長(zhǎng)足大竹象消化道不同分段菌群異質(zhì)性及竹木質(zhì)纖維素降解能力

唐 昊, 王明珺, 楊曉雯, 伍 敏, 羅 文, 羅朝兵

(樂(lè)山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院, 四川樂(lè)山 614000)

植食性昆蟲消化道除具備完整的纖維素酶系統(tǒng)外，還棲息著大量細(xì)菌、原生動(dòng)物、真菌和放線菌等(Oppertetal., 2010)。如Cazemier等(2003)在金龜子Pachnodamarginata幼蟲腸道中發(fā)現(xiàn)大量木質(zhì)纖維素降解細(xì)菌，Kim等(2017)從松褐天牛Monochamusalternatus腸道中鑒定出變形菌門(Proteobacteria)與厚壁菌門(Firmicutes)細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其幼蟲在取食不同食物時(shí)腸道微生物的優(yōu)勢(shì)菌屬出現(xiàn)了顯著差異，另在齒小蠹Ipspini、南部松小蠹Dendroctonusfrontalis等昆蟲消化道也發(fā)現(xiàn)了大量具有水解纖維素活性的細(xì)菌(Delaliberaetal., 2005; Rogers and Doran-Peterson, 2010)。這些研究表明昆蟲腸道共生微生物可能在降解昆蟲取食的不同植物木質(zhì)纖維素方面具有重要作用。

昆蟲消化道可以細(xì)分為口器、前腸、中腸和后腸等不同分段，每個(gè)分段包含的細(xì)菌群落不同并具有高度的差異性，說(shuō)明腸道共生微生物群落在腸道不同分段中具有一定的異質(zhì)性(Handiqueetal., 2017; Pereira and Berry, 2017)。如員超(2014)在黃翅大白蟻Macrotermesbarneyi腸道微生物研究中發(fā)現(xiàn)變形桿菌門占中腸微生物總量的96% 以上，而在后腸中則以擬桿菌門(Bacteroidetes)(56.7%)微生物為主，但后腸中微生物群的種類更多且含有一些獨(dú)特的微生物。另有研究表明在東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis腸道中，腸球菌、克雷伯氏菌、乳酸片球菌和威瑟氏菌是優(yōu)勢(shì)微生物，此外，東亞飛蝗腸道的中腸和后腸與前腸相比，具有更多樣化和更穩(wěn)定的微生物群落(龍文敏, 2009)。

目前，16S rRNA測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于許多植食性昆蟲(白蟻、紅棕象甲R(shí)hynchophorusferrugineus、華山松大小蠹Dendroctonusarmandi等)腸道微生物的檢測(cè)和鑒定(Hongohetal., 2006; Warneckeetal., 2007; Huetal., 2013; Muhammadetal., 2017)。對(duì)于長(zhǎng)足大竹象Cyrtotrachelusbuqueti而言，它是取食并危害慈竹、青皮竹和大葉慈竹等叢生竹竹種的主要害蟲(Luoetal., 2018b)，它的腸道微生物參與了宿主對(duì)木質(zhì)纖維素的降解(Luoetal., 2019)，并從其腸道中分離和鑒定出具有纖維素降解能力的菌種(如貝萊斯芽胞桿菌BacillusvelezensisLC1)(Lietal., 2020)。此外，長(zhǎng)足大竹象發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明幼蟲和成蟲階段有大量碳水化合物活性酶(carbohydrate active enzyme, CAZy)基因的表達(dá)(Luoetal., 2018a)。但關(guān)于長(zhǎng)足大竹象消化道各分段的細(xì)菌組成和菌落多樣性的差異尚不明確。本研究利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)長(zhǎng)足大竹象幼蟲不同消化道分段(口器、前腸、中腸和后腸)的共生細(xì)菌組成和多樣性進(jìn)行分析，并對(duì)相關(guān)菌群在木質(zhì)纖維素降解方面的功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)和驗(yàn)證，結(jié)果可以為植食性昆蟲的腸道共生微生物在木質(zhì)纖維素高效降解和竹生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及取樣

