• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    補腎活血方對抗磷脂綜合征小鼠母胎界面VEGF、HIF‐1α、TGF‐β、sflt‐1蛋白表達影響研究①

    2021-05-26 04:03:58韓永梅劉蔚霞肖惠冬子衛(wèi)愛武河南中醫(yī)藥大學(xué)鄭州450000
    中國免疫學(xué)雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:低劑量胚胎胎盤

    韓永梅 劉蔚霞肖惠冬子 衛(wèi)愛武(河南中醫(yī)藥大學(xué),鄭州 450000)

    抗磷脂綜合征(anti‐phosphoric syndrome,APS)是導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)的主要病因,以體內(nèi)產(chǎn)生大量抗磷脂抗體(an-tiphospholipid antibodies,APL)為特征[1]。APL通過抑制前列腺素,增加胎盤血栓素,促使低密度脂蛋白被滋養(yǎng)細胞氧化,抑制滋養(yǎng)細胞分化,造成胎盤功能不全,導(dǎo)致流產(chǎn)[2]。母胎界面血管發(fā)生和血管化是胎盤蛻膜毛細血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的基礎(chǔ)。研究表明RSA小鼠存在蛻膜血管減少、血管內(nèi)皮細胞破壞等病理變化,血管生長因子失衡是導(dǎo)致RSA的重要原因之一[3‐5]。本文研究補腎活血方對抗磷脂綜合征模型小鼠母胎界面VEGF、HIF‐1α、TGF‐β、sflt‐1蛋白表達的影響,探討APS致RSA的發(fā)病機制及治療機理。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物42只,6~8周齡BALB/c雌性小鼠,平均體重(20.00±0.20)g,購自遼寧長生生物技術(shù)股份公司,SPF級,許可證號:SCXK(遼)2015‐0001,屏障環(huán)境標準飼養(yǎng),恒定濕度(40%~55%)及恒定溫度(25±1℃),高壓滅菌的水和標準飼料供動物自由食用。連續(xù)觀察1周無異常者入組實驗。實驗研究過程嚴格遵守減量化、再利用和再循環(huán)的原則。本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查通過,倫理審查編號2009HL‐053‐03。

    1.1.2 主要試劑與藥品全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、一抗二抗去除液、SDS‐PAGE凝膠快速制備試劑盒、Western洗滌液、SDS‐PAGE蛋白上樣緩沖液、HIF‐1α antibody、VEGF antibody、TGF‐β1 antibody、sflt‐1 antibody、羊抗兔IgG‐HRP、內(nèi)參抗體β‐actin(萬類生物有限公司)。補腎活血方藥:菟絲子30 g、桑寄生15 g、續(xù)斷15 g、阿膠15 g、當(dāng)歸10 g、熟地黃20 g、川芎6 g、黨參20 g、白術(shù)15 g、海螵蛸12 g、藕節(jié)炭15 g、白芍30 g、炙甘草6 g,采用江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的顆粒劑型,由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院顆粒劑藥房提供。腸溶阿司匹林片,北京中新藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批準文號,國藥準字H13023461,規(guī)格25 mg。

    1.1.3 實驗儀器水平搖床(北京六一,型號:WD‐9405B)、電泳儀(北京六一,型號:DYY‐7C)、轉(zhuǎn)移槽(北京六一,型號:DYCZ‐40D)、超速冷凍離心機(湖南湘儀,型號:H‐2050R)、酶標儀(美國BIOTEK,型號:ELX‐800)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特,型號:DH36001B)。

