鐵狀態(tài)和前列腺癌因果關(guān)系的孟德爾隨機化研究*

謝 興，宋 瓊，侯晨陽，王慧豐，蒙珊珊，梁婷婷，魏銀峰，黎有成，林耀旺，胡艷玲、5△

（廣西醫(yī)科大學(xué) 1.生命科學(xué)研究院；2.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心；3.信息與管理學(xué)院；4.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；5.基因組與個性化醫(yī)學(xué)研究中心；7.長壽與老年相關(guān)疾病教育部重點實驗室，南寧 530021；6.廣西貴港市人民醫(yī)院臨床檢驗科，貴港 537138）

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是世界范圍內(nèi)老年男性最常見的上皮性惡性腫瘤之一，也是男性癌癥死亡的第五大原因[1]。在美國每年大約有3 萬男性死于PCa[2]，我國隨著老年人口的增加，近年來PCa的發(fā)病率也呈上升趨勢[3]。因此，確定PCa的危險因素是目前PCa的防治的一個主要任務(wù)。鐵是與人類健康密切相關(guān)的微量元素之一，在神經(jīng)遞質(zhì)的復(fù)制、代謝和產(chǎn)生中起著至關(guān)重要的作用[4-5]。在PCa 中，鐵是調(diào)節(jié)雄激素受體轉(zhuǎn)錄功能的重要輔助因子[6-7]。此外，鐵還是控制人類PCa 細(xì)胞生物能量和細(xì)胞增殖的酶的組成部分[8]。幾項早期研究表明，體內(nèi)鐵含量的增加會提高癌癥的患病風(fēng)險[9-10]。然而，在一項基于人群的前瞻性研究中，鐵狀況與PCa 沒有顯著的相關(guān)性[11]。因此，鐵和PCa 的關(guān)系目前一直存在著爭議。

孟德爾隨機化法（Mendelian randomization，MR）使用基因變異作為工具變量來評估一個潛在因素是否對疾病結(jié)果有因果影響[12]。與傳統(tǒng)的流行病學(xué)研究相比，本研究選擇單核苷酸多態(tài)性位點（nucleotide polymorphisms，SNP）作為工具變量可以避免暴露因素與結(jié)局的關(guān)系受到環(huán)境因素等混淆因素的影響，此外，SNP 作為工具變量是隨著配子隨機分配到個體，符合類似于隨機對照試驗的要求，同時是先于疾病的發(fā)生，具有時序性，可避免反向因果關(guān)系帶來的影響。但是，一個有效的工具變量需要符合三個重要的假設(shè)[13]：基本的假設(shè)是工具變量應(yīng)該與暴露因素密切相關(guān)。第二個假設(shè)是工具變量與混雜因素之間不存在聯(lián)系。第三，工具變量應(yīng)僅通過暴露因素而不通過任何其他途徑影響結(jié)果。當(dāng)工具變量滿足這些假設(shè)時，孟德爾隨機化法將提供一個有效的估計。因此，本研究旨在通過孟德爾隨機化法探究PCa 與鐵的因果關(guān)系，為PCa預(yù)防和治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究獲得與鐵狀態(tài)密切相關(guān)的SNPs數(shù)據(jù)來源于一項全基因組關(guān)聯(lián)分析的meta分析，該數(shù)據(jù)庫基于the Genetics of Iron Status數(shù)據(jù)庫，是目前關(guān)于血清鐵、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度和轉(zhuǎn)鐵蛋白最大的數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫包含了48 972個具有歐洲血統(tǒng)的研究個體，發(fā)現(xiàn)11個與鐵狀態(tài)密切相關(guān)的SNP位點[14]。

PCa 匯總數(shù)據(jù)來自the Prostate Cancer Association Group to Investigate Cancer-Associated Alterations in the Genome (PRACTICAL) consortium 數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫匯總了來自108 個GWAS 研究的140 254個樣本，其中PCa病例人數(shù)為79 148個，對照人數(shù)為61 106 個，包括超過570 000 個SNP[15-16]。該數(shù)據(jù)庫還從以前的研究中刪除重疊的樣本，并進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)量控制。數(shù)據(jù)下載鏈接為：http://practical.icr.ac.uk/blog/?page_id=8164。

