Usher綜合征Ⅰ型家系的MYO7A基因變異分析

嚴提珍 黃鈞 袁德健 唐向榮 韋笑寶 羅世強

作者單位：1 柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科 柳州 545001

2 柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點實驗室 柳州 545001

3 柳州市生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室 柳州 545001

4 柳州市婦幼保健院耳鼻喉科、聽力診斷中心 柳州 545001

5 柳州市婦幼保健院眼科 柳州 545001

Usher綜合征（Usher syndrome，USH）是一組以先天性感音神經(jīng)性耳聾、漸進性視網(wǎng)膜色素變性引起視力障礙、視野縮小為主要臨床表現(xiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病，發(fā)病率約為3.3～16.6/100000[1]。依據(jù)臨床表現(xiàn)的嚴重程度，可分為I型、II型和III型，其中I型癥狀最為嚴重，主要表現(xiàn)為先天性重度或極重度感音神經(jīng)性耳聾，前庭功能障礙，在青少年時期可引發(fā)不同程度的視網(wǎng)膜色素變性[1]。Usher綜合征具有高度臨床表型和遺傳異質(zhì)性，目前明確可與Usher綜合征I型相關(guān)的基因有5個（MYO7A、CDH23、USH1C、USH1G、PCDH15）[1]，其中MYO7A基因變異發(fā)生率最高[2]；與Usher綜合征II型相關(guān)基因有3個（USH2A、GPR98和DFNB31）；CLRN1基因與Usher綜合征III型相關(guān)[1]。臨床上Usher綜合征主要通過聽力檢測、眼科檢查結(jié)合基因檢測診斷。本研究通過高通量測序及Sanger測序，發(fā)現(xiàn)一個由MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T(p.Q2017*)復(fù)合雜合變異導(dǎo)致的Usher綜合征I型家系，報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

研究對象為先證者及其家系成員，先證者為一名14歲女性，因耳聾和視力異常來我院進行檢查，家系成員包括父母、姐姐、妹妹和弟弟（圖1）。本研究已獲得了柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。采集先證者及家系成員的病史（包括出生史、耳聾和眼睛病史、用藥史、家族史等），進行系統(tǒng)檢查：對先證者及其弟弟進行聲導(dǎo)抗、純音測聽、聽覺腦干誘發(fā)反應(yīng)（ABR）、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）檢查，對其他家系成員進行聲導(dǎo)抗和純音測聽；眼科檢查包括視力、眼底視野視網(wǎng)膜電圖等。

圖1 Usher綜合征家系系譜圖

1.2 方法

1.2.1 樣本采集和DNA提取 采集先證者及家系成員EDTA-Na抗凝的外周血4 mL，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取試劑盒（德國QIAGEN公司）進行基因組DNA提?。ú僮鞑襟E參照試劑盒說明書）。

1.2.2 醫(yī)學(xué)外顯子組測序 用Q800R超聲破碎儀將質(zhì)檢合格的基因組DNA打斷成片段，打斷后DNA片段大小在500 bp以下，峰值約在350 bp。參照NGS文庫制備試劑盒（美國Illumina系統(tǒng)）條件及方法進行文庫構(gòu)建，將質(zhì)檢合格的文庫稀釋至上機測序濃度，完成自動的簇生成及雙端測序（美國Illumina HiSeq4000測序儀），通過多種生物信息學(xué)軟件對測序數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)合家系患者的臨床表型，對于篩查出來的潛在變異位點，通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫（如HGMD、PubMed、ESP、ClinVar、ExAC庫和千人數(shù)據(jù)等）來判斷變異位點的致病性。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會（American college of medical genetics，ACMG）遺傳變異分類標準與指南[3]，對變異位點進行評估和致病性分類。

1.2.3 Sanger測序驗證變異位點 針對候選變異位點引物，c.3631-1G＞C變異位點引物序列為F：5’-CTGTGAAGGGGTATGGGGAG-3’和R：5’-TGAGGGTAGGTGTCTGAGGA-3’；c.6049C ＞T 變異位點引物序列為F ：5’-TGACACACAGAAACCCCTTC-3’和R：5’-TACAAGGATCAGGGGTTGGG-3’。對先證者及其家系成員的DNA樣本進行PCR擴增，PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，純化定量后，送上海立菲生物技術(shù)有限公司進行測序檢測（美國ABI 3730xl DNA測序儀），測序結(jié)果用DNAStar軟件的SeqMan與野生型進行序列比對。

