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      手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響*

      2021-05-18 12:12:34卜新雅陳露闞玉賀雷華軍何裕建封祿田吳麗
      關(guān)鍵詞:苯丙氨酸鏈?zhǔn)?/a>精氨酸

      卜新雅,陳露,闞玉賀,雷華軍,何裕建,封祿田?,吳麗?

      (1 沈陽化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院, 沈陽 110142; 2 中國科學(xué)院大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院, 北京 100049; 3 武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院, 武漢 430072)(2019年8月23日收稿; 2019年9月17日收修改稿)

      手性是生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域中熱點問題之一[1-2]。DNA作為生命體中重要的遺傳物質(zhì),通過轉(zhuǎn)錄合成mRNA 進而控制氨基酸合成蛋白質(zhì)[3]。而氨基酸作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位,廣泛存在于生命體內(nèi)。在20種組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸當(dāng)中,構(gòu)成蛋白質(zhì)的天然氨基酸為L構(gòu)型(L-AAs),這確保了蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu),使蛋白質(zhì)達到預(yù)期的功能[4]。非天然的D型氨基酸(D-AAs)雖然不是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元,但在許多植物、微生物甚至是人體中都有存在。這些D-AAs主要是L-AAs的非生物酶的外消旋產(chǎn)物或由其他D-AAs的氨基轉(zhuǎn)移酶合成的產(chǎn)物獲得的[5-6]。DNA聚合反應(yīng)在DNA聚合酶的作用下進行,來自水生嗜熱桿菌的DNA聚合酶I[7](Taq-DNA聚合酶)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的生物技術(shù)中起著重要作用[8-9]。

      D-氨基酸體外來源有服用一些藥物和日常食物含有的D-氨基酸,某些藥物如由微生物制得的某些抗生素就會有D-纈氨酸、D-絲氨酸等[10],也有些藥物如利尿藥、低血糖、低血鈣藥物能抑制D-氨基酸氧化酶的合成,使體內(nèi)D-氨基酸水平增加。

      D氨基酸對人體的影響一直有所爭議,D-AAs通常在羊水或腦脊液中含量最低(低于相應(yīng)的L-AAs的1%)。而尿液中含量最高(通常為10%以下)[11]。D-天冬氨酸(Asp)和D-絲氨酸(Ser)殘基在不同的衰老組織中均有特異性檢測;例如,在視網(wǎng)膜、結(jié)膜、角膜[12-13]、牙齒、骨骼[14]、動脈壁、韌帶、大腦[15]、皮膚[16]中都發(fā)現(xiàn)了D-Asp殘基,而在大腦中也發(fā)現(xiàn)了D-Ser殘基[17-18]。人眼因D氨基酸含量增多而失去光澤甚至病變;在老年癡呆的人的大腦中發(fā)現(xiàn)D氨基酸的含量增加[19];據(jù)報道D-谷氨酸濃度的增加會對酵母細(xì)胞的生長產(chǎn)生較強的抑制作用[20]。但也有研究發(fā)現(xiàn)添加D-氨基酸混合物可提高乳酸鏈球菌的耐酸能力,提高乳酸鏈球菌內(nèi)酯的產(chǎn)率[21];在皮膚屏障功能受損時,促進細(xì)胞間脂質(zhì)的生成,加快屏障功能恢復(fù)。在真皮纖維母細(xì)胞(FB)中,D-天冬氨酸能夠減輕因自由基產(chǎn)生源的增加而引起的氧化毒性。另外,D-蛋氨酸亦顯示出對于 FB 的 紫外線損傷有抑制效果。D-氨基酸目前已被應(yīng)用至護膚品當(dāng)中[22]。游離型D-絲氨酸局部存在于成熟哺乳動物的前腦(大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)等),與神經(jīng)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)有關(guān)[23-25]。

      Taq-DNA聚合酶由于其優(yōu)異的熱穩(wěn)定性是PCR中常用酶之一。金屬離子如Ca2+、Ni2+、Cr3+已被報道影響DNA聚合酶的活性[26-27]。鐵鈷(II)單、雙鏈小分子螯合物抑制轉(zhuǎn)錄過程的發(fā)生[28]。環(huán)烯醚萜、馬鞭草苷及其衍生物對Taq-DNA聚合酶有抑制作用[29]。還有一些抑制劑包括雙脫氧核苷酸、磷脂、脂肪酸、類黃酮、三萜類、喜樹堿、花青素和橢圓苷類已被用于臨床試驗[30-33]。 但目前手性氨基酸及其與金屬離子配合物對DNA聚合反應(yīng)的影響仍未見報道。