體重指數(shù)（Ibm）和吸煙的SNPs 數(shù)據(jù)是來自Genetic Investigation of Anthropometric Traits (GIANT)consortium 和the UK BioBank，包含了694 649 名歐洲血統(tǒng)個體[17]。其他混淆因素如：低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和甘油三酯的數(shù)據(jù)來自于全基因組關(guān)聯(lián)分析。

1.2 工具變量的選擇 為了更好的探究鐵狀態(tài)和PCa 的因果關(guān)系，我們選擇與的SNP 需滿足的標(biāo)準(zhǔn)為：（1）SNP與鐵狀態(tài)之間高度關(guān)聯(lián)，具有全基因組學(xué)的研究意義，即P＜5×10-8。（2）SNP 之間相互獨立，避免兩者之間由連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)產(chǎn)生的偏移，當(dāng)LD的R2＞0.01時，將其中一個剔除[18]。SNP之間的連鎖不平衡通過在線數(shù)據(jù)庫LDlink（https://ldlink.nci.nih.gov/）計算。本研究包括了四種鐵的生物標(biāo)志物：鐵蛋白、血清鐵、轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。因為體內(nèi)鐵濃度與鐵蛋白、血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和升高以及轉(zhuǎn)鐵蛋白降低有關(guān)。因此，把與血清鐵、鐵蛋白濃度、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度增加和轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度降低整體有關(guān)的SNP 作為傳統(tǒng)組[19]，11個SNPs中有3個SNP滿足傳統(tǒng)組的條件。同時，本研究選擇與四種鐵的生物標(biāo)志物強相關(guān)的SNP作為自由組。

1.3 工具變量的評估 為了確保工具變量與暴露因素之間是強相關(guān)性，通常用每個SNP 的F值來判斷相關(guān)性強度，避免弱工具變量產(chǎn)生的偏倚[20]，當(dāng)F值大于10 時，一般認(rèn)為不存在弱工具變量的偏倚，使用在線工具計算了每個SNP對PCa的MR分析的統(tǒng)計效力[21]（http://cnsgenomics.com/shiny/mRnd/）。在孟德爾隨機化中，要確保工具變量與混雜因素相互獨立，不能通過混雜因素間接的與結(jié)局變量產(chǎn)生聯(lián)系。為此通過SNPs 是否與混淆因素相關(guān)來排除與混淆因素相關(guān)的SNP。

1.4 兩樣本孟德爾隨機化 孟德爾隨機化通過以下三種MR 方法來估計鐵狀態(tài)與PCa 之間的關(guān)系：逆方差加權(quán)法（inverse-variance weighted，IVW），MR-Egger 回歸和加權(quán)中位數(shù)法（weighted median，WM）。IVW 是常用的方法之一，但是它的前提是所有的工具變量都要是有效的，只要有一個SNP不滿足工具變量的假設(shè)，此方法就會產(chǎn)生偏倚。雖然，多個遺傳變異可以增強孟德爾隨機化分析的統(tǒng)計能力，但由于多效性的存在，當(dāng)一些遺傳變異不滿足工具變量的假設(shè)時，鐵狀態(tài)與PCa 之間的因果關(guān)系就會出現(xiàn)偏差[20]，但是當(dāng)50%的SNPs為有效的工具變量時，WM可以得到與最終效應(yīng)相符合的估計[22]。在工具變量獨立于直接效應(yīng)的內(nèi)部假設(shè)下，即使所有SNP 都是無效的工具變量，MR-Egger 回歸提供了一個有效的效應(yīng)估計[23]。

