游離鈣離子在‘碭山酥’梨“鐵頭病”發(fā)病過程中的作用研究*

劉肖烽，李舒然，李六林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801）

‘碭山酥’梨種植面積廣，是我國優(yōu)良的梨品種[1]。但是近幾年來在‘碭山酥’梨果實(shí)上發(fā)現(xiàn)果頂部位異常堅(jiān)硬且明顯突出，失去商品價(jià)值，俗稱“鐵頭病”。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害發(fā)病率為30%～40%，成為威脅‘碭山酥’梨生產(chǎn)的一大病害。因此，闡明“鐵頭病”的發(fā)生原因、尋求有效的解決方案對‘碭山酥’梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

筆者研究發(fā)現(xiàn)“鐵頭病”果實(shí)硬化的關(guān)鍵時(shí)期為盛花期后34 d，主要表現(xiàn)在木質(zhì)素的大量合成導(dǎo)致石細(xì)胞急劇增加。木質(zhì)素是植物防御脅迫的重要物質(zhì)[2]，當(dāng)遇到各種生物和非生物脅迫時(shí)，會有更多的木質(zhì)素沉積在細(xì)胞次生壁上，使得細(xì)胞變厚，最終導(dǎo)致果實(shí)硬度增加[3]。此外，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質(zhì)素合成過程中重要的酶[4]，其活性升高會使得木質(zhì)素合成速率加快?！X山酥’梨果實(shí)木質(zhì)素的過度沉積會導(dǎo)致石細(xì)胞的形成[5]，嚴(yán)重影響果實(shí)品質(zhì)[6]。

鈣（游離鈣離子）對植物抗性提高[7]、細(xì)胞壁形成[8]、果實(shí)發(fā)育和品質(zhì)形成[9]具有重要作用。有研究認(rèn)為，在果實(shí)采收前噴施CaCl2可以降低果實(shí)木質(zhì)素含量，提高果實(shí)品質(zhì)[10]。鈣（游離鈣離子）是細(xì)胞壁的構(gòu)成成分[9]，是否對木質(zhì)素合成和沉積發(fā)揮作用還未見相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)通過花期在“鐵頭病”果園中噴施2%CaCl2，以及在正常果園中噴施游離鈣離子螯合劑EGTA，以盛花期后34 d和151 d的果實(shí)為試驗(yàn)材料，對不同處理后果實(shí)游離鈣離子含量、木質(zhì)素含量、石細(xì)胞密度和木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性進(jìn)行測定，同時(shí)對游離鈣離子和石細(xì)胞的分布情況進(jìn)行觀察，以探索游離鈣離子對‘碭山酥’梨“鐵頭病”的緩解作用，為該病害的防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采樣地點(diǎn)位于山西省晉中市祁縣修善村，果園常規(guī)管理，供試?yán)嫫贩N為‘碭山酥’，樹齡10年，行株距為3 m×2 m。

1.2 試驗(yàn)處理與方法

提前在“鐵頭病”發(fā)生嚴(yán)重的果園中標(biāo)記發(fā)病樹，并且標(biāo)記發(fā)病枝條，選擇病果分布均勻的梨樹5株，噴施濃度為2%的CaCl2溶液，另選擇5株樹噴施等量清水作為對照（發(fā)病果園）；在正常果園中隨機(jī)選擇正常發(fā)育的梨樹5株，噴施濃度為3 mmol/L的EGTA，同時(shí)選擇5株樹噴施等量清水作為對照（正常果園）。每株樹噴施1.5 L，均勻噴灑至樹體表面（噴施前后4 h內(nèi)如遇降雨需補(bǔ)噴），共噴施3次，具體時(shí)間為4月10、15、20日。

（1）發(fā)病率的測定。2019年5月24日，每處理選擇5株樹，采用大枝統(tǒng)計(jì)法，每株樹隨機(jī)選擇3個(gè)大枝（果實(shí)總數(shù)大于100個(gè)），分別統(tǒng)計(jì)各處理的病果數(shù)（果實(shí)果頂部位明顯凸出的即為病果），計(jì)算發(fā)病率。