長(zhǎng)足大竹象幼蟲于2019年8月在四川省沐川縣(28°96′N, 103°98′E)采集。采樣方法：用刀將已有長(zhǎng)足大竹象幼蟲鉆食的竹筍切開(kāi)，從中取出幼蟲，同時(shí)采集新鮮的高度為30 cm的竹筍，一同迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。將25頭健康且生長(zhǎng)趨勢(shì)一致的5齡幼蟲平均分成5組，分別放入5個(gè)飼養(yǎng)盒中后，同時(shí)投入等量新鮮去殼竹筍，將飼養(yǎng)盒放置于溫度25±1℃和相對(duì)濕度70%±10%的黑暗環(huán)境下12 h。

無(wú)菌操作臺(tái)上分別用75%酒精及無(wú)菌水反復(fù)擦拭處理幼蟲體表5次后，使用無(wú)菌解剖工具取出消化道，并將口器(YB)、前腸(YFG)、中腸(YMG)和后腸(YHG)各段切斷分離，分別放置于2 mL凍存管，液氮速凍后-80℃?zhèn)溆谩?其中每個(gè)樣本包含5頭幼蟲消化道分段，所有實(shí)驗(yàn)操作生物學(xué)重復(fù)5次。

1.2 DNA提取及16S rRNA測(cè)序

按照試劑盒說(shuō)明，使用E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(D4015，Omega，美國(guó))從長(zhǎng)足大竹象5齡幼蟲不同消化道分段口器、前腸、中腸和后腸中提取DNA，-20℃下儲(chǔ)存并用于測(cè)序。

采用正向引物338F(5′-ACTCCGGGAGCAG CAG-3′)和反向引物806R(5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體 系(25 μL): 模板DNA 50 ng, Phusion Hot Start Flex 2×Master Mix(NEB, M0536L)12.5 μL, 正反向引物(20 μmol/L)各2.5 μL, ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序: 98℃預(yù)變性30 s; 98℃變性10 s, 54℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 30個(gè)循環(huán); 72℃終延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后用Ampre XTbeads(Beckman Coulter Genomics，美國(guó))純化，然后用Qubit(Invitrogen，美國(guó))定量。構(gòu)建擴(kuò)增子池進(jìn)行測(cè)序，并分別用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent，美國(guó))和Library Quantification Kit(Kapa Biosciences，美國(guó))評(píng)估擴(kuò)增子文庫(kù)的質(zhì)量。PhiX Control Library(v3)與擴(kuò)增子文庫(kù)(預(yù)計(jì)為30%)相結(jié)合后，利用Illumina MiSeq儀器(Illumina Inc., San Diego, 美國(guó))和標(biāo)準(zhǔn)Illumina測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。

1.3 長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道細(xì)菌多樣性與組成分析

使用QIIME v1.9.1(http:∥qiime.org/)(DeSantisetal., 2006; Caporasoetal., 2010; Edgar, 2010; Edgaretal., 2011)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行序列分析，構(gòu)建可操作的分類單元(OTU)豐度表，最終獲得一個(gè)改進(jìn)的OTU豐度表(Bokulichetal., 2013)。利用PyNAST(v1.2.2)(Caporasoetal., 2009)進(jìn)行多序列比對(duì)，利用FastTree(v2.1.9)(Priceetal., 2009)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)?；谙到y(tǒng)發(fā)育樹(shù)和改進(jìn)的OTU豐度表，用QIIME腳本計(jì)算α多樣性(ACE index, Chao1 index, Shannon-Wiener index, Simpson index, 檢測(cè)到的OTUs和PD whole tree index等)，并用phyloseq軟件包(v1.20.0)估算β多樣性(Bray Curtis，加權(quán)和未加權(quán)UniFrac)(McMurdie and Holmes, 2013)。α及β多樣性數(shù)據(jù)均用R程序(v3.4.1)進(jìn)行可視化處理。

1.4 組間豐度差異分析

用DESeq2(v1.16.1)分析組間豐度差異的OTU(Padj<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)(Loveetal., 2014)。使用Metastats分析(依賴于非參數(shù)t檢驗(yàn))分析不同分類等級(jí)的微生物豐度差異(Whiteetal., 2009)。樣品中微生物的相對(duì)豐度按樣品總讀數(shù)歸一化讀數(shù)計(jì)數(shù)計(jì)算，相對(duì)豐度在所有樣品中小于1%的微生物被歸類為“其他”(P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。使用EDDA R包(v1.10.0)(Luoetal., 2014)進(jìn)行Metastats分析。

采用LDA效應(yīng)大小(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)算法鑒定在不同消化道分段中具有差異豐度的生物標(biāo)志物(Segataetal., 2011)。本研究所有生物標(biāo)志物均采用大于3(log10尺度)的效應(yīng)大小閾值。