1.5 敏感性分析及異質(zhì)性檢驗 為了進(jìn)一步評價異質(zhì)性對因果估計的影響，Cochran's Q檢驗用于評估工具變量的異質(zhì)性檢驗[24]，同時，依次剔除一個SNP，剩下的SNP繼續(xù)進(jìn)行孟德爾隨機化法的分析，即留一法（leave one out，LOO）對結(jié)果進(jìn)行敏感性分析[25]。利用R 軟件（v3.6.1 https://www.r-project.org）中TwoSampleMR包進(jìn)行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鐵狀態(tài)與PCa 的SNPs 信息 表1 列出了傳統(tǒng)組和自由組中的SNPs 信息，包括了傳統(tǒng)組的3 個SNPs，分別是rs1800562、rs1799945和rs855791。其中在同一染色體上的rs1800562與rs1799945相互獨立（R2=0.009）。自由組中，有5 個與血清鐵相關(guān)的SNPs、6個與鐵蛋白的相關(guān)SNPs、5個與轉(zhuǎn)鐵蛋白飽相關(guān)的SNPs、9 個與轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)的SNPs。rs855791 以及它的代理SNP 在PCa PRACTICAL 數(shù)據(jù)庫中不存在，所以獲取不了該SNP位點在PCa全基因組關(guān)聯(lián)分析的信息。rs651007 在PRACTICAL數(shù)據(jù)庫中不存在，但是其代理SNP rs495828（R2=1.000）卻存在，則用代理SNP 進(jìn)行計算。獲取的所有SNPs都是強工具變量，其F值范圍為31～3 340，不存在弱工具變量帶來的偏倚。

表1 鐵狀態(tài)相關(guān)的SNP特征及其在PCa中的作用

2.2 工具變量與PCa 危險因素的關(guān)系 為了確定鐵狀態(tài)與PCa 潛在風(fēng)險因素之間的關(guān)系，調(diào)查了工具變量是否與Ibm 和吸煙有關(guān)，表2 顯示出SNP 與Ibm、吸煙無關(guān)（均P＞0.05）。

表2 PCa危險因素與SNP相關(guān)性的P值

2.3 孟德爾隨機化法估算結(jié)果 在逆方差加權(quán)的分析中，血清鐵與PCa 存在因果關(guān)系（OR=0.910，95%CI：0.833～0.995，P=0.039）。而鐵蛋白、鐵蛋白飽和度和轉(zhuǎn)鐵蛋白與PCa無因果關(guān)系(鐵蛋白：OR=0.915，95%CI：0.820～1.032，P=0.147；轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度：OR=0.948，95%CI：0.899～1.001，P=0.055；轉(zhuǎn)鐵蛋白：OR=0.986，95%CI：0.931～1.030，P=0.457)。在傳統(tǒng)組中，鐵狀態(tài)與PCa 風(fēng)險之間存在明顯的因果關(guān)系（OR=0.879，95%CI：0.813～0.950，P=0.001）。見圖1。

2.4 敏感性分析 為了保證本研究的可信度，采用MR-Egger 方法對工具變量進(jìn)行了測試。如圖2 顯示，遺傳多效性不會對結(jié)果造成偏倚(截距分別為0.000、0.005、-0.001 和-0.002；P＞0.05)。同時，用IVW 方法觀察到SNP 之間的異質(zhì)性較小(血清鐵：Q=0.88，P=0.64；鐵蛋白：Q=3.10，P=0.375；轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度：Q=5.50，P=0.484；轉(zhuǎn)鐵蛋白：Q=1.48，P=0.476)。此外，還進(jìn)行了文獻(xiàn)檢索，以確定SNP與其他暴露因素之間的聯(lián)系。發(fā)現(xiàn)四個SNP(rs1800562，rs4921915，rs174577，rs651007)與低密度脂蛋白，甘油三酯和膽固醇有關(guān)，見表3。當(dāng)去除這四個SNP時，通過逆方差加權(quán)的分析，結(jié)果沒有發(fā)生實質(zhì)性變化(血清鐵OR=0.862，95%CI：0.780～0.951，P=0.003；轉(zhuǎn)鐵蛋白：OR=1.100，95%CI：0.763～1.586，P=0.611；轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度：OR=1.089，95%CI：0.949～1.251，P=0.224；轉(zhuǎn)鐵蛋白：OR=1.010，95%CI：0.950～1.074，P=0.747)。在敏感性的分析中，我們依次剔除一個SNP，把剩下的SNPs 進(jìn)行分析，并沒有存在一個SNP對結(jié)果效應(yīng)產(chǎn)生很大的影響,見圖3。

圖1 鐵狀態(tài)與PCa的孟德爾隨機化法結(jié)果

圖2 IVW、MR-egger回歸和WM散點圖研究鐵狀態(tài)對PCa的影響

表3 鐵狀態(tài)相關(guān)的SNP在膽固醇中的作用

圖3 留一法敏感性分析

3 討論

本研究通過孟德爾隨機化法來探討歐洲人群不同鐵狀況與PCa的關(guān)系，結(jié)果表明，血清鐵與PCa存在因果關(guān)系，但鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度和轉(zhuǎn)鐵蛋白與PCa沒有相關(guān)性。