1.2.4 氨基酸保守性分析 通過在線軟件ClustalW2（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）對6個物種目標氨基酸序列進行保守性比對分析。氨基酸序列包括：NP_000251.3（Homo sapiens，人）、NP_001243010.1（Mus musculus，小鼠）、XP_006229806.1（Rattus norvegicus，褐家鼠）、XP_038285928.1（Canis lupus familiaris，犬）、XP_011717460.1（Macaca nemestrina，獼猴）、XP_016777155.2（Pan troglodytes，黑猩猩）。

2 結(jié)果

2.1 病史及全身體格檢查結(jié)果

該家系符合常染色體隱性遺傳的特征（圖1），先證者（II-2）聽力檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABR＞100 dB HL，而耳聲發(fā)射不能引出（排除聽神經(jīng)?。?，雙耳純音聽閾均＞100 dB HL，為極重度感音神經(jīng)性耳聾，伴有前庭功能減退（運動發(fā)育遲緩，患兒坐立均遲于正常同齡兒，1歲會坐，2歲5個月會走路，缺乏運動技能，不能跑步騎車，冷熱水試驗無反應(yīng)）。眼科檢查結(jié)果顯示視網(wǎng)膜電圖無反應(yīng)，b波消失，提示為視網(wǎng)膜色素變性（圖2），依據(jù)先證者典型的臨床表現(xiàn)，臨床初步診斷為Usher綜合征I型。先證者弟弟（II-4）檢查結(jié)果也表現(xiàn)為極重度感音神經(jīng)性耳聾，但還表現(xiàn)為牙齒發(fā)育不良、兩邊眼球大小不一致（左眼球偏?。?、斜視、斗雞眼，無視網(wǎng)膜變性病變。先證者父母（I-1和I-2）、姐姐（II-1）和妹妹（II-3）未出現(xiàn)與先證者類似表型。

2.2 先證者及其他家系成員的測序結(jié)果

圖2 先證者雙眼視網(wǎng)膜色素變性

高通量測序檢測和分析結(jié)果提示，先證者及其弟弟為MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T(p.Q2017*)復(fù)合雜合變異（圖3 II-2和II-4），通過拷貝數(shù)和SNP分析，沒有檢測到與臨床表現(xiàn)可能相關(guān)的拷貝數(shù)變異。經(jīng)過Sanger測序驗證顯示這兩個變異位點分別來自先證者的父母（圖3 I-1和I-2），先證者姐姐（圖3 II-1）和妹妹（圖3 II-3）均攜帶MYO7A c.3631-1G＞C雜合變異。

2.3 致病性及保守性分析

c.6049C＞T變異位點第2017位氨基酸谷氨酰胺在人、小鼠、褐家鼠、犬、獼猴、黑猩猩多個物種之間高度保守（見圖4）。

3 討論

圖3 USH綜合征家系Sanger測序結(jié)果

圖4 保守性分析結(jié)果

MYO7A基因相關(guān)疾病為常顯遺傳性耳聾11型、常隱遺傳性耳2型和Usher綜合征1型[4，5]，是常染色體顯性/隱性遺傳。常顯遺傳性耳聾11型臨床特征主要為語后漸進性聽力損失；常隱遺傳性耳聾2型臨床特征主要為語前和語后重度聽力損失；Usher綜合征I型臨床特征主要為先天性重度或極重度感音神經(jīng)性聽力損失，青春期前視網(wǎng)膜色素變性，伴或不伴前庭功能異常[1]。本例先證者及其弟弟有共同的臨床表型，均表現(xiàn)為極重度感音神經(jīng)性耳聾、前庭功能障礙，但臨床表型存在差異，先證者還表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素變性，而其弟弟6歲，無視網(wǎng)膜色素變性病變（可能與年齡有關(guān)，后續(xù)需密切隨訪其視力和眼底檢查情況），同時具有牙齒發(fā)育不良、兩邊眼球大小不一致（左眼球偏?。?、斜視、斗雞眼等臨床表型，這些額外的臨床癥狀在Usher綜合征病例中未見報道，提示可能存在其他基因變異或拷貝數(shù)變異。該家系兩個患者基因型相同，但臨床表型有所不同，提示Usher 綜合征具有高度表型異質(zhì)性。