1.5 功能分析

PICRUSt軟件(v1.1.2)可以預(yù)測(cè)不同宏基因組的功能，并按樣本類型分組(http:∥picrust.github.io)(Langilleetal., 2013)。本研究利用PICRUSt基于16S rRNA數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)其功能。首先，通過(guò)使用QIIMEv1.9.1并根據(jù)參考集合查詢數(shù)據(jù)(GreenGenes數(shù)據(jù)庫(kù)，13.8)(http:∥greengenes.lbl.gov)，其中OTU的識(shí)別率為97 %。由此得到的OTU用于PICRUSt微生物群落宏基因組預(yù)測(cè)，同時(shí)PICRUSt被用于推導(dǎo)相對(duì)京都基因和基因組百科全書(KEGG)途徑豐度。將不同消化道分段中細(xì)菌相對(duì)豐度≥5%的屬定義為核心屬(Turnbaughetal., 2009)。為了探究長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段共生細(xì)菌木質(zhì)纖維素降解潛力，本研究在屬水平分析了不同消化道分段核心菌群的碳水化合物活性酶(CAZy)。利用dbCAN網(wǎng)頁(yè)包含的隱馬爾可夫算法對(duì)核心屬菌群進(jìn)行了CAZy的注釋(Yinetal., 2012)，隨后與木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化的模式菌哈氏噬纖維菌CytophagahutchinsoniiATCC 33406(Xieetal., 2007)比較了CAZy的種類和數(shù)量。

1.6 體外降解竹筍粉

為探討長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群對(duì)竹筍木質(zhì)纖維素的降解效率，使用已早期木質(zhì)化的竹筍在65℃下干燥至恒重，使用粉碎機(jī)粉碎成顆粒，并通過(guò)40目篩網(wǎng)過(guò)濾。按照1.1節(jié)方法制備幼蟲消化道分段樣本，無(wú)菌冰浴條件下研磨樣本，加入1 mL無(wú)菌水制成口器混合菌(MPJ)、前腸混合菌(FJ)、中腸混合菌(MJ)和后腸混合菌(HJ)懸液后，將混合菌懸液直接分別接種于液體培養(yǎng)基1(0.04 g酵母提取物, 0.1 g麥芽提取物, 2 g CaCO3和10 g竹筍粉, pH 7.2)中培養(yǎng)15 d。將2 mL培養(yǎng)物接種至到體培養(yǎng)基2(0.5 g酵母提取物, 0.5 g麥芽提取物, 0.5 g NaCl, 0.2 g KH2PO4, 0.13 gMgSO4·7H2O和0.5 g CaCl2, pH 7.2)中，37℃和150 r/min條件下恒溫培養(yǎng)6 d。反應(yīng)產(chǎn)物于100℃下處理30 min后，13 000 r/min離心10 min，然后收集沉淀物并在65℃下干燥至恒重。稱重干燥沉積物，測(cè)定纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量，并用于掃描電鏡。

采用Van-Soest法(Van Soestetal., 1991)定量木質(zhì)纖維素含量，其中：

半纖維素含量=中性洗滌纖維-酸性洗滌纖維；

纖維素含量=酸性洗滌纖維-酸性洗滌劑木質(zhì)素；

木質(zhì)素含量=酸性洗滌劑木質(zhì)素-灰分；

半纖維素降解效率=

纖維素降解效率=

木質(zhì)素降解效率=

沉淀物經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理6 d后，研磨至粉狀，取適量粉末樣品用導(dǎo)電膠布貼于圓形貼片上，在成像之前，使用E-1010濺射鍍膜機(jī)(日本)將金噴涂到約10 nm的厚度。用掃描電鏡(Hitachi 3400N, Japan)進(jìn)行分析，觀察樣品的表面形貌，掃描電鏡的工作電流和電壓分別為81 mA和10 kV。

1.7 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS19.0(IBM SPSS, Armonk, NY，美國(guó))進(jìn)行。描述性數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。t檢驗(yàn)用于比較兩組的平均值；采用方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏新多重極差檢驗(yàn)進(jìn)行兩組以上的組間比較。P<0.05表明存在顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群多樣性

