基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的密花香薷SSR位點(diǎn)特征分析

富 貴，劉玉萍，蘇 旭*

(1 青海民族大學(xué) 生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院，青海省特色經(jīng)濟(jì)高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810007；2 青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西寧 810008；3 高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，西寧 810016)

密花香薷 (ElsholtziadensaBenth.) 是唇形科 (Labiatae) 香薷屬 (ElsholtziaWilld.)，一年生草本植物，主要分布于中國河北、山西、陜西、甘肅、青海等地。多生長在海拔280 ～ 4 200 m的林緣、林下、河邊、草地邊緣、高山、荒地等處[1]。密花香薷全株富含各種活性成分，主要活性成分是揮發(fā)油，Amit等[2]最新研究發(fā)現(xiàn)了40種揮發(fā)性組成成分，占總揮發(fā)性油的83.3% ～ 83.7%，揮發(fā)性油主要包含3種主要的成分：松香芹酮 (51.9%)、反式松樟酮 (5.2%) 和乙酸香茅酯 (3.4%)，具有一定的藥用價(jià)值[3]。西藏、青海等地常使用密花香薷代替正品香薷入藥，具有消炎、利濕、排汗、解暑的功效，可治療夏季感冒、發(fā)熱無汗、中暑、急性胃炎、乳腺癌、口臭、腎炎和小便不利等多種疾病[4-5]。藏醫(yī)全草入藥也可用于治培根病、胃病、梅毒性鼻炎、咽喉炎和寄生蟲病，外用可治療膿腫和皮膚病[6-7]。密花香薷因具獨(dú)特香味，在中國西北地區(qū)常作為蔬菜和茶葉食用，是一種藥食兼用的植物。另外，有研究報(bào)道[8-9]，密花香薷是青藏高原重要的秋季蜜源，人工種植可為蜂戶帶來可觀的收入，具有較大的開發(fā)價(jià)值。

分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于植物遺傳學(xué)研究中，有關(guān)分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用已在很多模式植物和重要的藥用植物中進(jìn)行了報(bào)道[10-14]，SSR (simple sequence repeat) 簡單重復(fù)序列是一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，動(dòng)植物基因組上廣泛分布有一種以1～6個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，如 (AC)n (GA)n (AT)n (AAG)n (AAT)n等，其中n代表重復(fù)次數(shù)，從幾個(gè)到幾十個(gè)不等[15-16]?；蚪M不同位置，每個(gè)座位其重復(fù)基元和重復(fù)次數(shù)皆不可能完全相同，因而在基因組水平表現(xiàn)出多態(tài)性。SSR在植物全基因組內(nèi)廣泛分布，具共顯性遺傳特點(diǎn)，同時(shí)具擴(kuò)增穩(wěn)定、假陽性少、操作簡便、可揭示多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于植物種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、分子遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、指紋圖譜構(gòu)建以及植物系統(tǒng)發(fā)育分析等研究[17]。

目前對于密花香薷的研究主要集中于化學(xué)成分的分離和提取。如孫麗萍等[18]從密花香薷中分離得到 10個(gè)化合物；王笳等[19]采用GC/MS氣質(zhì)聯(lián)用儀對密花香薷精油進(jìn)行了化學(xué)成分分析，鑒定出13種化合物；徐海燕等[20]對密花香薷進(jìn)行了生藥學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)密花香薷在原植物、性狀、顯微等方面具有專屬性特征。密花香薷的水、醇溶性浸出物含量分別為3.75%、3.20%。但是密花香薷種質(zhì)資源分布、物種分類及分子生物學(xué)等方面的研究還未曾被報(bào)道，嚴(yán)重阻礙了密花香薷優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的篩選和后續(xù)開發(fā)利用。本研究基于高通量測序 (Illumina HiSeq) 獲得的密花香薷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了分布于轉(zhuǎn)錄組上的SSR位點(diǎn)信息特征，可為后期密花香薷SSR引物開發(fā)與篩選提供理論依據(jù)，為密花香薷遺傳多樣性、系統(tǒng)親緣關(guān)系、優(yōu)質(zhì)資源篩選鑒定及育種等相關(guān)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)樣本采集于中國青海省海南藏族自治州共和縣青海湖二郎劍景區(qū) (36.578 5°N，100.491 1°E)，海拔3 194.15 m，挑選長勢良好的密花香薷 3株，分別取葉片后，用錫箔紙包好，立即存入液氮中保存，送回實(shí)驗(yàn)室用于后續(xù)RNA的提取和測序。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取與建庫采用經(jīng)典提取方法 (Trizol法)[21]提取密花香薷樣本RNA，獲得RNA后，首先對其純度和完整性進(jìn)行檢測，再通過Oligo (dT) 磁珠富集mRNA，用于反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用NEB普通建庫，以信使RNA作為模板，隨機(jī)寡核苷酸作為引物合成第一條cDNA鏈，以dNTPs (4種脫氧核糖核苷酸) 為原料合成cDNA的第二條鏈。兩條鏈合成后進(jìn)行純化、末端修復(fù)等操作，再通過篩選，將篩選出的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，二次純化得到文庫。