如前所述，當(dāng)MR 模型中的三個假設(shè)得到滿足時，因果估計的有效性是最有效的。首先，選擇了11個顯著相關(guān)且相互獨立的SNP位點，它們與鐵狀態(tài)密切相關(guān)，同時，每個SNP的F值的范圍為31～3 340，均大于10，為強工具變量。此外，該研究的SNP的數(shù)據(jù)信息均來自歐洲人群，一定程度上避免了人群不同帶來的偏倚。第二，為了更好地處理孟德爾隨機化法的研究中多效性帶來的偏倚，我們通過文獻(xiàn)查詢來確認(rèn)與其他混淆因素相關(guān)的SNP。其中四個SNP（rs1800562、rs4921915、rs6486121 和rs174577）與低密度脂蛋白膽固醇，甘油三酯和膽固醇有關(guān)。由于血脂是在一定程度上是引起PCa的危險因素。因此，當(dāng)去除這四個SNP后，MR估計的結(jié)果并沒有發(fā)生變化。此外，在本研究中，MR-Egger方法的截距分別接近0（P＞0.05），表明沒有由未知因素引起的多效性。最后，在Genetic Investigation of Anthropometric Traits (GIANT) consortium 和the UK BioBank 兩個數(shù)據(jù)庫中也沒有發(fā)現(xiàn)所選的SNP與吸煙和飲酒相關(guān)。因此，所選的SNPs 以及研究結(jié)果都是可靠的。

鐵是人體必需的微量元素之一，維持人體正常的生理功能，在富含鐵的狀態(tài)下有助于癌細(xì)胞生長[26-27]。Bystrom等人發(fā)現(xiàn)腫瘤患者由于代謝異常，血清鐵濃度通常會下降。此外，Chua等[28]發(fā)現(xiàn)較高的血清鐵濃度與降低男性非皮膚癌的風(fēng)險有關(guān)。同時，降低血清鐵濃度可以上調(diào)PCa 細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的表達(dá)，促進(jìn)鐵進(jìn)入細(xì)胞，加速PCa 的惡化[29-30]。這些論點進(jìn)一步支持了鐵狀態(tài)與PCa具有因果關(guān)系的結(jié)論。進(jìn)一步了解鐵在PCa 中的作用，通過調(diào)節(jié)鐵代謝，有望成為抗腫瘤治療的新方向[31].

目前Kazmi等[32]使用孟德爾隨機化法來研究飲食、營養(yǎng)和體力活動與PCa 的因果關(guān)系。該研究從飲食和營養(yǎng)的角度來看，血清鐵可能與整個PCa 呈因果關(guān)系。由于鐵以不同的形式存在于體內(nèi)，探索四種鐵生物標(biāo)志物與PCa的關(guān)系將是確定鐵是否是PCa 危險因素的更好方法。Yuan 用英國生物庫的數(shù)據(jù)研究了鐵狀況與癌癥的因果關(guān)系。結(jié)果表明，血清鐵與PCa 之間沒有因果關(guān)系，Yuan 等[33]的研究中，PCa患者的病例數(shù)為7 872個體，因此，當(dāng)本研究使用目前最大的PCa 全基因組分析的數(shù)據(jù)庫時，其研究人群的數(shù)量增加到了79 148個，同時結(jié)合傳統(tǒng)和自由兩組工具變量，使孟德爾隨機化法在鐵與PCa的因果推斷中更有效。

這項研究的依然存在著局限性，雖然本研究確實尋找了鐵與整體PCa 之間的因果關(guān)系，但是公開的GWAS數(shù)據(jù)庫有限，獲取不到年齡或其他類別的分層信息；不能估算鐵狀態(tài)與侵襲性PCa 之間的關(guān)系。

綜上所述，本研究表明，在傳統(tǒng)組中，鐵狀態(tài)與PCa 存在因果關(guān)系。同時，在自由組中，血清鐵與PCa存在因果關(guān)系，但鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度和轉(zhuǎn)鐵蛋白與PCa 沒有相關(guān)性。因此，后續(xù)的研究可從此入手探究鐵在PCa中的作用機制。