測(cè)序結(jié)果顯示(圖1)，從5個(gè)口器(YB)、5個(gè)前腸(YFG)、5個(gè)中腸(YMG)和5個(gè)后腸(YHG)樣本共獲得1 195 526個(gè)raw reads，其中在YB, YFG, YMG和YHG樣本中分別有299 142, 339 069, 311 074和246 241 raw reads。α多樣性結(jié)果表明，YFG菌群包含的物種多樣性最高，YB最低。另外 YB組α多樣性指數(shù)中Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)、檢測(cè)到的OTU數(shù)目和PD whole tree指數(shù)與其他組之間存在顯著差異(P<0.05)，而YFG, YMG和YHG間無(wú)顯著差異(P>0.05)，在消化道各段菌群多樣性和豐富度呈現(xiàn)基本相似，YFG, YMG和YHG多樣性大于YB多樣性。

另對(duì)不同分段的菌群進(jìn)行了β多樣性分析，結(jié)果顯示YB, YFG, YMG和YHG中不同細(xì)菌門的相對(duì)豐度相似，相對(duì)豐度最高的為放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroides)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)(圖2: A)。此外，以6種相對(duì)豐度最高的OTUs，分別為鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas,Allobaculum, 阿克曼菌屬Akkermansia,Odoribacter, 普氏菌屬Prevotella和乳桿菌屬Lactobacillus進(jìn)行限制性主成分分析(圖2: B)，結(jié)果表明YFG, YHG和YMG菌群分布相對(duì)集中，菌群中微生物的組成差異較小，但YB與YFG, YHG和YMG在菌群組成上差異較大。

圖2 長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群門水平非加權(quán)算術(shù)平均組群方法進(jìn)化樹(shù)(A)和屬水平主成分分析(B)Fig. 2 Unweighted pair group method with arithmetic averages phylogenetic tree at the phylum level (A) and principal componentanalysis at the genus level (B) of microbiota in different sections of the alimentary canal of larval Cyrtotrachelus buqueti基于豐度最高的鞘氨醇單胞菌屬, Allobaculum, 阿克曼菌屬, Odoribacter, 普氏菌屬和乳桿菌屬進(jìn)行限制性主成分分析。Principal component analysis was based on Sphingomonas, Allobaculum, Akkermansia, Odoribacter, Prevotella and Lactobacillus with the highest abundance.

2.2 長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群組成及功能預(yù)測(cè)

對(duì)長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群進(jìn)行了可操作分類單元(OTUs)門和屬組成的鑒定，一共鑒定出19個(gè)門，其中12個(gè)門是所有樣本共有，包括酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門等(圖3: A, B)。YFG, YMG和YHG中，厚壁菌門(占36.1%～43.5%)、擬桿菌門(占29.7%～33.6%)和變形菌門(占10.9%～16.2%)的豐度最高，而YB中的變形菌門、厚壁菌門和放線菌門相對(duì)豐度最高。此外鑒定到92屬，其中34個(gè)屬是所有樣本共有，其中YB, YFG, YMG和YHG中分別鑒定出12, 6, 2和8個(gè)特有的屬(圖3: C, D)。在YB樣本中，鞘氨醇單胞菌屬(占17.6%)、糞桿菌屬Faecalibacterium(占14.0%)、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium(占9.3%)、分枝桿菌屬M(fèi)ycobacterium(占7.6%)和詹森菌屬Janthinobacterium(占6.3%)相對(duì)豐度最高。YFG樣本中阿克曼菌Akkermansia(占11.8%)、Odoribacter(占7.2%)、顫螺菌屬Oscillospira(占6.4%)、擬桿菌屬Bacteroides(占5.9%)、Allobaculum(占5.6%)、鞘氨醇單胞菌屬(占5.6%)和Adlercreutzia(占5.5%)7個(gè)屬相對(duì)豐度最高。YMG中相對(duì)豐度最高的5個(gè)屬是Allobaculum(占12.8%)、阿克曼菌屬(占8.3%)、顫螺菌屬(占7.3%)、普氏菌屬(占5.9%)和Adlercreutzia(占5.2%)，而YHG樣本中所有屬相對(duì)豐都均小于10%，其中普氏菌屬(占9.8%)、乳桿菌屬(占9.3%)、Odoribacter(占7.6%)、Allobaculum(占7.4%)、擬桿菌屬(占5.8%)和阿克曼菌屬(占5.5%)6個(gè)屬相對(duì)豐度最高。