1.2.2 測序和數(shù)據(jù)評(píng)估獲得的文庫經(jīng)過檢測，質(zhì)量得到保證才可以上機(jī)測序，構(gòu)建好的文庫用Illumina HiSeq 2000進(jìn)行測序，獲得的序列信息數(shù)據(jù)要進(jìn)行一定程度的過濾，用Fast QC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/，快速地對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估) 檢查原始讀物的質(zhì)量，去除帶接頭和含N的讀片以及測序質(zhì)量低的讀長 (Qphred≤20的堿基數(shù)占讀取長度的 50%以上)，測序獲得原始數(shù)據(jù)后，取得clean reads。Trinity軟件(https://github.com/trinityrnaseq/ trinityrnaseq/wiki) 用于短reads的組裝，組裝后得到的序列拼接成為轉(zhuǎn)錄本再進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.3 SSR位點(diǎn)的檢測和搜尋利用MISA (microsatellite,https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/) 軟件1.0版，選擇默認(rèn)參數(shù)，對應(yīng)的各個(gè)重復(fù)基元的最少重復(fù)次數(shù)分別為1-10、2-6、3-5、4-5、5-5和6-5 (如：1-10，以單核苷酸為重復(fù)單位時(shí)，其重復(fù)數(shù)至少為10才可被檢測到；2-6，以雙核甘酸為重復(fù)單位時(shí)，其最少重復(fù)數(shù)為6)，對轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行SSR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 密花香薷轉(zhuǎn)錄組分布概況

組裝后的密花香薷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用CD-HIT軟件 (https://github.com/weizhongli/cdhit/wiki/3.-User’s-Guide#CDHITEST) 去冗余后，共獲得 42 362條Unigenes，平均長度為1 325 bp，總長度為56 141 397 bp。經(jīng)搜索發(fā)現(xiàn) SSR重復(fù)序列總共有17 564個(gè)，分布于11 903條 Unigenes 上，SSR 的出現(xiàn)頻率為 28.10%，密花香薷轉(zhuǎn)錄組Unigenes序列平均每3 200 bp 出現(xiàn)一個(gè) SSR 位點(diǎn)，包含有2個(gè)及2個(gè)以上SSR位點(diǎn)數(shù)為3 693個(gè)，復(fù)合型SSR 位點(diǎn)數(shù)為1 675個(gè) (表1)?？梢?，密花香薷轉(zhuǎn)錄組所包含SSR位點(diǎn)較豐富，分布較為廣泛。

表1 密花香薷轉(zhuǎn)錄組SSR分布特征描述Table 1 The description of distribution characteristics for SSR loci in transcriptome of Elsholtzia densa

2.2 密花香薷轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)不同重復(fù)類型分析

對密花香薷轉(zhuǎn)錄組檢測到的SSR位點(diǎn)進(jìn)行了核苷酸重復(fù)類型分類，共有6種重復(fù)類型(表2)。不同重復(fù)單元形成的SSR位點(diǎn)數(shù)目相差較大，其中單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)最多，為8 997個(gè)，占總SSR位點(diǎn)的51.22%，總長度為100 356 bp，平均每6 240 bp個(gè)核苷酸出現(xiàn)1個(gè)單核苷酸重復(fù)序列；二核苷酸重復(fù)序列次之，為4 475個(gè)，占總SSR位點(diǎn)的25.48%，總長度為59 434 bp，平均每12 550 bp個(gè)核苷酸出現(xiàn)1個(gè)二核苷酸重復(fù)序列；五核苷酸重復(fù)序列最少 (85)，占總SSR位點(diǎn)的0.48%，總長度為1 775 bp，平均每660 490 bp個(gè)核苷酸出現(xiàn)1個(gè)五核苷酸重復(fù)序列。不同重復(fù)類型形成SSR頻率差異較大，SSR出現(xiàn)頻率介于0.20% ～ 21.20%之間，其中單核苷酸重復(fù)類型SSR發(fā)生頻率最高，每100條Unigene 有21.20個(gè)SSR位點(diǎn)出現(xiàn)；五核苷酸重復(fù)類型SSR發(fā)生頻率最低，每100條Unigene 僅有0.20個(gè)SSR位點(diǎn)出現(xiàn)。

