刺梨多糖對小鼠黑色素瘤抑制作用實驗研究

陳 慧，常 瑛，劉振國

(西北婦女兒童醫(yī)院，陜西 西安 710061)

黑色素瘤是發(fā)生于皮膚或黏膜表面的來源于神經(jīng)嵴黑色素細胞的惡性腫瘤，其惡性程度高，極易發(fā)生轉(zhuǎn)移侵襲，是皮膚惡性腫瘤主要的死亡原因之一[1]。目前手術治療、放療和化療是治療黑色素瘤的主要方法，但其對放化療均不敏感,臨床預后差，病死率高[2]。研究發(fā)現(xiàn),黑色素瘤為免疫原性較高的腫瘤,機體免疫反應的低下是腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的重要原因，因此針對黑色素瘤的免疫治療得到廣泛關注[3]。在腫瘤的發(fā)生過程中，腫瘤細胞可以通過許多機制，比如抑制了NK細胞和T細胞等具有殺傷活性的免疫細胞的功能，逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，促進自身的生長和轉(zhuǎn)移[4-5]。因此，如果在抗腫瘤的同時提高免疫系統(tǒng)的活化功能，可以有效抵抗腫瘤的發(fā)生發(fā)展。刺梨(Rosa Roxburghii Tratt)是薔薇科薔薇屬落葉灌木繅絲花的果實，近年來，中醫(yī)常用刺梨的果實和根入藥，在治療消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病及抗腫瘤方面都有很高的藥用價值[6]，且有研究表明刺梨多糖可提高小鼠的免疫功能[7]?；诖耍狙芯繑M探討刺梨多糖在體外對黑色素瘤B16細胞的生物學行為的影響，及在體內(nèi)對黑色素瘤生長的作用，同時探究刺梨多糖在抗腫瘤的同時，對小鼠免疫系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞與動物：小鼠黑色素瘤B16細胞購自美國ATCC細胞庫，C57BL/6J小鼠購自京北維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2 儀器：HWJ-2-80型CO2細胞培養(yǎng)箱(上海鑫諾儀器集團有限公司)、Allegra?X-12R 型離心機(美國Beckman Coulter 公司)、5430R型低溫離心機(德國 Eppendorf 公司)、Multiskan Sky酶標儀(美國Thermo Scientific公司)、FACS Via型流式細胞儀(美國BD公司)、 BSA124S型分析天平(德國賽多利斯公司)；ABI Veriti PCR儀(美國Bio-Rad 公司)。

1.1.3 藥品與試劑：刺梨多糖(由新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥物研究所實驗室提供，實驗中用生理鹽水配成2%溶液，≥98%)；1640培養(yǎng)基(美國 Hyclone 公司，批號AD32454266)；胎牛血清(美國Gibco公司，批號10437-028)；0.25% 胰酶(上海生工生物有限公司，批號2667534)；MTT(美國賽默飛公司，批號M6494)；小鼠IFN-γ ELISA試劑盒(浙江聯(lián)科生物有限公司，批號96-900-M98)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物有限公司，批號C1062S)；RT-PCR試劑盒(美國Sigma公司，批號KK1007)； Bax、Bcl-2及β-actin基因由擎科生物有限公司合成；anti-mouse CD3流式抗體(美國eBbioscience，克隆號17A2)；anti-mouse CD4流式抗體(美國eBbioscience，克隆號GK1.5)；anti-mouse CD8流式抗體(美國Biolegend，克隆號53-6.7)；anti-mouse NK1.1流式抗體(美國Biolegend，克隆號PK136)；anti-mouse CD69流式抗體(美國Biolegend，克隆號H1.2F3)。其他試劑為實驗室常用試劑。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與動物模型的建立：B16細胞，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，放于 37 ℃、5% CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中。C57BL/6J小鼠(6周)于SPF級動物房中飼養(yǎng)，取B16細胞建立皮下荷瘤模型，每只小鼠皮下注射1×106個細胞，1周后有腫瘤出現(xiàn)，并隨機分組，其中對照組通過灌胃方式給予2 ml/g的生理鹽水，實驗組通過灌胃方式給予0.8 g/kg的刺梨多糖,1次/2 d，連續(xù)治療6次。每組小鼠10只，期間用游標卡尺測量腫瘤的長和寬，代入公式進行計算腫瘤體積(腫瘤體積=長×寬2/2)。治療結束后，處死小鼠，取出腫瘤，進行稱重。

