沉默類胰島素多肽(Ilp)基因?qū)诛w虱翅和卵巢發(fā)育及海藻糖代謝的影響

於衛(wèi)東, 劉永康, 羅雨嘉, 黃 鎮(zhèn), 周 泰,葉 林, 唐 斌, 王世貴,*

(1. 杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院, 杭州 310036; 2. 浙江鼎益生物科技有限公司, 浙江衢州 324100)

一直以來水稻嚴重地遭受著害蟲的威脅，尤其是過去10年稻飛虱大暴發(fā)，導致水稻產(chǎn)量大幅度下降(Rashidetal., 2017)。其中褐飛虱Nilaparvatalugens是一種典型的水稻單食性害蟲，主要利用其刺吸式口器吸食水稻莖部汁液，導致水稻喪失營養(yǎng)和水分，變黃變枯，從而減穗減重甚至絕收。褐飛虱生命周期短，繁殖力強，具有遠距離遷飛性等特點(Qietal., 2014; Sunetal., 2014; Vongpaetal., 2016; Jingetal., 2017)。殺蟲劑是當前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中控制褐飛虱最為主要的手段。但是殺蟲劑長期以來的不合理使用帶來了 “3R”問題(抗藥性、殘留和害蟲再猖獗)等許多弊端(Wangetal., 2016; 徐紅星等, 2017; Sharmaetal., 2018)。

昆蟲和哺乳動物的類胰島素受體(insulin-like receptor, InR)等基因高度相似，其胰島素調(diào)控血糖平衡的通路也非常類似(張龍輝和王國棟, 2014; Kuhnetal., 2015; Zhaietal., 2015)。不同點在于，昆蟲的“血糖”是海藻糖。海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過糖苷鍵的非還原性二糖，化學結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，在昆蟲體內(nèi)廣泛存在，由脂肪體合成，作為昆蟲的“血糖”而高濃度存在于血淋巴中(Beckeretal., 1996; Tangetal., 2008)。它不僅是昆蟲的重要能量物質(zhì)，而且在昆蟲的各種生理活動中發(fā)揮著巨大作用，且在抵御寒冷、炎熱及干燥等非生物脅迫方面扮演著重要角色(Beckeretal., 1996; Chen and Haddad, 2014; Shuklaetal., 2015)。胰島素是被研究得最為廣泛的肽類激素之一，而昆蟲類胰島素多肽(insulin-like peptides, Ilps)在結(jié)構(gòu)和功能上相對于脊椎動物Ilps來說則是進化上相對保守的。Ilps位于胰島素信號通路最上游，且在糖類物質(zhì)調(diào)控中發(fā)揮關鍵作用。第一個昆蟲Ilp最早是在家蠶Bombyxmori中鑒定出來的，目前為止在家蠶中已經(jīng)鑒定出了38類編碼Ilp的基因(Hetruetal., 1991; Iwani, 2000; Ikeyaetal., 2002; 顧世紅和陳建國, 2009)。不同的昆蟲所擁有的Ilps的種類和數(shù)目也不相同。褐飛虱體內(nèi)已被鑒定出4種類胰島素多肽基因(Xuetal., 2015)，它們開放閱讀框架長度分別為525, 1 194, 408和405 nt，分別編碼174, 397, 135和 134個氨基酸殘基(Xueetal., 2020)。發(fā)育表達模式研究表明，NlIlp1和NlIlp4主要在胚胎后期表達，NlIlp2和NlIlp3則在卵中的表達水平更高(Xueetal., 2020)。這表明褐飛虱中Ilps的表達具有時空順序，且各自可能具有獨特的功能。對甜菜夜蛾Spodopteraexigua以及豆莢螟Marucavitrata的研究表明Ilp基因影響了昆蟲血淋巴的海藻糖水平(Kim and Hong, 2015; Al Bakietal., 2019)，但目前它們在褐飛虱糖類代謝以及發(fā)育繁殖中的作用還不清楚。因此，本研究以褐飛虱為實驗對象，采用RNAi技術抑制Ilps的表達，觀察褐飛虱的表型以及卵巢發(fā)育，測定相關糖含量以及海藻糖酶活性，同時檢測海藻糖代謝途徑關鍵基因表達量的變化，探討Ilp對褐飛虱海藻糖代謝及翅和卵巢發(fā)育的調(diào)控作用，有利于促進類胰島素調(diào)控昆蟲血糖的研究。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