表2 密花香薷轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)重復(fù)類型、數(shù)量及分布統(tǒng)計(jì)Table 2 The statistics of repeating types,number and distribution for SSR loci in transcriptome of Elsholtzia densa

2.3 密花香薷轉(zhuǎn)錄組SSR基序類型特征分析

對密花香薷SSR位點(diǎn)不同重復(fù)基元進(jìn)行分析，研究結(jié)果 (表3，圖1) 表明，共有169個(gè)重復(fù)基元類型，在不同重復(fù)次數(shù)下形成17 564個(gè)SSR位點(diǎn)。其中單核苷酸 2 種基元類型，(A/T)n基元類型占明顯優(yōu)勢，共形成8 888個(gè)SSR位點(diǎn)，占單核苷酸SSR位點(diǎn)的98.78%，總SSR位點(diǎn)的50.60%；二核苷酸基元類型4種，(AG/CT)n基元類型占優(yōu)，共形成2 138個(gè)SSR位點(diǎn) (47.80%，12.17%)；三核苷酸基元類型為9種，其中 (AAG/CTT)n基元類型SSR位點(diǎn)最多，共形成638個(gè)SSR位點(diǎn) (17.68%，3.63%)，依次較高的為 (AAC/GTT)n，形成584個(gè)SSR位點(diǎn) (16.18%，3.33%)，(ATC/ATG)n 形成502個(gè)SSR位點(diǎn) (13.90%，2.86%)；四核苷酸基元類型25種，形成SSR位點(diǎn)較多的基元類型依次為 (AAAT/ATTT)n、(AAAG/CTTT)n和(AATT/AATT)n，分別形成38 (17.43%，0.216 4%)、35 (16.06%，0.20%)和34 (15.60%，0.20%) 個(gè)SSR位點(diǎn)；五核苷酸基元類型為29種，形成SSR較多的基元類型為 (AAAAG/CTTTT)n、(AAAAT/ATTTT)n 和 (AAAAC/GTTTT)n，分別形成17 (20.00%，0.10%)、11(12.94%，0.06 3%) 和8 (9.4%，0.05%) 個(gè)SSR位點(diǎn)；六核苷酸基元類型為99種，形成SSR位點(diǎn)較多的基元類型為 (AAAAAT/ATTTTT)n，形成8個(gè)SSR位點(diǎn)(4.44%，0.05%)，(AAAAAG/CTTTTT)n、(AAAGAG/CTCTTT)n、(AAGGAG/CCTTCT)n、(AATTCC/AATTGG)n、(AGATGG/ATCTCC)n 5種基元類型均形成6個(gè)SSR位點(diǎn) (3.33%，0.03%)。

圖1 不同重復(fù)類型優(yōu)勢基序SSR位點(diǎn)數(shù)量分布Fig.1 The quantities distribution of SSR loci formed from preponderant motif of different repetitions

不同基序類型形成SSR位點(diǎn)數(shù)目存在廣泛變異 (表3)，單核苷酸基序 (A/T)n SSR發(fā)生頻率最高 (20.98%)；81個(gè)基序類型所形成的SSR位點(diǎn)發(fā)生頻率最低，包括 8個(gè)四核苷酸基序，11個(gè)五核苷酸基序和62個(gè)六核苷酸基序，僅形成1個(gè)SSR序列 (0.0024%)。從總體來看，隨著SSR基元堿基數(shù)目的增加，基元類型增加，SSR位點(diǎn)數(shù)呈下降趨勢。

表3 密花香薷轉(zhuǎn)錄組不同基序SSR位點(diǎn)數(shù)量分布Table 3 The quantities distribution of different motif SSR loci in transcriptome of Elsholtzia densa