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組與造模方法將42只小鼠隨機分為正常妊娠組、模型組、模型對照組、補腎活血高劑量組、補腎活血低劑量組、陽性對照組,每組動物數(shù)均為6只。模型組、高劑量組、低劑量組、阿司匹林組:造模第1天雌性小鼠宮腔內(nèi)注射(采用自制的注射器,將毛細玻璃管進行均勻加熱,將融化的尖端拉長至3 cm,直徑為1 mm,然后將其連接到1 ml注射器,用石蠟密封。將小鼠麻醉后腹部消毒,剪開皮膚逐層分離暴露子宮,采用自制注射器進行宮腔內(nèi)注射。注射完成后,逐層縫合傷口。)10 ug弗氏完全佐劑CFA乳化的人β2GP‐1進行免疫;第8天再次用弗氏不完全佐劑IFA乳化的10 ug人β2GP‐1免疫小鼠。模型對照組:造模第1天雌性小鼠宮腔注射等劑量的CFA進行免疫;第8天再次注射等劑量的IFA進行免疫。正常妊娠組:不行免疫。第18天將各組雌性小鼠與雄性小鼠連夜配對。第19天早上檢測出陰道栓的雌鼠納入實驗,確定為實驗開始第0天。各組小鼠頜下采血0.5 ml,應(yīng)用ELISA方法檢測血清抗β2糖蛋白抗體1抗體(anti‐β2GP‐1);應(yīng)用APTT檢測試劑盒(高嶺土激活)檢測血漿活化部分凝血活酶時間(APTT);應(yīng)用血細胞自動分析儀檢測靜脈血血小板計數(shù)(PLT)。如小鼠anti‐β2GP‐1滴度明顯升高,APTT明顯延長,PLT明顯降低,提示孕鼠抗磷脂綜合征實驗?zāi)P驮炷3晒Γ?‐8]。

    1.2.2 給藥方法正常妊娠組、模型組、模型對照組等容量蒸餾水灌胃,每日1次。其余3組給藥劑量參照徐叔云主編《藥理實驗方法學(xué)》(第三版)方法計算:小鼠20 g與70 Kg人換算關(guān)系是0.0026,計算低劑量組0.826 8 g/(kg·d)(相當(dāng)于臨床成人等效劑量1.5倍),高劑量1.653 6 g/(kg·d)(相當(dāng)于臨床成人等效劑量3倍)。陽性對照組腸溶阿司匹林片,按上法計算小鼠按0.585 mg/(kg·d)(相當(dāng)于臨床成人等效劑量3倍)給藥,連續(xù)灌胃給藥15 d,每天2次。

    1.2.3 胚胎吸收率給藥結(jié)束后將小鼠腹腔注射200 mg/kg戊巴比妥鈉安樂處死,剪取子宮記錄正常胚胎數(shù)和流產(chǎn)胚胎數(shù),記錄被吸收胚胎數(shù)和存活胚胎數(shù)。胚胎吸收率計算公式:R=Re/(Re+F)×100%(R表示胚胎吸收率,Re表示吸收胚胎數(shù),F(xiàn)表示存活胚胎數(shù))[9]。

    1.2.4 Western blot檢測每個樣品剪取胎盤組織100 mg。提前將裂解液置于室溫融化,估算實驗所用體積進行分裝,并混入分裝體積1%的PMSF備用。根據(jù)每個樣本的質(zhì)量及體積加入相應(yīng)體積的裂解樣本,然后繼續(xù)置于冰上靜置5 min。開啟低溫冷凍離心機,12 000 r/min,4℃,離心10 min,分離上清為所得的蛋白質(zhì)抽提物。然后進行蛋白質(zhì)定量、SDS‐PAGE、轉(zhuǎn)印至PVDF膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗、ECL底物發(fā)光、圖像保存。將膠片進行掃描,用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel‐Pro‐Analyzer軟件)分析目標條帶的光密度值。

    1.2.5 胎盤組織HE染色取胎盤組織,生理鹽水清洗后,采用10%中性甲醛液固定,再進行包埋、切片脫蠟至水、蘇木素染色、鹽酸酒精分化、自來水返藍、伊紅染色、脫水、透明、封片、鏡檢。制成小鼠胎盤組織病理切片,用×200顯微鏡下觀察染色效果,進行拍照。

    1.2.6 指標檢測檢測各組小鼠胚胎吸收率;各組小鼠胎盤病理形態(tài)、螺旋動脈及滋養(yǎng)細胞情況;各組小鼠胎盤VEGF、TGF‐β1、HIF‐1α、sflt‐1的蛋白表達量。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。所得結(jié)果以±s表示,采用單因素方差分析(One‐Way ANOVA),采用Pearson分析進行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組胚胎丟失率的比較與正常妊娠組比較,模型組胚胎吸收率顯著升高(P<0.05);連續(xù)給藥15 d后,與模型組比較,補腎活血方高劑量組、低劑量組、阿司匹林組胚胎吸收率均顯著降低(P<0.05)。見表1。