1.2.2 MTT檢測刺梨多糖對B16細胞的抑制率：取對數(shù)生長期的B16細胞接種于96細胞培養(yǎng)板中，每孔接入1.5×104個細胞。12 h后，將刺梨多糖的儲存液分別稀釋至20、40、80 μmol/L，并加入各孔，每個濃度設5個復孔，并設置陰性對照組(細胞加入等體積培養(yǎng)基)和空白對照組(孔內(nèi)只含有培養(yǎng)基)。繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，并在每個時間點利用MTT法進行檢測。每孔加入MTT試劑 10 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，離心，去除上清，加入100 μl DMSO，吹打混勻，隨后使用酶標儀測定各孔的吸光度(OD570和OD630，以OD630為校正值，即將OD570-OD630的值代入公式計算)，細胞抑制率=(1-實驗組OD/對照組OD)×100%，試驗重復3次。

1.2.3 RT-PCR檢測基因的表達：各組B16細胞加入不同濃度的刺梨多糖，24 h后，收集各組細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)充分洗滌，參照Trizo1試劑盒說明書提取細胞總RNA，用RT-PCR檢測各組細胞中基因的表達量。其中以β-actin為內(nèi)參對照基因。PCR反應條件參照PCR試劑盒說明書。各基因序列參見表1。

表1 引物序列

1.2.4 FACS檢測刺梨多糖對細胞凋亡的影響：取對數(shù)生長期的B16細胞，接種于6孔板內(nèi)，加入不同濃度的刺梨多糖進行處理，48 h后，用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測，參照說明書操作，最后用流式儀進行上機檢測。

1.2.5 FACS檢測小鼠脾內(nèi)免疫細胞的比例和CD69的表達：將小鼠進行脫頸處死后，取出脾臟，用200目的鋼網(wǎng)研磨并不停用PBS沖洗。將懸液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中，加入PBS，以400 g的離心力進行離心，離心5 min后棄去上清。向離心管中加入3 ml的紅細胞裂解液，吹打混勻，在4 ℃中靜置15 min。后加PBS洗一遍，離心，棄去上清并重懸細胞后、過濾。將細胞懸液移至流式管中，每管100 μl，加10 μl大鼠血清封閉50 min。根據(jù)熒光不同分別加入相應熒光標記的抗體，4 ℃避光靜置1 h，PBS 洗兩遍，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.6 ELISA檢測小鼠血清中IFN-γ分泌水平：各組小鼠進行治療后，常規(guī)分離小鼠的血清，并利用ELISA試劑盒進行檢測，參照說明書操作，最后用酶標儀檢測OD450波長處的值。利用各標準品標準曲線計算各孔濃度。

2 結 果

2.1 刺梨多糖對B16細胞增殖的影響 見表2。分別用0、20、40、80 μmol/L濃度的刺梨多糖處理B16細胞后，用MTT法進檢測。由結果可知，不同濃度的刺梨多糖對B16細胞的增殖均有一定的抑制作用。與對照組(0 μmol/L組)比較，不同濃度的刺梨多糖對B16細胞增殖抑制率均顯著增加(P<0.05或P<0.01)；且隨著刺梨多糖濃度的增加，其抑制作用越強。

表2 不同濃度刺梨多糖對B16細胞增殖的影響(%)