2.4 密花香薷轉(zhuǎn)錄組中SSR基元重復(fù)次數(shù)分析

密花香薷SSR 基元重復(fù)次數(shù)因基元序列長度表現(xiàn)出廣泛的變異，不同重復(fù)次數(shù)所形成的SSR位點(diǎn)差異較大，每種基元類型構(gòu)成的SSR位點(diǎn)中，最小重復(fù)次數(shù)的SSR位點(diǎn)最多，且隨著基元長度的增加，重復(fù)次數(shù)類型呈下降趨勢 (表4，圖2)。單核苷酸重復(fù)基元其重復(fù)次數(shù)類型廣泛，介于10 ～ 66之間，共有49種重復(fù)次數(shù)，不同重復(fù)次數(shù)所形成的SSR位點(diǎn)數(shù)量差異較大，最小重復(fù)次數(shù)為10次，且所形成的SSR位點(diǎn)比例最高，占所有單核苷酸SSR序列的35.90%，最大重復(fù)次數(shù)為66次，僅形成2個(gè)SSR位點(diǎn)，占所有單核苷酸SSR序列的0.02%。五核苷酸基元重復(fù)次數(shù)類型最少，重復(fù)次數(shù)介于5 ～ 11之間，共有4種重復(fù)次數(shù)，其中最小重復(fù)次數(shù)為5次，且所形成的SSR位點(diǎn)最多，為62個(gè)，占五核苷酸重復(fù)序列所形成SSR位點(diǎn)的72.94%，最大重復(fù)次數(shù)為11次，形成的SSR位點(diǎn)僅有1個(gè)，占五核苷酸重復(fù)序列所形成SSR位點(diǎn)的1.18%。所有基元類型重復(fù)次數(shù)相關(guān)信息詳見表4。

圖2 密花香薷轉(zhuǎn)錄組不同基序類型SSR位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)Fig.2 The statistics of different motif SSR loci in transcriptome of Elsholtzia densa

表4 密花香薷轉(zhuǎn)錄組SSR基序重復(fù)次數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 4 The statistics of repetition times for motif of SSR loci in transcriptome of Elsholtzia densa

2.5 密花香薷轉(zhuǎn)錄組不同基元類型SSR位點(diǎn)長度分析

對密花香薷轉(zhuǎn)錄組二至六核苷酸，不同基序SSR長度進(jìn)行了分析，不同基序類型SSR位點(diǎn)所包含長度類型差異較大，總體來看，SSR長度主要集中在12 ～ 30 bp區(qū)間，該長度范圍內(nèi)包含有8 190個(gè)SSR位點(diǎn)，占所統(tǒng)計(jì)SSR位點(diǎn)的95.60%，而且隨著SSR位點(diǎn)長度的增加，SSR位點(diǎn)數(shù)目呈下降趨勢 (表5，圖3)。二核苷酸基序構(gòu)成的SSR位點(diǎn)，長度分布在12 ～ 30 bp的數(shù)量最多，為4 260，占二核苷酸SSR位點(diǎn)總數(shù)的95.20%；三核苷酸次之，長度分布在12 ～ 30 bp的SSR數(shù)量為3 509，占三核苷酸SSR位點(diǎn)總數(shù)的97.23%；五核苷酸最少，長度分布在12 ～ 30 bp的數(shù)量為83 (97.64%)；四和六核苷酸2種基序SSR長度分布在12 ～ 30bp的數(shù)目分別為20 (92.66%)和136 (75.56%)。

圖3 密花香薷轉(zhuǎn)錄組不同基元SSR位點(diǎn)長度分布Fig.3 Length distribution of different motif SSR loci in transcriptome of Elsholtzia densa

表5 密花香薷不同基元和不同重復(fù)次數(shù)SSR位點(diǎn)長度統(tǒng)計(jì)Table 5 Statistics of the length of different motif and repetition time SSR loci in transcriptome of Elsholtzia densa

3 討 論

磁珠富集法作為一種經(jīng)典的方法常被用于SSR標(biāo)記的開發(fā)，該方法雖步驟繁多，但成本低，早期在SSR標(biāo)記開發(fā)中得到了廣泛應(yīng)用，如富貴等利用磁珠富集法開發(fā)出了蕨麻 (Potentillaanserina) 20對多態(tài)性較好的SSR引物[17]。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，基于轉(zhuǎn)錄組、基因組及公共數(shù)據(jù)庫EST (Expressed Sequence Tag) 數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法檢測SSR位點(diǎn)信息并進(jìn)行引物開發(fā)已被廣泛應(yīng)用，如李榮華等[22]基于菜薹 (Brassicacampestris) 轉(zhuǎn)錄組分析檢測到11 879 個(gè)SSR位點(diǎn)，并篩選出12對具有多態(tài)性的引物；黃興發(fā)等[23]基于黑果枸杞 (Lyciumruthenicum) 基因組測序數(shù)據(jù)，獲得2 494個(gè)SSR位點(diǎn)，篩選出10對高多態(tài)性SSR引物，并分析了48份枸杞的遺傳多樣性；張?zhí)炀壍萚24]利用MISA 軟件從紫蘇 (Perillafrutescens) 1 206條EST序列中檢索到1 526個(gè)SSR位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)獲得了723條SSR引物。