    2.2 各組小鼠胎盤病理形態(tài)、螺旋動脈及滋養(yǎng)細胞分析見圖1、2,正常妊娠組:胎盤滋養(yǎng)細胞排列整齊,細胞規(guī)則,細胞核染色清晰,胞漿豐富,染色淡紅,細胞核位于中央。血管形態(tài)相對完好,血管數(shù)量正常,管壁完整,管壁內(nèi)未見明顯瘀血。模型對照組:與正常妊娠組類似。模型組:細胞排列紊亂,形態(tài)不規(guī)則,胞漿水腫,絕大部分細胞核消失、壞死、核固縮,細胞空泡樣變,組織空泡結(jié)構(gòu)明顯,細胞核染不清晰,細胞核固縮,甚至消失。血管內(nèi)皮細胞損傷,同時可見炎癥細胞浸潤。血管數(shù)量明顯減少,血管壁不完整,管壁內(nèi)見明顯瘀血。補腎活血方高劑量組:病理改變有較為明顯的減輕,胎盤滋養(yǎng)細胞有一定程度損傷,可見炎癥細胞浸潤和部分細胞空泡樣變,但較模型組減輕。補腎活血方低劑量組:病理改變有較為明顯的減輕,胎盤滋養(yǎng)細胞有一定程度損傷,可見炎癥細胞浸潤和部分細胞空泡樣變,但較模型組減輕。阿司匹林組:與模型組比較小鼠胎盤病理形態(tài)、螺旋動脈及滋養(yǎng)細胞均有改善。

    表1 各組小鼠胚胎吸收率比較(n=6)Tab.1 Comparison of embryo absorption rate of each group(n=6)

    圖1 各組小鼠胎盤滋養(yǎng)細胞HE染色(×200)Fig.1 HE staining of placental trophoblast of mice in each group(×200)

    圖2 各組小鼠胎盤螺旋動脈HE染色(×200)Fig.2 HE staining of placental spiral artery of mice in each group(×200)

    圖3 各組小鼠VEGF、TGF‐β1、HIF‐1α、sflt‐1蛋白表達量灰度圖Fig.3 Gray scale of VEGF,TGF‐β1,HIF‐1α and sflt‐1 protein expression in each group

    圖4 各組妊娠小鼠胎盤組織VEGF、HIF‐1α、TGF-β1、sflt‐1蛋白相對表達量比較Fig.4 Comparison of relative expression of VEGF,HIF‐1α,TGF‐β1,sflt‐1 protein in placenta of pregnant mice in each group

    圖5 VEGF、TGF‐β1蛋白表達量灰度分析比值相關(guān)性分析Fig.5 Correlation Analysis of gray scale analysis ratio of VEGF and TGF‐β1 protein expression

    2.3 小鼠胎盤組織中VEGF、TGF‐β1、HⅠF‐1α、sflt‐1的蛋白表達量與正常妊娠組比較,模型組妊娠小鼠VEGF蛋白表達顯著降低;與模型組比較,高劑量、低劑量組、阿司匹林組VEGF蛋白表達顯著升高;補腎活血方高劑量組VEGF蛋白表達顯著高于低劑量組及阿司匹林組。各組小鼠胎盤組織HⅠF‐1α蛋白表達量無顯著性差異。與正常妊娠組比較,模型組TGF‐β1蛋白表達顯著降低;與模型組比較,補腎活血方高劑量組、低劑量組、阿司匹林組TGF‐β1蛋白表達顯著升高。與正常妊娠組比較,模型組妊娠小鼠sflt‐1蛋白表達顯著升高;與模型組比較,補腎活血方高劑量組、低劑量組、阿司匹林組sflt‐1蛋白表達顯著下降;高劑量組sflt‐1的蛋白表達顯著低于低劑量組及阿司匹林組。見圖3、4。