發(fā)病率（%）=（病果總數(shù)/調(diào)查總果數(shù)）×100

（2）果實(shí)品質(zhì)及次生代謝物含量測定。2019年9月18日，每處理選擇5株樹，每株樹從樹冠外圍采集果實(shí)30個(gè)，采集的果實(shí)分別從果肩與果頂部位取樣。用GY-3型硬度計(jì)測定果實(shí)硬度，用WYT-4手持糖度計(jì)[11]測定可溶性固形物含量，用蒽酮比色法[12]測定可溶性糖含量，用酸堿滴定法[13]測定可滴定酸含量，采用烘干法測定[14]果實(shí)含水量。木質(zhì)素含量采用Klason法[15]進(jìn)行測定，石細(xì)胞含量采用于娟娟等[16]的方法測定；PAL、C4H、CAD活性參照王丹陽[4]的方法測定，4CL活性的測定參照王斌等[17]的方法；果實(shí)游離鈣離子含量的測定參照趙靜等[18]的方法。

（3）組織結(jié)構(gòu)觀察。Ca2+定位參照Wang等[19]的方法進(jìn)行。用石蠟切片、番紅-固綠雙重染色對石細(xì)胞進(jìn)行觀察[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2010和SAS v9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外施CaCl2及其抑制劑對發(fā)病率的影響

如圖1所示，發(fā)病果園“鐵頭病”發(fā)病率高達(dá)37.53%，而正常果園未發(fā)現(xiàn)病果。發(fā)病果園噴施CaCl2后，“鐵頭病”發(fā)病率顯著降低，為24.67%。對正常果園噴施EGTA后，出現(xiàn)極少量病果。

圖1 不同處理果園“鐵頭病”發(fā)病率

2.2 外施CaCl2及其抑制劑對果實(shí)品質(zhì)的影響

2.2.1 對果實(shí)硬度的影響

發(fā)病果園病果果肩和果頂部位硬度分別為11.27、21.00 kg/cm2，顯著高于其他處理；CaCl2處理的果肩、果頂硬度均顯著低于病果相應(yīng)部位，分別為9.50、16.70 kg/cm2；正常果實(shí)的果肩和果頂部位硬度分別為7.73、7.40 kg/cm2，與EGTA處理相應(yīng)部位無顯著差異（圖2）。

圖2 不同處理‘碭山酥’梨果實(shí)硬度

2.2.2 對果實(shí)可溶性固形物含量的影響

正常果實(shí)果肩和果頂?shù)目扇苄怨绦挝锖糠謩e為12.33%和11.93%，顯著高于病果和CaCl2處理的相應(yīng)部位；CaCl2處理的可溶性固形物含量高于病果，果頂?shù)牟町愡_(dá)顯著水平；EGTA處理的可溶性固形物含量與正常果實(shí)差異不顯著（圖3）。

圖3 不同處理‘碭山酥’梨果實(shí)可溶性固形物含量

2.2.3 對果實(shí)可溶性糖含量的影響

如圖4所示，正常果實(shí)果肩、果頂?shù)目扇苄蕴呛糠謩e為90.12、85.47 mg/g，與EGTA處理相應(yīng)部位均無顯著差異，但均顯著高于病果和CaCl2處理的相應(yīng)部位；CaCl2處理果肩、果頂?shù)目扇苄蕴呛烤哂诓」鄳?yīng)部位，果頂?shù)牟町愡_(dá)顯著水平。

圖4 不同處理‘碭山酥’梨果實(shí)可溶性糖含量

2.2.4 對果實(shí)可滴定酸含量的影響

如圖5所示，CaCl2處理果肩和果頂?shù)目傻味ㄋ岷糠謩e為0.23%、0.24%，顯著低于病果相應(yīng)部位；EGTA處理的果實(shí)果頂可滴定酸含量為0.17%，顯著高于正常果實(shí)果頂（0.14%）。

圖5 不同處理‘碭山酥’梨果實(shí)可滴定酸含量

2.2.5 對果實(shí)含水量的影響

正常果實(shí)的果肩、果頂含水量分別為87.49%、86.06%，顯著高于CaCl2處理（85.16%和81.50%）和病果（84.57%和80.51%）相應(yīng)部位；CaCl2處理后果實(shí)含水量較病果顯著提高（圖6）。