2.2 刺梨多糖對B16細胞凋亡的影響 見表3(圖1)。先用0、20、40、80 μmol/L濃度的刺梨多糖處理B16細胞，48 h后，用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒染色，然后用流式儀進行上機檢測和分析，最后統(tǒng)計早期凋亡和晚期凋亡的總比例。結果顯示，在不同劑量的刺梨多糖的處理下，B16細胞的凋亡率明顯上升。與對照組相比，各濃度的刺梨多糖處理組中B16細胞的凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，且呈劑量依賴性。應用用RT-PCR實驗檢測各組B16細胞中與凋亡相關的基因的表達水平，包括Bcl-2和Bax。結果顯示，與對照組相比，不同劑量的刺梨多糖均可抑制抗凋亡基因Bcl-2，升高促凋亡基因Bax的表達，且呈現(xiàn)劑量依賴性。

表3 不同濃度刺梨多糖對B16細胞凋亡的影響

2.3 刺梨多糖可抑制B16細胞在小鼠體內(nèi)的生長 見表4(圖2)。為了研究刺梨多糖在體內(nèi)對B16細胞的抑制作用，本研究采用皮下荷瘤模型進行探討。待腫瘤出現(xiàn)時，依據(jù)預實驗的使用劑量0.8 g/kg，用刺梨多糖進行灌胃，連續(xù)治療5次，觀察21 d后，取出腫瘤，并測量腫瘤的體積和重量，進行組間比較。結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，刺梨多糖治療后，小鼠的腫瘤體積和重量均較低，且均有統(tǒng)計學差異(均P<0.01)。說明刺梨多糖可抑制B16細胞在小鼠體內(nèi)的生長。

表4 刺梨多糖對小鼠腫瘤重量和體積的影響

注：與對照組(0 μmol/L)比較， *P<0.05，**P<0.01圖1 刺梨多糖對B16細胞凋亡及凋亡相關基因的影響

2.4 刺梨多糖可增加小鼠脾內(nèi)免疫細胞的比例 見表5(圖3)。運用FACS法檢測小鼠脾內(nèi)CD4+T、CD8+T和NK細胞的比例。由結果可知，與對照組相比，刺梨多糖治療后，小鼠脾內(nèi)CD4+T、CD8+T和NK細胞的比例明顯增加，且均有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。說明刺梨多糖可以升高小鼠脾內(nèi)免疫細胞的比例。

注：與對照組比較， *P<0.01圖2 刺梨多糖對B16細胞在小鼠體內(nèi)生長的影響

表5 刺梨多糖對小鼠脾內(nèi)免疫細胞比例的影響(%)

2.5 刺梨多糖可升高小鼠脾內(nèi)免疫細胞的活化 見表6(圖4)。運用FACS法檢測小鼠脾內(nèi)CD4+T、CD8+T和NK細胞的比例及這三種免疫細胞上CD69的表達情況，以及ELISA檢測小鼠血清中IFN-γ的水平。由結果可知，與對照組相比，刺梨多糖可以升高三種免疫細胞上CD69+的表達水平，血清中IFN-γ的分泌水平也明顯增加，且均有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。說明刺梨多糖可以刺激小鼠脾內(nèi)免疫系統(tǒng)的活化。

注：與對照組比較， *P<0.05，**P<0.01圖3 刺梨多糖對小鼠脾內(nèi)免疫細胞比例的影響

表6 刺梨多糖對小鼠脾內(nèi)免疫細胞上CD69+表達水平和血清中IFN-γ分泌水平的影響

注：與對照組比較， *P<0.05，**P<0.01圖4 刺梨多糖對小鼠脾內(nèi)免疫細胞活化及血清中IFN-γ的影響

3 討 論

目前，黑色素瘤發(fā)病率極高，惡性程度高，而抗腫瘤藥物在抑制腫瘤細胞的同時，也會對機體產(chǎn)生一定的損害，因此尋找高效低毒的中藥治療已成為一種趨勢[8-9]。有研究報道，刺梨多糖不僅具有一定的解毒作用，抗氧化作用，同時還有一定的抗腫瘤作用，比如食管鱗癌、胃癌及肺癌等[10-11]。然而，刺梨多糖對黑色素瘤是否有一定的抑制作用還不清楚。因此本研究通過體內(nèi)體外實驗，觀察了刺梨多糖對黑色素瘤B16細胞的作用，結果顯示刺梨多糖不僅在體外可以通過促進B16細胞的凋亡，從而抑制B16細胞的增殖，同時在體內(nèi)可以通過增強免疫系統(tǒng)的活化，抑制小鼠的腫瘤形成。