    2.4 VEGF、TGF‐β1蛋白表達量灰度分析比值相關(guān)性分析VEGF、TGF‐β1蛋白表達量灰度分析比值呈明顯正相關(guān)(R2=0.999 6)。見圖5。

    3 討論

    RSA在中醫(yī)中屬“滑胎”范疇,先天腎氣不足,后天脾胃虛弱、房勞多產(chǎn)、憂思勞倦、跌撲閃挫、情志失宜等是其發(fā)病的主要因素。胞宮乃孕育之所,其生理特點為“瘀血不去,新血不生”,胞宮藏瀉失調(diào),血瘀阻滯胞宮,胎元失養(yǎng),故而“屢孕屢墮”。APS致RSA患者,辯證多屬血瘀,其病機以腎虛為本,血瘀為標,腎虛血瘀為其主要發(fā)病機制,中醫(yī)辨證以補腎活血多能奏效。目前有關(guān)VEGF、HIF‐1、TGF‐β、sflt‐1等血管活性因子對妊娠的影響,尤其是APS與母胎界面的血管活性因子的相關(guān)性研究較少。因此,本文針對APS小鼠,研究補腎活血方對母胎界面VEGF、HIF‐1、TGF‐β、sflt‐1蛋白表達的影響,探討中醫(yī)藥防治RSA的作用機制。

    VEGF具有促使血管內(nèi)皮細胞生長、分化、遷移,修復(fù)血管內(nèi)皮損傷,誘導(dǎo)血管生成,維持血管壁通透性、完整性等作用。妊娠期VEGF主要分布在滋養(yǎng)細胞、血管內(nèi)皮細胞中,促進滋養(yǎng)細胞的浸潤和分化,促使胎盤血管形成,維持血管通透性[10]。VEGF表達不足、血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移能力下降、血管通透性相關(guān)活性物質(zhì)下調(diào),胚胎血管、蛻膜血管、絨毛及胎盤血管生成障礙,導(dǎo)致流產(chǎn)[11]。VEGF在正常妊娠絨毛組織中表達率為100%,在稽留流產(chǎn)等病理妊娠絨毛組織中表達僅70%,RSA與VEGF的異常表達存在相關(guān)性[12‐14]。HIF‐1α是血管生成的啟動因子,通過誘導(dǎo)血管生成發(fā)揮作用[15‐16]。研究表明稽留流產(chǎn)絨毛組織中HIF‐1α表達上升,其蛋白過度表達抑制滋養(yǎng)細胞向侵入型分化,使滋養(yǎng)細胞侵入子宮螺旋動脈變淺,減少胚胎、胎盤血管灌注,胚胎缺血、缺氧導(dǎo)致流產(chǎn)[17‐18]。TGF‐β1主要表達于胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞,并調(diào)節(jié)胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞增殖、分化、浸潤。孕期TGF‐β1調(diào)控胎盤新生血管形成、血管通透性,促進胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞增殖[19]。TGF‐β1在RSA患者外周血的表達低于正常妊娠者,低濃度TGF‐β1使母體免疫失衡,炎癥反應(yīng)加劇,破壞胎盤血管形成[20‐21]。sflt‐1由胎盤合體滋養(yǎng)細胞分泌,具有抑制血管內(nèi)皮細胞有絲分裂,降低血管內(nèi)皮細胞增殖;破壞血管壁完整性、通透性,抗血管生成等作用[22]。RSA患者血清及絨毛中sflt‐1表達顯著高于正常人群[23]。可能與sflt‐1異常升高,加速VEGF滅活,抑制滋養(yǎng)細胞浸潤,阻礙蛻膜、胎盤血管形成,引起子宮螺旋小動脈循環(huán)障 礙 有 關(guān)[24]。研究認為檢測外周血sflt‐1對RSA的診斷有一定價值[25]。