圖6 不同處理‘碭山酥’梨果實(shí)含水量

2.3 外施CaCl2及其抑制劑對果實(shí)游離鈣離子含量及分布的影響

2.3.1 對果實(shí)游離鈣離子含量的影響

正常果實(shí)果肩游離鈣離子含量達(dá)到0.39 mg/g，顯著高于病果及CaCl2、EGTA處理的果實(shí)，其中CaCl2處理和EGTA處理間差異不顯著，但均顯著高于病果。正常果實(shí)和EGTA處理果頂?shù)挠坞x鈣離子含量無顯著差異，均顯著高于CaCl2處理，CaCl2處理顯著高于病果（圖7）。

圖7 不同處理‘碭山酥’梨果實(shí)游離鈣離子含量

2.3.2 對果實(shí)游離鈣離子分布的影響

從圖8可以看出，正常果實(shí)果肩與果頂部位的游離鈣離子分布密集，而病果果肩與果頂部位的游離鈣離子分布極其稀少，經(jīng)CaCl2處理的果實(shí)果肩與果頂游離鈣離子分布稍有增加，而EGTA處理的果實(shí)果肩和果頂游離鈣離子分布密集程度明顯低于正常果實(shí)，但是明顯高于病果與CaCl2處理的相應(yīng)部位。

圖8 不同處理‘碭山酥’梨果實(shí)游離鈣離子定位狀況

2.4 外施CaCl2及其抑制劑對果實(shí)次生代謝的影響

2.4.1 對果實(shí)石細(xì)胞含量和木質(zhì)素含量的影響

對各處理果實(shí)不同部位石細(xì)胞的觀察及其含量測定發(fā)現(xiàn)，正常果實(shí)與EGTA處理果實(shí)果肩、果頂?shù)氖?xì)胞密度差異均不明顯，其石細(xì)胞含量均顯著低于病果和CaCl2處理相應(yīng)部位；CaCl2處理果實(shí)果肩、果頂?shù)氖?xì)胞密度均明顯低于病果，其石細(xì)胞含量均顯著低于病果相應(yīng)部位（圖版2、圖9）。

如圖9所示，果肩、果頂?shù)哪举|(zhì)素含量從低到高均依次為正常果實(shí)、EGTA處理、CaCl2處理、病果，且差異均達(dá)顯著水平，說明CaCl2處理能顯著降低病果的木質(zhì)素含量，而EGTA處理能顯著促進(jìn)正常果實(shí)產(chǎn)生木質(zhì)素。

圖9 不同處理‘碭山酥’梨果實(shí)石細(xì)胞含量及木質(zhì)素含量

2.4.2 對果實(shí)木質(zhì)素相關(guān)酶活性的影響

由圖10可以看出，CaCl2處理的果實(shí)果肩、果頂PAL活性均較病果相應(yīng)部位顯著降低，但均顯著高于EGTA處理和正常果實(shí)相應(yīng)部位，EGTA處理的果肩、果頂PAL活性均顯著高于正常果實(shí)相應(yīng)部位。CaCl2處理的果實(shí)果肩和果頂?shù)?CL、C4H活性均較病果相應(yīng)部位顯著降低，但均顯著高于EGTA處理和正常果實(shí)相應(yīng)部位；EGTA處理的果肩4CL、C4H活性均顯著高于正常果實(shí)，果頂4CL、C4H活性均與正常果實(shí)差異不顯著。CaCl2處理的果實(shí)果肩CAD活性與病果果肩差異不顯著，果頂CAD活性較病果果頂顯著降低，但均顯著高于EGTA處理和正常果實(shí)相應(yīng)部位；EGTA處理的果肩與果頂CAD活性與正常果實(shí)相應(yīng)部位均無顯著差異。

