基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析牡丹皮-赤芍治療銀屑病的作用機制*

陳廣山，李玲玲，白春曉

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

銀屑病是一種自身免疫相關(guān)的炎癥性皮膚病，因其容易反復(fù)發(fā)作，遷延難愈，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。銀屑病的發(fā)病機制尚不清楚，現(xiàn)代研究認(rèn)為可能涉及遺傳、感染、免疫、精神等多方面因素[1]。中醫(yī)將銀屑病稱之為“白疕”，在《證治準(zhǔn)繩》中曾記載：“遍身起如風(fēng)疹、疥、丹之狀，其色白不痛，但搔癢，抓之起白疕。”[2]在治療上將銀屑病分為血熱證、血燥證、血瘀證3型，其中血熱證最為常見，因此清熱涼血是治療銀屑病的核心思路之一[3]。

牡丹皮-赤芍是臨床上常用的藥對。牡丹皮有清熱涼血，活血化瘀的功效，《本草經(jīng)疏》中記載：“牡丹皮，其味苦而微辛，其氣寒而無毒，辛以散結(jié)聚，苦寒除血熱，入血分，涼血熱之要藥也。”《藥品化義》中曰：“赤芍，味苦能瀉，帶酸入肝，專瀉肝火。蓋肝藏血，用此清熱涼血?！眱烧叨际乔鍩釠鲅某Ｓ盟幬?。有研究統(tǒng)計了327首治療銀屑病的方劑，牡丹皮、赤芍的用藥頻次均位于前列，是治療銀屑病的要藥[4]。但其治療銀屑病的具體作用機制仍不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于大數(shù)據(jù)技術(shù)的一門新興學(xué)科，主要涉及系統(tǒng)生物學(xué)，生物信息學(xué)以及藥理學(xué)。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)大數(shù)據(jù)的特性，可以對中藥復(fù)方的作用機制進(jìn)行預(yù)測，為基礎(chǔ)研究提供思路[5]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出牡丹皮、赤芍的成分群，通過中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）、The Human Gene Database（GeneCards）等數(shù)據(jù)庫查找牡丹皮-赤芍治療銀屑病的相關(guān)靶標(biāo)，構(gòu)建“中藥-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)，最后篩選出藥物治療疾病的關(guān)鍵通路，為進(jìn)一步研究牡丹皮-赤芍治療銀屑病的作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 牡丹皮-赤芍有效成分及其作用靶點的篩選方法 將牡丹皮、赤芍分別作為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，在 TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）平臺上搜索兩種藥物的有效活性成分，并進(jìn)一步提取這些成分所對應(yīng)的作用靶點。

1.2 銀屑病的靶點檢索與收集方法 依托GeneCards（https：//www.genecards.org）平臺，以“Psoriasis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選疾病的相關(guān)靶點。

1.3 明確牡丹皮-赤芍治療銀屑病的潛在作用靶點的方法 為明確牡丹皮-赤芍作用靶點與銀屑病的疾病靶點之間的關(guān)系，利用ClusterProfiler R軟件繪制韋恩圖，得到兩者之間的交集，即牡丹皮-赤芍治療銀屑病的潛在作用靶點。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的方法 依托STRING平臺（https：//string-db.org），將牡丹皮-赤芍及銀屑病的共同靶點上傳，構(gòu)建靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建藥物-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的方法 利用Cytoscape3.7.2軟件，上傳藥物、有效成分、藥物與疾病共同作用靶點、疾病信息構(gòu)建藥物-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。得到藥物與疾病靶點相互作用關(guān)系。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路分析的方法 為進(jìn)一步研究牡丹皮-赤芍治療銀屑病的生物學(xué)過程，利用ClusterProfiler R軟件平臺對牡丹皮-赤芍及銀屑病的共同作用靶點進(jìn)gene ontology（GO）功能富集分析和Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）代謝通路富集分析，并進(jìn)行可視化處理，以探討牡丹皮-赤芍治療銀屑病的相關(guān)生物學(xué)過程。

2 結(jié)果

2.1 牡丹皮-赤芍有效成分及其作用靶點的篩選 利用TCMSP平臺，分別以牡丹皮、赤芍為關(guān)鍵詞檢索兩種中藥的有效成分，并以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，共獲得40個有效化合物，其中牡丹皮11個，赤芍29個，去除重復(fù)成分后共獲得37個有效成分，以O(shè)B值大小進(jìn)行排序，列出前20位有效成分，見表1。繼續(xù)利用TCMSP平臺，檢索出37個有效成分所對應(yīng)的作用靶點，去除重復(fù)后共得到178個作用靶點。