以實驗室飼養(yǎng)多年的褐飛虱種群作為實驗對象，供試水稻品種為感蟲水稻TN1(Taichung Native 1)。人工氣候箱所設置的溫度條件為25±1℃，相對濕度為70%±5%，光周期為14L∶10D。取褐飛虱2日齡雌成蟲置于TN1苗上進行產(chǎn)卵，隨后取出，以獲得生長時期一致的褐飛虱。

1.2 dsRNA合成

取5頭褐飛虱成蟲進行研磨破碎，隨后利用Trizol法抽提褐飛虱總RNA，取1 μL RNA于蛋白核酸微量測定儀NanoDropTM2000中檢測總RNA的純度及濃度，同時進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。待抽提的總RNA符合要求后，使用Prime Script RT Reagent Kit(TaKaRa)進行反轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA第1鏈。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第1鏈為模板，參照Xu等(2015)在褐飛虱Ilp1(GenBank登錄號: KF974340.2),Ilp2(GenBank登錄號: KF974341.1),Ilp3(GenBank登錄號: KF974342.1)和Ilp4(GenBank登錄號: KF974343.1)非保守序列區(qū)域所設計不含T7啟動子的特異性引物(表1)進行PCR，反應體系: 褐飛虱cDNA 4.0 μL, 正反向引物(10 pmol/L)各1 μL, dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL, 10×Buffer(Mg2+)2.5 μL, Hifi(5 U/μL)0.2 μL, ddH2O 14.3 μL。反應程序: 95℃預變性 3 min; 95℃變性 5 s, 55℃退火延伸 30 s, 72℃延伸1 min, 共循環(huán)35次; 最后在72℃條件下延伸10 min。

表1 dsRNA合成和qPCR所用引物Table 1 Primers used in dsRNA synthesis and qPCR

將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用試劑盒進行回收與純化，將純化產(chǎn)物連接于pMD18-T進行T克隆后送Invitrogen(上海)公司測序。測序結(jié)果比對正確后抽提重組質(zhì)粒DNA，并以此為模板，同時用含T7啟動子序列的特異性引物(表1)進行交叉PCR，在序列的兩端加上T7啟動子。最后以交叉PCR的反應產(chǎn)物為模板，利用T7 RiboMAX Express RNAi System試劑盒進行dsRNA的合成。反應體系為20 μL，包括10 μL T7 RiboMAX Express 2×Buffer, 1 μL PCR反應產(chǎn)物, 2 μL Enzyme Mix以及7 μL DEPC水，具體步驟見試劑盒說明書。隨后在合成的dsRNA中加入3 mol/L 醋酸鈉(pH 5.2)4.4 μL以及110 μL 95%乙醇，輕輕混勻，冰上放置5 min，在4℃下14 000 r/min離心10 min，棄上清；向離心管中加入0.5 mL 70%的冰乙醇洗滌沉淀，4℃ 14 000 r/min離心10 min，棄上清。最后在室溫下干燥離心管10 min 后，加入50 μL DEPC處理水溶解沉淀，分別利用瓊脂糖凝膠電泳和蛋白核酸微量測定儀NanoDropTM2000檢測dsRNA 的質(zhì)量和濃度，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNAi實驗