本研究對去冗余后的密花香薷42 362條 Unigene 進(jìn)行SSR位點(diǎn)檢測和分析，共檢測到 SSR位點(diǎn)17 564個(gè)，分布于11 903條 Unigene 上，SSR 的出現(xiàn)頻率為 28.10%。劉小莉等[25]對唇形科云南鼠尾草 (Salviayunnanensis) 轉(zhuǎn)錄組SSR進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，SSR發(fā)生概率為 7.51%；劉欣雨等[26]基于丹參 (Salviamiltiorrhiza) 15.99 Mb 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析了含有 Unigene的 33 438 條序列，共獲得 2 095 個(gè) SSR 候選位點(diǎn)，SSR發(fā)生率為6.27%；張?zhí)炀壍萚24]對唇形科紫蘇 (Perillafrutescens) EST-SSR分布特征進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，EST-SSR發(fā)生頻率為22.19%。對比以上幾種同科近緣種，密花香薷轉(zhuǎn)錄組SSR發(fā)生頻率相對較高。與其他外緣物種，如云南金花茶 (Camelliafascicularis，19.63%)[27]、黨參 (Codonopsispilosula，12.22%)[28]、黑果枸杞 (26.36%)[29]和馬鈴薯(Solanumtuberosum，3.43%)[30]相比，密花香薷轉(zhuǎn)錄組所包含SSR位點(diǎn)亦表現(xiàn)出較高的豐富度。由此可見，密花香薷轉(zhuǎn)錄組所包含SSR位點(diǎn)數(shù)目豐富，可為后期SSR標(biāo)記的開發(fā)和篩選提供大量的信息基礎(chǔ)。對上述物種轉(zhuǎn)錄組SSR發(fā)生頻率進(jìn)行比較，不難發(fā)現(xiàn)，SSR 位點(diǎn)發(fā)生頻率因物種不同而表現(xiàn)出差異性，究其原因，可能與物種自身基因結(jié)構(gòu)固有差異，以及分析數(shù)據(jù)庫大小、SSR 搜索工具和搜索條件的不同設(shè)置等有關(guān)[28]。

通過對密花香薷轉(zhuǎn)錄組不同基序類型SSR位點(diǎn)數(shù)目分析發(fā)現(xiàn)，密花香薷轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)類型共有 6種，單核苷酸重復(fù)類型最多，占總SSR位點(diǎn)的51.22%，依次為二 (25.48%)、三核苷酸重復(fù)類型 (20.57%)，由此可見，單、二、三核苷酸重復(fù)類型 (97.27%) 是密花香薷轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)的主導(dǎo)基序類型，單核苷酸在3種主導(dǎo)基序類型中所占比例最高，為主要的基序類型。尹躍等[29]對黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR分析研究也得出了相似的結(jié)論，黑果枸杞轉(zhuǎn)錄組SSR主要類型為單、二、三核苷酸重復(fù)類型 (99.44%)，單核苷酸重復(fù) (74.33%)為主要基序類型。相同的結(jié)論在韭菜全長轉(zhuǎn)錄組SSR信息分析中也得到了支持[31]。唇形科云南鼠尾草、丹參和紫蘇SSR序列信息研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SSR基序主導(dǎo)類型也是一至三核苷酸重復(fù)，3種基序類型所形成SSR位點(diǎn)占比分別為92.58%、98.0%和98.85%，但與本研究不同的是上述三種植物轉(zhuǎn)錄組SSR主要基序類型是二核苷酸 (紫蘇46.76%，云南鼠尾草41.47%，丹參61.60%)[24-26]。諸多研究表明，植物轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)重復(fù)基元主要以短序列重復(fù)基元為主，但不同物種中SSR主導(dǎo)基序不同，這一結(jié)論在上述不同植物研究中均得到了驗(yàn)證支持。