表1 牡丹皮-赤芍有效成分信息表Tab.1 Active ingredient information table of cortex pcortex moutan-radix paeoniae rubra

2.2 銀屑病相關(guān)靶點 以“Psoriasis”為關(guān)鍵詞在GeneCards進(jìn)行檢索，篩選出銀屑病的相關(guān)靶點3 729個。

2.3 牡丹皮-赤芍治療銀屑病的潛在作用靶點 使用ClusterProfiler R軟件繪制韋恩圖，得到牡丹皮-赤芍治療銀屑病的潛在作用靶點112個，見圖1。

圖1 牡丹皮-赤芍治療銀屑病靶點的韋恩圖Fig.1 Wayne diagram of therapeutic target of pcortex moutan-radix paeoniae rubra on psoriasis

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò) 將牡丹皮-赤芍與銀屑病的共同靶點上傳至STRING平臺，得到靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖中各節(jié)點代表靶蛋白，連線代表相互之間的作用，連線越多的節(jié)點，越有可能是牡丹皮-赤芍治療銀屑病的關(guān)鍵靶點，經(jīng)過統(tǒng)計得到各節(jié)點的連線數(shù)量，見圖3，排名前5位的分別是JUN、AKT1、RELA、絲裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）、白介素（IL）-6。

圖2 牡丹皮-赤芍與銀屑病蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of protein interaction between pcortex moutan-radix paeoniae rubra and psoriasis

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點連線的數(shù)量Fig.3 Number of connections of each node in the PPI network

2.5 構(gòu)建藥物-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò) 將藥物、有效成分、藥物與疾病共同作用靶點、疾病信息上傳至Cytoscape3.7.2軟件，得到藥物-有效成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖4。

圖4 藥物-有效成分-靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of drug-active ingredient-target-disease interaction

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路分析 使用ClusterProfiler R軟件平臺，將牡丹皮-赤芍治療銀屑病潛在的112個作用靶點進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析。GO功能富集分析顯示牡丹皮-赤芍治療銀屑病涉及134個生物學(xué)過程（P＜0.05），將排名前20的條目進(jìn)行可視化處理，繪制柱狀圖，見圖5。其中富集較為集中的生物學(xué)過程有細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體配體活性等。KEGG通路分析經(jīng)篩選共得到155條通路（P＜0.05），將排名前20的條目進(jìn)行可視化處理，繪制柱狀圖，見圖6。其中富集較多的通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、血流剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路、IL-17信號通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、乙型肝炎通路、前列腺癌通路等。

圖5 牡丹皮-赤芍作用靶點的GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis of pcortex moutan-radix paeoniae rubra target

圖6 牡丹皮-赤芍作用靶點的KEGG富集分析通路圖Fig.6 KEGG enrichment analysis pathway of pcortex moutan-radix paeoniae rubra target

3 討論

中國銀屑病的發(fā)病呈快速增長趨勢，因其治療困難，給患者的生理和心理都造成了極大的困擾[6]。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為銀屑病是一種免疫相關(guān)的慢性炎癥性疾病，與炎癥細(xì)胞的活化，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖及血管增生遷移有關(guān)[7-8]。中醫(yī)在長期的實踐當(dāng)中，形成了“從血論治”治療銀屑病的思路[9]。牡丹皮-赤芍藥對既能清熱涼血，又可活血化瘀，是中醫(yī)治療銀屑病的要藥[10]。