隨機取出5齡第1天的褐飛虱若蟲，用于IlpdsRNA注射實驗，包括Ilp1-4單基因dsRNA注射和dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4注射(dsIlp1∶dsIlp2∶dsIlp3∶dsIlp4=1∶1∶1∶1)，同時以注射dsGFP的褐飛虱為對照，每蟲注射量為100 nL，其中含200 ng dsRNA。用CO2麻醉5齡褐飛虱30 s，隨后用尖頭小毛筆將褐飛虱挑起并放置于瓊脂糖平板中進行固定。IM-31顯微注射儀(NARISHIGE, 日本)參數(shù)設置為：注射壓強1 000 Pa，注射時間0.5 s，補償壓20 Pa。選擇褐飛虱5齡若蟲胸部中足和后足間的外側(cè)表皮處進行注射，設3次生物學重復， 每個生物學重復注射50頭。

1.4 RNAi后褐飛虱表型特征觀察

將1.3節(jié)RNAi后褐飛虱5齡若蟲放入含水稻莖葉的開口玻璃管中，用棉塞塞住管口，置于人工氣候室中，環(huán)境條件設置為：溫度26±0.5℃，相對濕度50%±5%，光周期16L∶8D。24 h后觀察褐飛虱存活情況，同時觀察褐飛虱表型并用萊卡顯微解剖鏡(德國)拍照記錄。隨機挑選5頭雌蟲與5頭雄蟲，放入含新鮮水稻苗的開口玻璃管中，飼養(yǎng)至羽化后第2天和第6天，取褐飛虱雌成蟲進行解剖，觀察卵巢的發(fā)育情況，并用萊卡顯微解剖鏡進行拍照記錄，放大倍數(shù)為20×。

1.5 RNAi后褐飛虱體內(nèi)糖類物質(zhì)含量以及海藻糖酶活性的測定

分別于RNAi后48 h與72 h 各注射組隨機挑選10頭褐飛虱，加入200 μL PBS，超聲破碎至無塊狀組織，破碎后加入800 μL PBS，4℃ 1 000×g離心20 min，用于以下測定：取350 μL上清，根據(jù)葡萄糖分析試劑盒(Sigma-Aldrich, 美國)說明書進行葡萄糖含量的測定；利用淀粉轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶處理含糖原的1 000×上清液后，再根據(jù)葡萄糖分析試劑盒說明書檢測糖原含量；根據(jù)蒽酮法(Zhangetal., 2017)檢測海藻糖含量；取350 μL上清，4℃ 20 800×g超離心60 min，上清液與沉淀懸浮液與40 mmol/L海藻糖標準液(Sigma-Aldrich, 美國)進行混合反應，利用葡萄糖標準液制作標準曲線，用標準曲線確定可溶性海藻糖酶(soluble trehalase, TRE1)和膜結(jié)合型海藻糖酶(membrane-bound trehalase, TRE2)活性。利用BCA蛋白試劑盒(Beyotime, 上海)測定各部分總蛋白濃度，用于計算糖含量以及酶活性。在測量總蛋白濃度、糖含量以及酶活性時均重復點樣3次，進行技術重復。

1.6 RNAi后海藻糖代謝途徑基因表達的測定

取RNAi后的褐飛虱5頭，RNA提取、檢測和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA同1.2節(jié)。參考Xu等(2015)設計qPCR所需引物(表1)，18S rRNA用作內(nèi)參基因，檢測海藻糖酶(trehalase, TRE)基因TRE1-1(GenBank登錄號: FJ790319),TRE1-2(GenBank登錄號: KU556829),TRE2(GenBank登錄號: GQ397451)和海藻糖合成酶(trehalose-6-phosphate synthase, TPS)基因TPS1(GenBank登錄號: GQ397450.1)和TPS2(GenBank登錄號: KU556826.1)的表達。qPCR反應按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ Kit說明書(TaKaRa, 大連)進行，反應體系(10 μL): 正反向引物(10 ng/μL)各0.4 μL, SYBR Buffer 5 μL, ddH2O 3.2 μL, cDNA模板1 μL。每個體系進行3次技術重復。反應置于Bio-Rad CFX96TMReal-time PCR檢測儀上進行，反應程序: 95℃預變性3 min; 95℃變性5 s, 59℃退火并延伸30 s, 39個循環(huán)。根據(jù)溶解曲線檢測引物的特異性，最后根據(jù)2-△△CT法計算mRNA的相對水平(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用IBM SPSS Statistics 20進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以3次生物學重復的平均值±標準誤的形式呈現(xiàn)；所有實驗組均只與對照組進行比較，采用t檢驗分析差異顯著性；利用SigmaPlot10.0軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 RNAi對褐飛虱Ilp表達的干擾效果