對(duì)長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群在KEGG L2水平進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)，結(jié)果表明不同分段菌群的功能可分為2類：一類包括核苷酸代謝(nucleotide metabolism)、能量代謝(energy metabolism)和人類疾病、癌癥(human diseases; cancer)等途徑，主要富集于YFG, YHG和YMG；另一類包括外源物生物降解和代謝(xenobiotics biodegradation and metabolism)、其他氨基酸代謝(metabolism of other amino acids)和環(huán)境信息處理(environmental information processing)，主要富集于YB中(圖4)。

2.3 長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段核心屬菌群的碳水化合物活性酶(CAZy)分析

木質(zhì)纖維素，如纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的降解需要多種碳水化合物活性酶(CAZy)。結(jié)果表明長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群一共有13個(gè)屬被鑒定為核心屬，其中YB, YFG, YMG和YHG分別鑒定出5, 7, 6和5個(gè)屬，此外普氏菌屬、Odoribacter、Allobaculum、擬桿菌屬、阿克曼菌屬、顫螺菌屬、Adlercreutzia和鞘氨醇單胞菌屬至少在兩個(gè)消化道分段中相對(duì)豐度≥5%(表1)。除去分枝桿菌屬和Allobaculum無(wú)基因組外，剩余11屬包括鞘氨醇單胞菌屬(23株系)、糞桿菌屬(6株系)、甲基桿菌屬(15株系)、詹森菌屬(9株系)、阿克曼菌屬(25株系)、Odoribacter(2株系)、顫螺菌屬(1株系)、擬桿菌屬(34株系)、Adlercreutzia(1株系)、普氏菌屬(26株系)和乳桿菌屬(30株系)的細(xì)菌基因組與木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化的模式菌哈氏噬纖維菌CytophagahutchinsoniiATCC 33406比較碳水化合物活性酶的種類和數(shù)量(表2)，結(jié)果表明擬桿菌屬細(xì)菌基因組中碳水化合物活性酶的數(shù)量最多，包括糖基水解酶、碳水化合物酯酶、多糖裂解酶和碳水化合物結(jié)合模塊。甲基桿菌屬細(xì)菌基因組中糖基轉(zhuǎn)移酶中的數(shù)量高于其他菌屬細(xì)菌基因組，包括哈氏噬纖維菌ATCC 33406。此外，輔助活性(AA)在木質(zhì)素解聚過(guò)程中起著重要作用，但只有部分詹森菌屬、甲基桿菌屬和乳桿菌屬細(xì)菌基因組中存在少數(shù)輔助活性酶。這些結(jié)果表明這些核心屬菌群基因組中存在豐富的碳水化合物活性酶，可能在木質(zhì)纖維素降解中發(fā)揮重要作用。

表2 長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群核心屬細(xì)菌基因組中CAZy基因數(shù)量Table 2 Total numbers of putative CAZy genes in the genomes of bacteria belonging to core genera in different sections of the alimentary canal of larval Cyrtotrachelus buqueti

圖4 長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群KEGG功能分類Fig. 4 KEGG function classification of microbiota in different sections of the alimentary canal of larval Cyrtotrachelus buqueti

2.4 長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群對(duì)竹筍粉的體外降解

我們利用不同分段的混合菌進(jìn)行了竹筍粉體外降解實(shí)驗(yàn)，掃描電鏡的觀察結(jié)果表明，竹筍粉原始樣品中木質(zhì)纖維素表面粗糙，表面有溝壑，結(jié)構(gòu)致密(圖5: A)。長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段混合菌MPJ, FJ, MJ和HJ懸液處理6 d后，竹筍粉細(xì)胞壁變薄，纖維素空腔擴(kuò)大，表面出現(xiàn)大量裂紋，竹筍粉表面存在一些皺褶和孔洞(圖5: B-E)。通過(guò)對(duì)竹筍粉降解前后微觀結(jié)構(gòu)的比較，發(fā)現(xiàn)竹筍粉的組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，表明部分組織被混合菌降解。MPJ, FJ, MJ和HJ菌懸液在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)竹筍粉纖維素的降解率分別為21.7%, 39.9%, 44.2%和21.0%；對(duì)半纖維素降解率分別為72.7%, 52.3%, 65.7%和61.5%，對(duì)木質(zhì)素降解率分別為20.5%, 41.3%, 39.9%和37.9%(圖5: F-H)。這些結(jié)果表明共生菌群可降解纖維素、木質(zhì)素和半纖維素，其中半纖維素的降解效率最高，中腸混合菌(MJ)纖維素降解效率最高。