研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，共獲得牡丹皮-赤芍治療銀屑病的有效成分37個，作用靶點178個。經(jīng)過進(jìn)一步篩選，得到治療銀屑病可能相關(guān)的化合物有芍藥苷、槲皮素、鞣花酸、黃芩素、山奈酚、兒茶素、β-谷甾醇、豆甾醇等?，F(xiàn)代研究顯示，芍藥苷既有抗炎作用，又有免疫調(diào)節(jié)作用[11]。芍藥苷還可通過p38/MAPK通路抑制IL-22的表達(dá)，從而對銀屑病起到治療作用[12]。槲皮素、β-谷甾醇既可以抑制IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放發(fā)揮抗炎作用，又可以抑制淋巴細(xì)胞活化和增殖起到免疫調(diào)節(jié)作用[13-14]。鞣花酸可以通過降低絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）磷酸化，抑制核因子κB（NF-κB）活化減輕炎癥反應(yīng)[15]。黃芩素可以通過抑制核因子的活性和細(xì)胞因子的分泌、釋放發(fā)揮抗炎的作用[16]。山奈酚可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡來實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用[17]。兒茶素在藥理上有抗菌和抗病毒的功效[18]。豆甾醇亦有抗炎的作用，研究發(fā)現(xiàn)其可以減輕由免疫球蛋白E誘導(dǎo)的皮膚過敏反應(yīng)，可以顯著減少皮膚的增厚和炎性細(xì)胞浸潤，在治療皮膚疾病方面很有潛力[19]。

牡丹皮-赤芍與銀屑病的共同作用靶點有112個。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點為JUN、AKT1、RELA、MAPK1、IL6、FOS。JUN 是 1 號染色體的基因，F(xiàn)OS基因的表達(dá)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，由JUN和FOS組成的激活蛋白1（AP-1）是人體內(nèi)一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)方面有重要的調(diào)節(jié)作用。T淋巴細(xì)胞在銀屑病的發(fā)病中起重要的作用[20]。AP-1蛋白可調(diào)節(jié)初始T細(xì)胞向效應(yīng)T細(xì)胞的分化，從而影響免疫反應(yīng)和炎癥過程[21]。AKT1基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對細(xì)胞的增殖、分化有調(diào)節(jié)作用，同時參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，多種惡性腫瘤的發(fā)生與其異常活化有關(guān)[22]。RELA是NF-κB蛋白家族成員之一，NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，主要參與炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)以及淋巴細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等。NF-κB信號通路調(diào)控失衡可以誘發(fā)機體感染、自身免疫性疾病、自身炎癥性疾病和腫瘤等[23]。MAPK1通路可以參與中性粒細(xì)胞的活化影響炎癥反應(yīng)的過程[24]。IL-6與銀屑病關(guān)系密切，在銀屑病皮損中，多種細(xì)胞可以高表達(dá)IL-6，比如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等，IL-6可通過導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/輔助性T細(xì)胞17（Treg/Th17）細(xì)胞失衡，從而導(dǎo)致銀屑病的發(fā)生發(fā)展。同時，銀屑病患者血清中IL-6水平也會顯著升高，在經(jīng)過治療后，患者血清中IL-6水平顯著下降，這可以作為治療銀屑病有效性的指標(biāo)之一[25]。

對牡丹皮-赤芍與銀屑病的共同作用靶點進(jìn)行GO功能富集，涉及的生物學(xué)過程有細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、血紅素結(jié)合、受體配體活性等，說明這些過程在牡丹皮-赤芍治療銀屑病中起到了關(guān)鍵作用。通過KEGG富集分析，涉及到的通路有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。現(xiàn)代研究顯示，AGERAGE信號通路可能是銀屑病中發(fā)病的重要機制之一，通過抑制該通路，可以減輕炎癥反應(yīng)，進(jìn)而起到治療銀屑病的作用[26]。銀屑病的發(fā)生伴有多種炎性因子的升高，這些炎性因子通過促進(jìn)胰島素抵抗、代謝異常以及內(nèi)皮功能紊亂等多種生物學(xué)進(jìn)程，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生[27]。IL-17可以促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎性因子，從而使銀屑病加重，并且血清中IL-17水平與銀屑病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[28]。TNF-α炎癥通路是銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵通路之一，而且抗TNF-α的生物制劑在臨床上治療銀屑病已取得了良好的效果。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)牡丹皮-赤芍治療銀屑病是通過多種有效成分作用在多種靶點、多種通路的生物學(xué)過程實現(xiàn)的，體現(xiàn)了中藥之間的相互協(xié)同作用，也為進(jìn)一步研究牡丹皮-赤芍治療銀屑病的作用機制提供了理論基礎(chǔ)。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的局限性，還需要通過更多的實驗和臨床數(shù)據(jù)來進(jìn)一步驗證牡丹皮-赤芍治療銀屑病的關(guān)鍵靶點和通路。