采用RNAi技術分別進行褐飛虱4個Ilp基因的單干擾以及共同干擾的結(jié)果表明，與注射dsGFP組相比較，在分別注射dsIlp1-4之后48 h和72 h，相應基因的mRNA表達水平都極顯著下降(P<0.01)，在注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4之后各Ilp基因的表達同樣也極顯著被抑制(P<0.01)(圖1: A-D)。為了排除脫靶效應的存在，將dsIlp1-4的序列進行比對，結(jié)果表明4條dsRNA之間不存在20 bp以上完全一致的序列，證明dsRNA之間不存在脫靶效應。以上結(jié)果說明RNAi成功抑制了靶標基因的表達。

圖1 Ilp基因 RNAi后對褐飛虱5齡若蟲Ilp1 (A), Ilp2 (B), Ilp3 (C)和Ilp4 (D)表達的影響Fig. 1 Effect of RNAi of Ilp genes on the expression of Ilp1 (A), Ilp2 (B), Ilp3 (C) and Ilp4 (D)in the 5th instar nymphs of Nilaparvata lugensdsIlps: dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4. 下同The same below. 圖中橫線表示對照組(dsGFP注射組)基因表達量。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；采用t檢驗進行處理組與對照組間基因表達量差異顯著性檢驗。The horizontal line in the figure represents the gene expression level in the control group (dsGFP injection group). Data in the figure are mean±SE, and t-test was used to determine the significance of difference in the gene expression level between the treatment group and the control group. *P<0.05; **P<0.01.

2.2 干擾Ilp基因后褐飛虱的翅型和卵巢表型變化

與dsGFP注射組相比較，在注射dsIlp1, dsIlp2, dsIlp4以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4之后，褐飛虱翅型出現(xiàn)了向內(nèi)卷曲的現(xiàn)象，而在注射了dsIlp3之后，褐飛虱的翅型向外展開(圖2: A)。參考褐飛虱卵巢分級標準(蘆芳等, 2011)，發(fā)現(xiàn)被注射dsIlp3以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4的褐飛虱卵巢在羽化后第2天仍處于Ⅰ級(乳白透明期)，卵巢小管短而細，透明，粘連不易分散，而其余組別已進入Ⅱ級(卵黃沉積期)初期，出現(xiàn)部分乳白色渾濁；而在羽化第6天后各組褐飛虱卵巢均進入Ⅳ級(產(chǎn)卵盛期)，交配囊內(nèi)部出現(xiàn)乳白色或淡黃色渾濁，組間差異不大(圖2: B)。

圖2 Ilp基因單干擾以及混合干擾后褐飛虱翅型(A)以及卵巢(B)發(fā)育變化Fig. 2 Changes in wing type (A) and ovarian development (B) of Nilaparvata lugens after single interferenceand mixed interference of Ilp genesDay2, Day6: 分別為成蟲羽化后2和6 d (2 and 6 d after adult emergence, respectively). 圖中箭頭指向褐飛虱翅畸形。Arrows point to deformed wing of N. lugens.