圖5 長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段菌群對(duì)竹筍粉體外降解Fig. 5 In vitro degradation of bamboo shoot particles (BSPs) by microbiota in different sectionsof the alimentary canal of larval Cyrtotrachelus buquetiA: 對(duì)照組竹筍粉微結(jié)構(gòu)Microstructure of BSPs in the control group; B: MPJ處理后竹筍粉的微結(jié)構(gòu)Microstructure of treated BSPs by MPJ; C: FJ處理后竹筍粉的微結(jié)構(gòu)Microstructure of treated BSPs by FJ; D: MJ處理后竹筍粉的微結(jié)構(gòu)Microstructure of treated BSPs by MJ; E: HJ處理后竹筍粉的微結(jié)構(gòu)Microstructure of treated BSPs by HJ; F: 竹筍粉中纖維素降解效率Degradation efficiency of cellulose in BSPs; G: 竹筍粉中半纖維素降解效率Degradation efficiency of hemicellulose in BSPs; H: 竹筍粉中木質(zhì)素降解效率Degradation efficiency of lignin in BSPs. MPJ: 口器混合菌Mouthpart mixed bacteria; FJ: 前腸混合菌Foregut mixed bacteria; MJ: 中腸混合菌Midgut mixed bacteria; HJ: 后腸混合菌Hindgut mixed bacteria.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道YB分段的菌群與YFG， YMG和YHG分段的菌群在多個(gè)多樣性指數(shù)上存在顯著差異(圖1)，另外YFG分段的菌群多樣性最高，而YB最低，這與以白蟻為代表的昆蟲腸道不同分段菌群間存在異質(zhì)性的研究結(jié)論(Warneckeetal., 2007; Yangetal., 2005)類似。

值得注意的是，在YFG， YMG和YHG分段分段中，普氏菌屬、Odoribacter、Allobaculum、擬桿菌屬、阿克曼菌屬、顫螺菌屬、Adlercreutzia至少在兩個(gè)消化道分段中相對(duì)豐度≥5%，但細(xì)分到具體的分段腸道中，優(yōu)勢(shì)菌屬又存在一定的差異，也預(yù)示著不同消化道分段種細(xì)菌發(fā)揮的功能也存在差異，如Allobaculum在不同分段中相對(duì)豐度表現(xiàn)為后腸>中腸>前腸>口器(表1)，且其他研究顯示Allobaculum可產(chǎn)生少量短鏈脂肪酸并將其在腸道中進(jìn)行選擇性的富集(Zhangetal., 2012)。此外，在4個(gè)腸道分段中，擬桿菌門的細(xì)菌均被檢測(cè)到(圖2)且菌群中擬桿菌屬相對(duì)豐度在前腸和中腸中>5%(表1； 圖3)，基因組中注釋到的碳水化合物活性酶編碼基因的數(shù)量最多(表2)，因而推測(cè)該屬的細(xì)菌在降解纖維素上將發(fā)揮較大的作用，這與Robert等(2007)報(bào)道的擬桿菌屬的Bacteroidescellulosilyticussp. nov.具有降解膳食纖維中多聚糖能力的結(jié)論相類似。相對(duì)而言，長(zhǎng)足大竹象幼蟲在消化道口器中甲基桿菌和鞘氨醇單胞菌等核心屬豐度比前腸、中腸和后腸中更高(表1)，其中甲基桿菌能分泌1,4-葡萄糖苷酶(Ferreira Filhoetal., 2012)，鞘氨醇單胞菌能降解芳香族化合物(Schuleretal., 2008)等，這說(shuō)明口器中含有的菌群在纖維素和木質(zhì)素的降解上具有極大的潛力。

Hong等(2010)的研究表明昆蟲消化道菌群異質(zhì)性不僅可以反映腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，也可以影響其功能的發(fā)揮，而本研究的結(jié)果也印證了這一觀點(diǎn)，在長(zhǎng)足大竹象幼蟲消化道不同分段中，細(xì)菌群落的異質(zhì)性與不同分段優(yōu)勢(shì)菌屬細(xì)菌含有的碳水化合物活性酶編碼基因數(shù)量的不同，將影響菌群在竹木質(zhì)纖維素降解中發(fā)揮的作用(圖5)。因此，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了植食性昆蟲的腸道共生微生物在木質(zhì)纖維素降解利用上潛在價(jià)值，也可以為竹生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化利用提供部分參考信息。