    有關(guān)中藥對母胎界面血管活性因子影響的研究較少,大多以補腎健脾益氣為治療原則。有實驗研究結(jié)果表明補腎健脾中藥可上調(diào)流產(chǎn)小鼠模型蛻膜中VEGF的表達[26]。臨床研究認為補腎中藥可上調(diào)RSA患者外周血TGF‐β1表達,而補腎活血方可調(diào)節(jié)RSA患者血清中VEGF、sflt‐1水平,降低流產(chǎn)率,提高活產(chǎn)率[27‐28]。補腎活血方藥對APS致RSA外周血及母胎界面的血管活性因子的研究較少見。因此,針對本病腎虛血瘀的發(fā)病機制,本研究方藥以全國名老中醫(yī)王自平教授經(jīng)驗方為基礎(chǔ),以補腎活血為主旨,方中菟絲子補腎益精,固攝沖任以陰胎;桑寄生、續(xù)斷補益肝腎;阿膠滋養(yǎng)陰血安胎。當(dāng)歸養(yǎng)血活血;川芎活血祛瘀、行氣開郁;熟地黃補血滋陰、益精填髓。黨參補氣益、健脾養(yǎng)血;白術(shù)健脾益氣;補氣以推動血行,助當(dāng)歸、川芎祛瘀之效。上藥合用則腎精充、脾氣旺、祛瘀而不損胎。海螵蛸、藕節(jié)炭收斂止血、固攝沖任、清熱化瘀,止血而不留瘀滯。白芍緩急止痛,甘草調(diào)和諸藥。前期臨床研究表明:補腎活血方治療腎虛血瘀型APS致RSA療效顯著,提高中醫(yī)證候療效、抗磷脂抗體轉(zhuǎn)陰率及活產(chǎn)率[29]。其作用機制有待進一步深入研究。

    針對APS對母胎界面及胚胎的不良影響,補腎活血方藥可上調(diào)VEGF、TGF‐β1蛋白表達,下調(diào)sflt‐1蛋白表達,促進胎盤血管生成,改善胎盤血管通透性,提高血管內(nèi)皮細胞及胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞增殖;同時可改善小鼠胎盤組織、螺旋動脈及滋養(yǎng)細胞病理改變。最終達到促進胚胎發(fā)育,降低流產(chǎn)率的作用。但其對母胎界面血管生成因子的調(diào)節(jié)機制及作用環(huán)節(jié)有待進一步深入探討。