2.3 干擾Ilp基因?qū)诛w虱3種糖類物質(zhì)含量的影響

與注射dsGFP對照組相比較，分別注射dsIlp1-4及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48 h葡萄糖含量均顯著上升(P<0.05)(圖3: B)，72 h后其含量又恢復到與對照組一致的水平。類似地，在注射dsIlp2, dsIlp3以及dsIlp4后48 h糖原含量同樣顯著上升(P<0.05)，而在注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后72 h糖原含量顯著下降(P<0.05)，其他注射組別以及時間點與對照組相比變化不大(圖3: C)。此外，在dsIlp3和dsIlp4注射后48 h， 海藻糖的水平顯著上升(P<0.05)，但在dsIlp2以及dsIlp4注射后72 h海藻糖含量反而顯著下降(P<0.05)，但在注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48 h和72 h海藻糖含量都顯著上升(P<0.05)(圖3: A)。

2.4 干擾Ilp基因?qū)诛w虱海藻糖酶活性的影響

可溶性海藻糖酶的活性在各組dsRNA注射后48 h無顯著變化，但在72 h 后均有顯著性上升(P<0.05)(圖4: A)。膜結(jié)合型海藻糖酶的活性在各組dsRNA注射后48 h同樣無明顯變化，注射72 h后除dsIlp1和dsIlp2組無顯著差異變化外，其余注射組活性均顯著下降(P<0.05)(圖4: B)。

2.5 干擾Ilp基因后褐飛虱海藻糖代謝通路中相關基因的表達變化

結(jié)果表明，分別注射dsIlp1-4后48 h和72 h，褐飛虱TRE1-1和TRE1-2表達量顯著下降(P<0.05)或者極顯著下降(P<0.01)，TRE1-2在dsIlp4注射后72 h表達無顯著變化，且dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4注射后TRE1-1表達量同樣顯著下降(P<0.05)(圖5: A-B)。而在dsIlp1和dsIlp4注射后48 h和72 h、dsIlp2注射后48 h、dsIlp3注射后72 h以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4注射后48 h，TRE2的表達量同樣顯著或極顯著下降(圖5: C)。當分別注射dsIlp1-4以及混合dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4注射后48 h和72 h，除了dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4注射后72 hTPS2表達量未顯著下降(P>0.05)外，與注射dsGFP對照組相比較，海藻糖合成酶基因TPS1和TPS2基因的表達量均極顯著下降(P<0.01)(圖5: D-E)。

圖3 RNAi干擾 Ilp基因后對褐飛虱5齡若蟲海藻糖(A)、葡萄糖(B)和糖原(C)含量的影響Fig. 3 Effect of RNAi of Ilp genes on the contents of trehalose (A), glucose (B) and glycogen (C)in the 5th instar nymphs of Nilaparvata lugens圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；采用t檢驗進行處理組與對照組(dsGFP注射組)間含量差異顯著性檢驗。Data in the figure are mean±SE, and t-test was used to determine the significance of difference in the content between the treatment group and the control group (dsGFP injection group). *P<0.05.

圖4 Ilp基因RNAi后對褐飛虱5齡若蟲可溶性海藻糖酶(A)和膜結(jié)合型海藻糖酶(B)活性的影響Fig. 4 Effect of RNAi of Ilp genes on the activities of the soluble trehalase (A) and membrane-bound trehalase (B)in the 5th instar nymphs of Nilaparvata lugens圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；采用t檢驗進行處理組與對照組(dsGFP注射組)間酶活性差異顯著性檢驗。Data in the figure are mean±SE, and t-test was used to determine the significance of difference in the enzyme activity between the treatment group and the control group (dsGFP injection group). *P<0.05.

圖5 Ilp基因RNAi后對褐飛虱5齡若蟲TRE1-1 (A), TRE1-2 (B), TRE2 (C), TPS1 (D)和TPS2 (E)表達量的影響Fig. 5 Effect of RNAi of Ilp genes on the expression levels of TRE1-1 (A), TRE1-2 (B), TRE2 (C),TPS1 (D) and TPS2 (E) in the 5th instar nymphs of Nilaparvata lugen圖中橫線表示對照組(dsGFP注射組)基因表達量。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；采用t檢驗進行處理組與對照組間基因表達量差異顯著性檢驗。The horizontal line in the figure represents the gene expression level in the control group (dsGFP injection group). Data in the figure are mean±SE and t-test was used to determine the significance of difference in the gene expression level between the treatment group and the control group. *P<0.05;**P<0.01.

