINC00520（±s，n=3）

表6 過表達LINC00520對龍膽苦苷處理的A549遷移細胞數(shù)的檢測（±s，n=3）Tab.6 Number of A549 migration cells treated with gentiopicroside by overexpression of LINC00520（±s，n=3）

Note：Compared with the high dose gentiopicroside+pcDNA group，1）P＜0.05.

Groups High dose gentiopicroside+pcDNA High dose gentiopicroside+pcDNA‐LINC00520 LINC00520 Migration cells number E‐cadherin protein N‐cadherin protein 0.48±0.03 130.67±2.87 0.58±0.03 0.23±0.02 0.86±0.051）217.67±3.681）0.23±0.021）0.62±0.041）15.105 0.000 t P 11.288 0.000 31.865 0.000 16.813 0.000

圖5 過表達LINC00520對龍膽苦苷處理的A549克隆形成的檢測Fig.5 Detection of gentiopicroside treated A549 clone by overexpression of LINC00520

圖6 過表達LINC00520對龍膽苦苷處理的A549中E‐cad-herin、N‐cadherin蛋白表達的影響Fig.6 Effect of overexpression of LINC00520 on expres-sion of E‐cadherin and N‐cadherin in gentiopicro-side treated A549

3 討論

肺癌是致命的癌癥之一，急需開發(fā)出新穎的治療策略，以降低其發(fā)病率和死亡率。長期以來，植物來源的天然產(chǎn)物一直被認為是抗癌劑的來源［12‐13］。龍膽苦苷是一種重要的植物次生代謝產(chǎn)物，作為一種環(huán)烯醚萜苷類成分，它對癌癥的治療效果更好，毒性更低［14］。研究表明，龍膽苦苷通過劑量和時間依賴性來抑制細胞生長，誘導凋亡，并也通過抑制周期和抑制遷移對宮頸癌HeLa細胞表現(xiàn)出治療作用，而對正常細胞系HUVEC的抑制作用較?。?2］。LI等［15］觀察到龍膽苦苷對SKOV3卵巢癌細胞顯示出顯著的抗癌活性，這歸因于其誘導線粒體凋亡，細胞周期停滯以及抑制細胞遷移和侵襲。本研究對龍膽苦苷的抗肺癌作用進行評價，發(fā)現(xiàn)10 μmol/L龍膽苦苷對肺癌A549細胞增殖和遷移能力無明顯影響，而20 μmol/L、40 μmol/L龍膽苦苷能夠顯著減弱肺癌A549細胞的活性、克隆形成數(shù)、遷移細胞數(shù)、N‐cadherin蛋白表達，增強E‐cad-herin蛋白表達，且40μmol/L龍膽苦苷作用效果更顯著，這說明龍膽苦苷具有一定的抗肺癌能力。與前人研究［相吻合，為龍膽苦苷成為潛在的腫瘤抑制劑提供了新的證據(jù)［4，15］。

LINC00520是一種高度保守的lncRNA，在各種組織中廣泛表達。資料顯示，LINC00520在多種腫瘤中起作用，可能成為癌癥治療的有效靶標［16］。LINC00520高表達已在甲狀腺乳頭狀癌組織和細胞系中得到驗證，LINC00520干擾使甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖，遷移和體外侵襲顯著減少，并導致細胞凋亡增加［17］。LINC00520被發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤組織中過表達，其高表達是黑色素瘤患者預后的危險因素。LINC00520促進黑素瘤細胞的增殖，侵襲和遷移，發(fā)揮其致癌作用［18］。在頭頸部鱗狀細胞癌細胞和組織中，LINC00520被上調(diào)，沉默LINC00520可以促進放射敏感性，并抑制頭頸部鱗狀細胞癌中的細胞增殖，遷移［19］。由此可見，LINC00520是癌癥中的致癌因子。但是，到目前為止，尚未研究LINC00520在肺癌中的作用。在這項研究中，干擾LINC00520還被證明可以顯著抑制肺癌A549細胞的活性、克隆形成、遷移、N‐cadherin蛋白表達，促進E‐cadherin蛋白表達，顯示出抑制肺癌效果。

研究表明，一些天然成分對腫瘤細胞的毒性作用過程和機制涉及l(fā)ncRNA［20］。例如，鹽酸青藤堿通過抑制卵巢癌細胞中l(wèi)ncRNA HOST2表達發(fā)揮抗腫瘤作用，小檗堿誘導的結(jié)直腸癌細胞活力抑制和細胞凋亡激活是通過上調(diào)lncRNA CASC2實現(xiàn)的［21‐22］。但是，肺癌細胞中LINC00520與龍膽苦苷之間的特定功能關聯(lián)尚未可知。本實驗通過qRT‐PCR分析，發(fā)現(xiàn)A549細胞 中LINC00520表 達 被20 μmol/L、40 μmol/L龍膽苦苷所抑制，提示LINC00520可能是龍膽苦苷抗肺癌細胞增殖和遷移的重要調(diào)節(jié)劑。此外，功能獲得測定結(jié)果顯示，過表達LINC00520后，龍膽苦苷抑制A549細胞活性、克隆形成數(shù)、遷移細胞數(shù)、N‐cadherin蛋白表達的作用，和其促進E‐cadherin蛋白表達的作用被逆轉(zhuǎn)，說明龍膽苦苷通過下調(diào)LINC00520表達來發(fā)揮其抗肺癌作用。

總之，當前的研究表明，20 μmol/L、40 μmol/L龍膽苦苷可降低肺癌A549細胞的增殖和遷移能力。此外，機理研究表明，龍膽苦苷下調(diào)LINC00520的表達水平發(fā)揮其在肺癌中的抑制功能。因此，龍膽苦苷可能是肺癌患者的潛在治療藥物，靶向LINC00520可能作為龍膽苦苷抗肺癌作用的重要治療靶點。