為了探討刺梨多糖對B16細胞增殖的抑制作用機制，本研究觀察了刺梨多糖對B16細胞凋亡的影響，以確定是否是通過促進腫瘤細胞的凋亡，從而抑制腫瘤細胞生長。結果發(fā)現(xiàn)刺梨多糖可促進B16細胞的凋亡。目前，人們對細胞凋亡現(xiàn)象進行了廣泛的研究，已形成的初步認識多源于對Bcl-2基因家族的研究[12]。有報道認為，Bcl-2為編碼膜相關蛋白，保護腫瘤細胞免受DNA損傷誘導的凋亡，Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，Bax是一種促進細胞死亡的Bcl-2拮抗劑，可促進細胞凋亡[13-14]。因此，本研究利用RT-PCR技術檢測了B16細胞中Bcl-2與 Bax的基因表達，以探究刺梨多糖對B16細胞凋亡的影響的作用機制。結果表明，刺梨多糖可以通過降低Bcl-2的表達，促進Bax的表達水平，促進B16細胞的凋亡，最終抑制B16細胞的增殖。

免疫系統(tǒng)是機體抵抗外來病原菌或者腫瘤細胞的防線，但是腫瘤細胞在發(fā)生過程中，會影響機體的免疫系統(tǒng)，導致免疫系統(tǒng)功能低下，從而有利于自身的逃逸和發(fā)生發(fā)展[15]。基于此，提高機體免疫系統(tǒng)的功能，已成為抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要治療策略。有研究指出，刺梨多糖可以有效提高機體的免疫能力[7]，且可以提高T細胞的增殖能力[16]。脾臟是機體重要的免疫器官，且目前已知道，CD8+T細胞可以通過識別抗原殺傷腫瘤細胞，CD4+T 細胞作為輔助性T細胞,可以誘導和增強適應性免疫應答,促進效應CD8+T細胞發(fā)揮抗腫瘤作用[17]，而NK細胞能通過自身表達的活化性受體識別腫瘤細胞上的配體直接殺傷腫瘤細胞[18]。因此，CD4+T、CD8+T和NK細胞在抗腫瘤過程中發(fā)揮著重要的作用[19]。本研究通過流式檢測小鼠脾內(nèi)CD4+T、CD8+T和NK細胞的比例及活化情況，探究刺梨多糖對荷瘤小鼠機體免疫系統(tǒng)的影響。結果發(fā)現(xiàn)，刺梨多糖不僅可以明顯提高T細胞的比例，還可以提高NK細胞的比例。本研究結果顯示刺梨多糖可增加CD4+T、CD8+T和NK細胞上CD69的表達水平，CD69是免疫細胞活化的重要標志[20]，因此可以說明刺梨多糖可以激活免疫細胞的活化功能。然而，抑制腫瘤的發(fā)生不僅需要腫瘤細胞的直接殺傷，還需要和微環(huán)境中炎癥因子和細胞基質(zhì)等因素緊密配合[21]。IFN-γ具有抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)控的作用。血清中IFN-γ的水平也代表了機體免疫功能的高低。本研究結果顯示刺梨多糖升高了小鼠血清中IFN-γ的分泌水平。因此可以說明刺梨多糖可以通過增加免疫細胞的比例，升高免疫細胞上CD69的表達以及提高IFN-γ的分泌水平三方面，提高機體的免疫系統(tǒng)的活化功能，最終更好地抑制腫瘤的發(fā)展。

綜上，本研究為刺梨多糖用于體內(nèi)體外的抗腫瘤活性研究提供了實驗依據(jù)，是臨床藥物開發(fā)的基礎研究。本實驗室會進一步分離刺梨多糖的成分，同時探討刺梨多糖影響免疫系統(tǒng)的具體機制，探究是否可以促進免疫治療的作用，為聯(lián)合免疫治療黑色素瘤提供更多的實驗和理論依據(jù) 。