    猜你喜歡
    低劑量胚胎胎盤
    被診斷為前置胎盤,我該怎么辦
    母親肥胖竟然能導(dǎo)致胚胎缺陷
    被診斷為前置胎盤,我該怎么辦
    母親肥胖竟然能導(dǎo)致胚胎缺陷
    16排螺旋CT低劑量掃描技術(shù)在腹部中的應(yīng)用
    DiI 在已固定人胚胎周圍神經(jīng)的示蹤研究
    自適應(yīng)統(tǒng)計迭代重建算法在頭部低劑量CT掃描中的應(yīng)用
    低劑量輻射致癌LNT模型研究進展
    正常和慢心率CT冠狀動脈低劑量掃描對比研究
    冷凍胚胎真的可以繼承嗎?
    日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久久国产成人免费| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久热这里只有精品99| 欧美日韩亚洲高清精品| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 12—13女人毛片做爰片一| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲色图av天堂| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 超碰97精品在线观看| 18禁观看日本| 男女午夜视频在线观看| av欧美777| 黄色女人牲交| 亚洲精品一二三| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品av久久久久免费| 亚洲一区二区三区欧美精品| 麻豆国产av国片精品| 日韩欧美在线二视频| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲精品粉嫩美女一区| 视频区图区小说| 久久青草综合色| 日本黄色视频三级网站网址| 在线天堂中文资源库| 久久九九热精品免费| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| a级毛片黄视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲一码二码三码区别大吗| 性欧美人与动物交配| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产精品综合久久久久久久免费 | 91精品三级在线观看| 十八禁人妻一区二区| 国产av一区在线观看免费| a级毛片黄视频| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 午夜成年电影在线免费观看| 久久香蕉精品热| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲七黄色美女视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费观看人在逋| 亚洲免费av在线视频| 精品国产国语对白av| 午夜免费成人在线视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品九九99| 欧美日韩福利视频一区二区| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 成人黄色视频免费在线看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 男人舔女人的私密视频| 国产精品九九99| 国产国语露脸激情在线看| 成人手机av| 丰满迷人的少妇在线观看| 一区二区三区激情视频| 十八禁网站免费在线| 一级作爱视频免费观看| 久久精品国产综合久久久| 亚洲精品在线观看二区| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品久久久久久成人av| 又紧又爽又黄一区二区| 黄色视频不卡| 精品国产一区二区久久| 高清欧美精品videossex| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 久久 成人 亚洲| 三上悠亚av全集在线观看| 免费av毛片视频| 一级,二级,三级黄色视频| 国产av一区在线观看免费| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费高清视频大片| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 新久久久久国产一级毛片| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 日韩欧美在线二视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 极品教师在线免费播放| 少妇的丰满在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 在线观看免费视频网站a站| 免费看十八禁软件| 无人区码免费观看不卡| www.999成人在线观看| 99riav亚洲国产免费| 国产成人av激情在线播放| 午夜精品国产一区二区电影| 久久人妻熟女aⅴ| 校园春色视频在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 长腿黑丝高跟| 精品无人区乱码1区二区| 欧美乱色亚洲激情| av视频免费观看在线观看| 日韩高清综合在线| 免费观看精品视频网站| 在线视频色国产色| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久青草综合色| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品免费久久久久久久清纯| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美在线一区亚洲| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 一区二区三区激情视频| 99国产综合亚洲精品| 精品日产1卡2卡| 国产精品99久久99久久久不卡| 一进一出好大好爽视频| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 99久久精品国产亚洲精品| 热99国产精品久久久久久7| 两个人免费观看高清视频| 黄片大片在线免费观看| 热re99久久国产66热| 亚洲成人免费av在线播放| 国产精品久久久久久人妻精品电影| www.精华液| 精品国产亚洲在线| 亚洲av电影在线进入| 女人被狂操c到高潮| 亚洲av五月六月丁香网| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 黄色片一级片一级黄色片| 又黄又粗又硬又大视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | av中文乱码字幕在线| 大型av网站在线播放| av天堂久久9| 国产高清视频在线播放一区| cao死你这个sao货| 久久青草综合色| 午夜影院日韩av| 人成视频在线观看免费观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 99久久人妻综合| 满18在线观看网站| 黄色丝袜av网址大全| 手机成人av网站| 日本欧美视频一区| 天天添夜夜摸| 这个男人来自地球电影免费观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 岛国在线观看网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲七黄色美女视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 757午夜福利合集在线观看| 在线视频色国产色| 精品福利永久在线观看| 免费不卡黄色视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久精品91无色码中文字幕| 在线播放国产精品三级| 丰满饥渴人妻一区二区三| av欧美777| 