MYO7A基因位于染色體11q13.5區(qū)域，含49個外顯子，編碼2215個氨基酸，編碼蛋白屬于肌球蛋白家族（myosin 7A），該蛋白為馬達蛋白，具有ATP酶活性，可利用水解ATP產(chǎn)生的動能，與肌動蛋白結(jié)合，沿著肌動蛋白絲運動[1，5]。該蛋白結(jié)構(gòu)域有3個重要區(qū)域：①氨基末端（即馬達區(qū)域，是肌球蛋白的核心功能區(qū)，可與肌動蛋白結(jié)合，主要功能是水解ATP和產(chǎn)生動能）；②調(diào)節(jié)區(qū)（即頸部，可與肌球蛋白輕鏈結(jié)合形成異亮氨酸-谷氨酰胺基序）；③羧基末端：（即尾部，分為SH3結(jié)構(gòu)域、兩個FERM結(jié)構(gòu)域和兩個MyTH4結(jié)構(gòu)域，主要功能是調(diào)節(jié)MYO7A運動）。目前已報道超過500個MYO7A基因變異位點可導(dǎo)致Usher綜合征I型或遺傳性耳聾，變異類型覆蓋無義變異、錯義變異、移碼變異、微缺失變異及剪接變異等[6]，分布于各結(jié)構(gòu)域。王圣然等[7]報道了一個由MYO7A基因c.462C＞A和EX46_47 Del復(fù)合雜合變異導(dǎo)致常染色體隱性遺傳非綜合征耳聾的家系，其中c.462C＞A位于氨基末端，無義變異使得翻譯提前終止，產(chǎn)生截短蛋白；EX46_47 Del變異導(dǎo)致了MYO7A羧基末端MyTH4-FERM結(jié)構(gòu)域缺失。劉夢婷等[8]和林長亮等[9]報道的家系分別為c.3412C＞T (p.Q1138*)/c.4152G＞C(p.K1384N)和c.2694+2T＞G/c.6028G＞A復(fù)合雜合變異，這些變異可引發(fā)MYO7A基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能異常，從而導(dǎo)致下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常或中斷，最終患者出現(xiàn)Usher綜合征I型臨床癥狀。

本研究通過高通量測序和Sanger測序基因檢測發(fā)現(xiàn)先證者及其弟弟均攜帶MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T(p.Q2017*)復(fù)合雜合變異。MYO7A基因c.3631-1G＞C為剪接變異，沒有在相關(guān)臨床病例中被報道過，變異位于mRNA剪接區(qū)域，序列高度保守，多種計算機輔助算法預(yù)測變異可能會影響蛋白功能。依據(jù)ACMG變異分類指南[3]，該變異符合PVS1（當一個疾病的致病機制為功能喪失的無功能變異）+PM2（千人數(shù)據(jù)庫、ESP數(shù)據(jù)庫、EXAC數(shù)據(jù)庫中正常對照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異）+PM3（對于隱性遺傳基因，在患者反式位置檢測到致病或可能致病變異），可判定為致病。MYO7A基因c.6049C＞T (p.Q2017*)變異在耳聾相關(guān)臨床病例中被報道過[10]。該變異為罕見無義變異，無義變異使得翻譯提前終止，產(chǎn)生截短蛋白。該變異符合PVS1（同前）+PM2（同前）+PM3（PMID：23767834[10]），可判定為致病。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了一個MYO7A基因c.3631-1G＞C和c.6049C＞T復(fù)合雜合變異導(dǎo)致Usher綜合征I型的家系。c.3631-1G＞C新變異豐富了MYO7A基因突變譜。本研究為該家系患者明確了臨床診斷，為后續(xù)的遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷或植入前遺傳學(xué)診斷提供了依據(jù)。