3 討論

本研究中，在分別注射dsIlp1-4以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后， 4個靶標基因的表達量均極顯著下降(圖1)，說明本研究中RNAi能夠有效抑制靶標基因的表達。除此之外，在注射了某一個dsIlp之后，盡管4個dsIlp所設計的同源性不高，但4個Ilp基因均同時存在不同程度地下調(diào)，說明4個Ilp基因功能可能之間存在一定的調(diào)節(jié)關系。

大多數(shù)昆蟲Ilps在腦中合成后被分泌到昆蟲血淋巴中，然后被轉(zhuǎn)運到特定的組織或細胞中，和細胞膜上相應的類胰島素受體結(jié)合，激發(fā)下游信號通路，進而發(fā)揮調(diào)控昆蟲生長、發(fā)育、繁殖、代謝、壽命等各個生理活動的作用(N?sseletal., 2015)。前人的研究表明，褐飛虱InR基因通過類胰島素信號途徑?jīng)Q定了褐飛虱的翅型(Xuetal., 2015; Zhangetal., 2019)。在本研究中，當分別注射dsIlp1-4以及dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4之后，褐飛虱均出現(xiàn)了翅型向內(nèi)卷曲或向外平展的畸形現(xiàn)象(圖2: A)，表明褐飛虱4個Ilp基因也可能通過類胰島素信號途徑影響了翅型的正常發(fā)育。但并非同一物種體內(nèi)的不同的Ilp發(fā)揮的作用是一樣的。對果蠅DrosophilaIlp的研究表明，同一物種所擁有的不同類胰島素多肽可能具有不同的調(diào)控作用(N?ssel and Vanden Broeck, 2016)。對褐飛虱的研究同樣也證實了這點。對褐飛虱的研究表明Ilp2或Ilp4的敲低可導致脂肪體卵黃蛋白原的減少(Luetal., 2018)，而本研究中Ilp2的沉默同樣也導致了褐飛虱產(chǎn)卵量的顯著降低(由于除dsIlp2以外注射組生物學重復不足，因此未加入本研究數(shù)據(jù))，且Ilp3敲低后出現(xiàn)了雌性褐飛虱卵巢發(fā)育相對減緩的現(xiàn)象(圖2: B)。這說明Ilp基因可能對褐飛虱繁殖具有重要的調(diào)控作用，但還需要通過檢測卵黃原蛋白和卵黃原蛋白受體基因轉(zhuǎn)錄水平或卵黃原蛋白含量等更進一步的探究來確定Ilp基因在褐飛虱繁殖方面的作用。