久久精品成人免费网站| 国产高清国产精品国产三级| 一级黄色大片毛片| 欧美午夜高清在线| 丝袜人妻中文字幕| 午夜久久久在线观看| 国产激情欧美一区二区| 亚洲成人久久性| 无限看片的www在线观看| 在线观看www视频免费| a级片在线免费高清观看视频| 午夜福利在线观看吧| 欧美大码av| 水蜜桃什么品种好| 欧美午夜高清在线| 91国产中文字幕| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品成人av观看孕妇| a级片在线免费高清观看视频| 国产成人精品无人区| 中出人妻视频一区二区| 无限看片的www在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲午夜理论影院| 12—13女人毛片做爰片一| 1024香蕉在线观看| 国产精华一区二区三区| 我的亚洲天堂| 免费在线观看影片大全网站| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 黄色怎么调成土黄色| 麻豆久久精品国产亚洲av | 人人妻人人澡人人看| 9191精品国产免费久久| 国产成人系列免费观看| 女警被强在线播放| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 脱女人内裤的视频| 亚洲精品一二三| 在线av久久热| 亚洲全国av大片| 最近最新免费中文字幕在线| 国产精品久久久久成人av| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美一级毛片孕妇| 免费看a级黄色片| 国产99久久九九免费精品| 国产xxxxx性猛交| 久99久视频精品免费| 色老头精品视频在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 无遮挡黄片免费观看| 欧美乱妇无乱码| 超碰成人久久| 国产av精品麻豆| 久久人妻av系列| 搡老岳熟女国产| 日韩有码中文字幕| 久久久久久免费高清国产稀缺| 18禁美女被吸乳视频| xxxhd国产人妻xxx| 日韩欧美三级三区| 国产高清videossex| 国产男靠女视频免费网站| 国产精华一区二区三区| 日韩精品中文字幕看吧| 国产有黄有色有爽视频| 黄色怎么调成土黄色| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜 | netflix在线观看网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 91成人精品电影| 99在线视频只有这里精品首页| 午夜激情av网站| 99国产综合亚洲精品| 精品国产乱子伦一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲性夜色夜夜综合| 91老司机精品| 久久精品国产清高在天天线| 午夜成年电影在线免费观看| 午夜福利欧美成人| 久久久国产成人精品二区 | 91麻豆av在线| 无遮挡黄片免费观看| 99香蕉大伊视频| 国产亚洲av高清不卡| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 免费在线观看完整版高清| 99久久综合精品五月天人人| 最好的美女福利视频网| 国产成人av教育| 久久精品91蜜桃| 啪啪无遮挡十八禁网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 在线观看舔阴道视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 五月开心婷婷网| 欧美大码av| 久久狼人影院| 成熟少妇高潮喷水视频| 日本欧美视频一区| 成年女人毛片免费观看观看9| 18禁观看日本| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 免费日韩欧美在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产熟女xx| 国产三级黄色录像| 国产激情欧美一区二区| 99在线人妻在线中文字幕| 91大片在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 咕卡用的链子| 亚洲人成77777在线视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 深夜精品福利| 精品久久久久久久久久免费视频 | 性欧美人与动物交配| www.自偷自拍.com| 久久这里只有精品19| 午夜视频精品福利| 香蕉国产在线看| 又紧又爽又黄一区二区| 国产黄色免费在线视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 麻豆成人av在线观看| 久久精品影院6| 国产精品一区二区在线不卡| 久久中文看片网| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 99re在线观看精品视频| 成人三级做爰电影| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产激情久久老熟女| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲一区高清亚洲精品| 波多野结衣av一区二区av| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品电影一区二区在线| 国产极品粉嫩免费观看在线| 999精品在线视频| 亚洲五月婷婷丁香| 不卡一级毛片| 麻豆国产av国片精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 在线观看免费日韩欧美大片| 满18在线观看网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲一区中文字幕在线| 男女下面插进去视频免费观看| 日韩国内少妇激情av| av有码第一页| 一级毛片高清免费大全| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 美国免费a级毛片| 天天添夜夜摸| 一本大道久久a久久精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 午夜福利影视在线免费观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 天堂影院成人在线观看| 91成人精品电影| a在线观看视频网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 男女午夜视频在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲,欧美精品.| 高清av免费在线| 精品人妻1区二区| 男人操女人黄网站| 日韩精品中文字幕看吧| 露出奶头的视频| 久久人妻av系列| 国产在线观看jvid| 男人操女人黄网站| 欧美成人午夜精品| 欧美在线一区亚洲| 亚洲国产欧美网| 18禁国产床啪视频网站| 国产成人欧美在线观看| 亚洲精品在线美女| 国产成人影院久久av| 精品电影一区二区在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 天堂中文最新版在线下载| 国产99久久九九免费精品| 在线永久观看黄色视频| 国产亚洲欧美98| 国产精品综合久久久久久久免费 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 宅男免费午夜| 国产单亲对白刺激| 老熟妇仑乱视频hdxx| 又大又爽又粗| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久久久久大精品| xxx96com| 午夜福利欧美成人| 两人在一起打扑克的视频| 色哟哟哟哟哟哟| 免费看十八禁软件| 亚洲国产精品合色在线| 成在线人永久免费视频| 高清欧美精品videossex| 国产成人精品久久二区二区91| 9热在线视频观看99| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲三区欧美一区| 