有研究表明，被子植物和蕨類植物二核苷酸的優(yōu)勢基元主要為 (AG/CT)n，而裸子植物以 (AT/AT)n 為優(yōu)勢基元；雙子葉植物、蕨類植物和少數(shù)單子葉植物以 (AAG/CTT)n 為三核苷酸的優(yōu)勢基元[30]，不同植物轉(zhuǎn)錄組SSR基元類型所表現(xiàn)出的差異性可能和物種自身遺傳和基因結(jié)構(gòu)有關(guān)。密花香薷轉(zhuǎn)錄組SSR二核苷酸的優(yōu)勢基元為 (AG/CT)n，占二核苷酸SSR的比例為47.80%，三核苷酸優(yōu)勢基元為 (AAG/CTT)n (17.68%)，這一研究結(jié)果與上述結(jié)論一致。同時(shí)，對諸多植物，如黨參[26]、山地虎耳草 (Saxifragamontana)[32]、蒙農(nóng)紅豆草 (OnobrychisviciifoliaScop‘Mengnong’)[33]、細(xì)果角茴香 (Hypecoumleptocarpum)[34]轉(zhuǎn)錄組SSR研究也得到了上述相同的結(jié)論。但也有一些植物，二、三核苷酸優(yōu)勢基元與上述研究不同，如韭菜二核苷酸優(yōu)勢基元為 (AC/GT)n (20.28%)[31]、薄殼山核桃三核苷酸優(yōu)勢基元為 (AAC/GTT)n (34.95%)[35]、香蕉三核苷酸優(yōu)勢基元為 (AGG/CCT)n (12.53%)[36]。不同物種轉(zhuǎn)錄組SSR同一重復(fù)類型優(yōu)勢基元的不同，可能和其相應(yīng)編碼蛋白的使用頻率差異有關(guān)[33]。

種內(nèi)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性主要表現(xiàn)在基元重復(fù)次數(shù)的差異，Xu 等[37]研究表明SSR 基元重復(fù)次數(shù)高的序列具有較高的多態(tài)性潛能，當(dāng)其重復(fù)次數(shù)高于12次時(shí)，多態(tài)性較高[38]。密花香薷轉(zhuǎn)錄組重復(fù)次數(shù)變異范圍廣泛，分布在5～66次之間，共有121種重復(fù)次數(shù)，具有較高的重復(fù)類型數(shù)，每種基序類型最小重復(fù)次數(shù)所形成的SSR位點(diǎn)數(shù)最高，且隨著基序核苷酸的增加，重復(fù)次數(shù)類型呈下降趨勢。長度分析表明，SSR序列長度<12 bp時(shí)多態(tài)性表現(xiàn)極低，12～20 bp之間表現(xiàn)中等，≥20 bp時(shí)多態(tài)性較高，且低級(jí)基序SSR多態(tài)性普遍高于高級(jí)基序SSR[39]。密花香薷轉(zhuǎn)錄組二至六核苷酸基序SSR序列長度結(jié)果表明，每種基序類型SSR序列長度主要集中在12～30 bp，包含有8 190個(gè)SSR位點(diǎn)，占所統(tǒng)計(jì)SSR位點(diǎn)的95.60%，1 589 (≥20 bp) 個(gè)SSR序列具有極高的多態(tài)性，占所統(tǒng)計(jì)SSR位點(diǎn)的18.54%。據(jù)此推測，上述SSR位點(diǎn)在密花香薷SSR分子標(biāo)記中具有較高的開發(fā)潛能。

本研究基于密花香薷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢索到17 564個(gè)SSR位點(diǎn)，并分析了其序列分布類型和結(jié)構(gòu)特征，綜合SSR出現(xiàn)頻率、分布密度、基元重復(fù)次數(shù)和長度變異范圍等多個(gè)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該研究所獲得的SSR序列表現(xiàn)出較高的多態(tài)性潛能，具有較大的開發(fā)價(jià)值。目前，有關(guān)密花香薷的研究主要集中在活性成分及其功能方面的研究中，前人研究已充分證明了密花香薷的開發(fā)價(jià)值，所以，對于其種質(zhì)資源的收集、篩選、鑒定及育種等方面的相關(guān)研究勢在必行，SSR分子標(biāo)記因其操作簡單，穩(wěn)定性好，具共顯性等優(yōu)點(diǎn)，可為上述研究提供有效的技術(shù)手段。