昆蟲翅型的發(fā)育涉及幾丁質(zhì)的合成，而幾丁質(zhì)合成起始于海藻糖(Merzendorfer and Zimoch, 2013; Zhuetal., 2016; Tangetal., 2017)，因此Ilp影響翅型發(fā)育的潛在途徑可能是海藻糖代謝。眾所周知，胰島素具有降低血糖的作用，而昆蟲Ilp是胰島素的功能類似物，其同樣在昆蟲體內(nèi)的糖類物質(zhì)調(diào)控中發(fā)揮關鍵作用(Defferrarietal., 2016)，如甜菜夜蛾SeIlp1 以及豆莢螟MvIlp在RNAi后均能增加血淋巴中海藻糖水平(Kim and Hong, 2015; Al Bakietal., 2019)。本實驗結(jié)果表明，分別干擾褐飛虱4個Ilp基因或注射dsIlp1+dsIlp2+dsIlp3+dsIlp4后48 h能夠引起葡萄糖含量的顯著上升(圖3: B)；同樣dsIlp2, dsIlp3以及dsIlp4注射后48 h能夠顯著提高糖原的含量(圖3: C)，注射dsIlp3和dsIlp4后48 h能夠顯著提高海藻糖的含量，但Ilp2與Ilp4低表達后72 h海藻糖的含量顯著降低(圖3: A)。這與其他昆蟲體內(nèi)的Ilp基因類似，不同的Ilp可調(diào)節(jié)不一樣的物質(zhì)，比如果蠅體內(nèi)存在7中類胰島素多肽，其中DIlp2能夠調(diào)節(jié)Ser15處的糖原磷酸化酶(GlyP)的去磷酸化從而調(diào)控糖原代謝，而DIlp5對脂質(zhì)代謝發(fā)揮更大作用(Kannan and Fridell, 2013; Postetal., 2018)。在昆蟲體內(nèi)海藻糖生成最常見的途徑是6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)/6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)途徑，即在TPS的催化作用下，尿苷二磷酸(UDP)葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后在TPP的作用下發(fā)生去磷酸化生成海藻糖(秦加敏等, 2015)。而褐飛虱Ilp低表達后先存在葡萄糖含量升高，后海藻糖含量降低，與TPS/TPP途徑一致，但在時期上有所延遲，中間可能存在間接的信號調(diào)節(jié)，因此本研究在dsRNA注射處理后48 h與72 h糖含量變化存在差異。以上也說明褐飛虱Ilp能夠通過改變葡萄糖、糖原等其他糖類物質(zhì)的含量從而調(diào)控海藻糖水平。

海藻糖酶是已知存在唯一能夠水解海藻糖的酶類，可分為可溶性海藻糖酶與膜結(jié)合型海藻糖酶。褐飛虱體內(nèi)的可溶性海藻糖酶編碼鏈分為兩條，為TRE1-1與TRE1-2(張露等, 2017)。當家蠶幼蟲中注射家蠶素II(一種類胰島素多肽)，其體內(nèi)海藻糖濃度會降低，且海藻糖酶的活性得到提高(Satakeetal., 1997)，而本研究在蛋白質(zhì)水平上檢測了RNAi后褐飛虱體內(nèi)海藻糖酶活性，發(fā)現(xiàn)當Ilp抑制后48 h可溶性海藻糖酶和膜結(jié)合型海藻糖酶活性無顯著性變化，但72 h 后可溶性海藻糖酶的活性顯著上升，而膜結(jié)合型海藻糖酶活性則有所下降(圖4)，說明褐飛虱Ilp基因可能通過改變海藻糖酶活性來調(diào)控海藻糖代謝，但兩種海藻糖酶之間存在拮抗關系，增加了褐飛虱海藻糖代謝的復雜性。隨后又在轉(zhuǎn)錄水平上利用qRT-PCR檢測了3類海藻糖酶基因TRE1-1,TRE1-2與TRE2以及兩類海藻糖合成酶基因TPS1與TPS2的表達量，發(fā)現(xiàn)除了TRE2在dsIlp3注射后48 h表達上升不顯著外，褐飛虱4 個Ilp基因被抑制后會顯著或極顯著下調(diào)TRE與TPS基因(圖5)。而相關研究表明褐飛虱TRE1與TRE2被抑制后均能導致褐飛虱異常蛻皮以及翅型變形或卷曲(Zhangetal., 2017)，這和我們的研究結(jié)果類似。

綜上可知，Ilp基因被抑制后，會引起褐飛虱翅型發(fā)育的畸形，且Ilp3的抑制能引起卵巢發(fā)育的不完全。此外，對Ilp基因的沉默會導致褐飛虱體內(nèi)葡萄糖與糖原的代謝發(fā)生變化，并且引起海藻糖酶基因與海藻糖合成酶基因表達量的下調(diào)，改變海藻糖酶的活性，進而影響海藻糖的代謝。