3 討論與結(jié)論

圖10 不同處理‘碭山酥’梨果實(shí)PAL、4CL、C4H和CAD的活性

鈣對植物體各種生命活動(dòng)的正常進(jìn)行有著不可估量的作用，包括增加植物的抗性、在外部刺激下作為信號分子調(diào)動(dòng)內(nèi)部相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)還參加植物體細(xì)胞壁的構(gòu)建[21-22]。Ca元素對于果實(shí)的生長發(fā)育同樣有著重要的作用，果實(shí)中的游離鈣離子對果實(shí)品質(zhì)的形成以及采后果實(shí)品質(zhì)的維持具有重要意義[23]。通過對正常果實(shí)與“鐵頭病”果實(shí)各部位游離鈣離子含量分析發(fā)現(xiàn)，正常果實(shí)果肩與果頂游離鈣離子含量均顯著高于病果相應(yīng)部位。在花期對患病果樹連續(xù)噴施2%CaCl2溶液后，“鐵頭病”發(fā)病率顯著降低，且經(jīng)過處理的病果果肩與果頂游離鈣離子含量均顯著高于未處理的病果相應(yīng)部位，但是都顯著低于正常果實(shí)相應(yīng)部位。對正常果實(shí)、“鐵頭病”果實(shí)、CaCl2處理果實(shí)各部位進(jìn)行游離鈣離子定位觀察也得到了一致的結(jié)果，說明在花期連續(xù)噴施2%CaCl2可以對“鐵頭病”果實(shí)起到補(bǔ)充游離鈣離子的作用。

木質(zhì)素是由4-羥基苯基丙烷氧化組合偶聯(lián)形成的芳香族聚合物[24-25]。這些聚合物主要沉積在細(xì)胞次生壁中，使細(xì)胞變得僵硬，進(jìn)而顯著增加了果實(shí)硬度[26]。同時(shí)石細(xì)胞的增加與果實(shí)硬度的提升也有著非常大的關(guān)系，而石細(xì)胞的形成與木質(zhì)素在細(xì)胞壁上的積累導(dǎo)致次生壁增厚有決定性的關(guān)系，因此木質(zhì)素在很大程度上影響著果實(shí)硬度[5]。經(jīng)過2%CaCl2處理的果實(shí)石細(xì)胞含量和木質(zhì)素含量均顯著低于未處理病果，組織結(jié)構(gòu)觀察也顯示CaCl2處理的果實(shí)石細(xì)胞密度小于病果，說明外源CaCl2處理降低了病果中木質(zhì)素和石細(xì)胞的堆積，這與Lu等[10]的研究結(jié)果一致。經(jīng)過2%CaCl2處理的病果PAL、4CH、C4L、CAD活性基本顯著降低，這有利于減少果實(shí)中木質(zhì)素的積累，緩解病情。石細(xì)胞含量與果實(shí)可溶性糖含量和水分含量呈顯著負(fù)相關(guān)，與果實(shí)可滴定酸含量呈顯著正相關(guān)[27-31]。本研究結(jié)果表明，病果的可溶性固形物含量、可溶性糖含量、含水量均顯著低于正常果實(shí)，果實(shí)硬度、可滴定酸含量均顯著高于正常果實(shí)。經(jīng)過CaCl2處理后，病果果實(shí)品質(zhì)得到改善，其果實(shí)可溶性固形物含量、可溶性糖含量、含水量均明顯提高，果實(shí)硬度、可滴定酸含量均顯著降低。其原因可能是花期噴施CaCl2，病果缺鈣癥狀得到緩解，木質(zhì)素含量顯著降低，進(jìn)而減少了石細(xì)胞的合成，改善了果實(shí)品質(zhì)。

EGTA是游離鈣離子螯合劑，可以與游離鈣離子結(jié)合，與植物體競爭游離鈣離子，使果實(shí)游離鈣離子含量降低[32-33]。花期在正?！X山酥’梨園中連續(xù)噴施EGTA溶液，阻礙植株對游離鈣離子的吸收，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果實(shí)游離鈣離子含量明顯降低，木質(zhì)素含量顯著升高，果頂部位石細(xì)胞含量顯著升高，果實(shí)品質(zhì)變劣。

綜上所述，‘碭山酥’梨果實(shí)游離鈣離子含量的缺乏會使木質(zhì)素過度沉積，導(dǎo)致石細(xì)胞大量合成，這可能是誘發(fā)“鐵頭病”的重要原因?？赏ㄟ^噴施2%CaCl2降低“鐵頭病”發(fā)病率以及緩解其發(fā)病程度。但是果實(shí)缺乏游離鈣離子的原因以及噴施CaCl2對“鐵頭病”作用的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。