男人操女人黄网站| 婷婷精品国产亚洲av在线| 日韩有码中文字幕| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 免费高清视频大片| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美免费精品| 国产精品98久久久久久宅男小说| 中文欧美无线码| 欧美一区二区精品小视频在线| 午夜老司机福利片| 国产又爽黄色视频| 制服人妻中文乱码| 国产亚洲欧美在线一区二区| 又黄又粗又硬又大视频| 午夜福利在线观看吧| 亚洲精品在线美女| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日本欧美视频一区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 长腿黑丝高跟| 美国免费a级毛片| 日韩av在线大香蕉| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美日韩福利视频一区二区| 色在线成人网| 高清在线国产一区| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久精品国产综合久久久| 亚洲七黄色美女视频| 久热爱精品视频在线9| 在线观看免费日韩欧美大片| www.自偷自拍.com| 成人亚洲精品av一区二区 | 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲九九香蕉| 精品福利观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 男女午夜视频在线观看| 成人亚洲精品av一区二区 | 我的亚洲天堂| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲五月婷婷丁香| 久久久久亚洲av毛片大全| 成年女人毛片免费观看观看9| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 欧美日本中文国产一区发布| 又黄又粗又硬又大视频| 99riav亚洲国产免费| 日韩免费av在线播放| 在线av久久热| 亚洲精品一二三| 91精品国产国语对白视频| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 69精品国产乱码久久久| 丁香欧美五月| 丰满迷人的少妇在线观看| 91精品三级在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产av一区二区精品久久| 亚洲 欧美一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品免费视频内射| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日本欧美视频一区| 免费日韩欧美在线观看| 久久九九热精品免费| av天堂在线播放| 午夜成年电影在线免费观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 大香蕉久久成人网| 最好的美女福利视频网| 级片在线观看| 91成年电影在线观看| 国产精品国产高清国产av| 香蕉国产在线看| 午夜影院日韩av| 黄色丝袜av网址大全| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 后天国语完整版免费观看| 新久久久久国产一级毛片| 在线播放国产精品三级| 淫秽高清视频在线观看| a级毛片黄视频| 两性夫妻黄色片| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美大码av| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美日韩一级在线毛片| 精品一区二区三卡| 精品久久久久久久久久免费视频 | 精品无人区乱码1区二区| 老司机靠b影院| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产成人欧美| 99久久精品国产亚洲精品| 日韩欧美一区视频在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| cao死你这个sao货| 热re99久久精品国产66热6| 成人国语在线视频| 午夜福利,免费看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品欧美一区二区三区在线| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产精品久久久久成人av| 欧美精品一区二区免费开放| 无遮挡黄片免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 日日干狠狠操夜夜爽| 国产99白浆流出| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久伊人香网站| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲专区国产一区二区| 免费不卡黄色视频| 亚洲av美国av| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 真人一进一出gif抽搐免费| 搡老岳熟女国产| 精品国内亚洲2022精品成人| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久久久人人人人人| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 免费av中文字幕在线| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 制服人妻中文乱码| 欧美日韩乱码在线| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| videosex国产| 亚洲精品成人av观看孕妇| 很黄的视频免费| 亚洲第一青青草原| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美乱妇无乱码| 99re在线观看精品视频| 成人精品一区二区免费| 一级片免费观看大全| 欧美+亚洲+日韩+国产| 搡老乐熟女国产| 丝袜美腿诱惑在线| 久热爱精品视频在线9| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产免费男女视频| 黄片大片在线免费观看| 丁香欧美五月| 看片在线看免费视频| 丝袜人妻中文字幕| 国产成人系列免费观看| 中文字幕av电影在线播放| 视频在线观看一区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲 国产 在线| 中文字幕最新亚洲高清| 日本a在线网址| 日韩免费av在线播放| 级片在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 最新美女视频免费是黄的| 狠狠狠狠99中文字幕| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久影院123| 国产av精品麻豆| 悠悠久久av| 中文字幕色久视频| 免费高清视频大片| 亚洲专区国产一区二区| 国产亚洲欧美98| 啦啦啦 在线观看视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| x7x7x7水蜜桃| 国产精品二区激情视频| 水蜜桃什么品种好| 在线av久久热| 美女高潮到喷水免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 女人被狂操c到高潮| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲五月色婷婷综合| 亚洲成a人片在线一区二区| 免费高清视频大片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区|