      本文是在Taq-DNA聚合酶作用下進行的DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng),同時加入手性氨基酸、手性氨基酸與金屬離子共混液、金屬離子等,改變DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)體系的反應(yīng)環(huán)境。通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將產(chǎn)物進行分離,使用Image Lab軟件進行條帶含量分析,通過分析反應(yīng)條帶百分比和統(tǒng)計學(xué)顯著性水平驗證確定手性氨基酸等因素對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響。同時進行手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)影響的時間動力學(xué)分析、手性氨基酸與金屬離子的共同作用等實驗,進一步驗證手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響情況。

      1 實驗部分

      1.1 材料與試劑

      實驗所用的藥品是分析純。所有溶液用超純水配制。DL-丙氨酸(DL-Ala),DL-纈氨酸(DL-Val)等手性氨基酸均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。氯化鈉(NaCl)、氯化鋁(AlCl3)、氯化鉀(KCl)、氯化鈣(CaCl2)等金屬鹽購于北京化工廠。dNTP、轉(zhuǎn)錄模板鏈和5′-FAM 標(biāo)記引物訂購于上海生工生物股份有限公司。Taq DNA 聚合酶及10×Taq Buffer購于北京天根生化科技有限公司。

      1.2 主要儀器與設(shè)備

      儀器使用Thermo Nano DropTMOne超微量紫外分光光度計、Bio-Rad Chemi Doc XRS 高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、Bio-Rad 凝膠電泳儀及PCR儀。

      1.3 手性氨基酸濃度的確定

      手性氨基酸溶液均由超純水配制成50 mmol/L水溶液,使用Thermo Nano Drop超微量紫外分光光度計全波長(200~900 nm)掃描確定手性氨基酸的紫外吸收峰強度。由測量結(jié)果(表1)可知,同種手性氨基酸的吸收強度基本一致,即DL兩種構(gòu)型氨基酸濃度相同,符合實驗條件。20種氨基酸在可見光區(qū)域均無光吸收,在近紫外區(qū)只有3種氨基酸有光吸收能力,這3種氨基酸是苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try),因為它們的R基含有苯環(huán)共軛雙鍵系統(tǒng)。

      表1 手性氨基酸(50 mmol/L)超微量全波長掃描表Table 1 Chiral amino acid (50 mmol/L) ultra-micro full-wavelength scanning table

      1.4 手性氨基酸影響下的DNA引物延伸

      1.5 DNA引物延伸時間動力學(xué)測定

      與手性氨基酸影響下的DNA引物延伸實驗類似,加入Taq DNA聚合酶在55 ℃恒溫孵育后,分別在0、5、10、15、20、25、30 min時間點進行取樣。將樣品加入同等體積的緩沖液混合均勻后放入-20 ℃冰箱內(nèi),確保停止反應(yīng)。取4 μL反應(yīng)溶液加入至20%變性聚丙烯酰胺凝膠泳道中,進行150 V電泳1 h。通過化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀進行成像,使用Image Lab軟件進行條帶分析。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 非極性手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響

      非極性氨基酸共有9種,其中非極性脂肪族R基氨基酸有甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile);非極性芳香族R基氨基酸有苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Try)。除甘氨酸無手性對映體外,其余氨基酸均有D、L兩種手性構(gòu)型。選取丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸以及色氨酸進行實驗,選取重復(fù)實驗3次結(jié)果作圖,并計算氨基酸與空白組及手性氨基酸D、L構(gòu)型之間的顯著性水平(P-Value)。其中10 mmol/L非極性手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)30 min條件下的影響結(jié)果見圖1。

      通過顯著性差異分析,顯著性水平P值越小,兩者差異性越顯著,一般認(rèn)為P≤0.05時差異有顯著性。從圖1可以看出L-苯丙氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的抑制作用大于其他非極性氨基酸,L-丙氨酸抑制作用次之,L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響不明顯。此外除D-色氨酸外,其余D構(gòu)型非極性氨基酸均不同程度地抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng),其中纈氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸的D構(gòu)型抑制作用大于其L構(gòu)型。

      2.2 極性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響

      極性氨基酸共有11種,分為極性不帶電荷(中性)氨基酸、極性帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸和極性帶正電荷(堿性)氨基酸。其中極性不帶電荷氨基酸有脯氨酸(Pro)、天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)。通過實驗得出極性不帶電荷氨基酸在10 mmol/L濃度下對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)30 min的影響見圖2。

      從圖2中可以看出L-天冬酰胺對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)有一定抑制作用,其余L構(gòu)型氨基酸基本無影響。其對應(yīng)極性不帶電荷D構(gòu)型氨基酸與L構(gòu)型相比,均在不同程度上對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)起到促進作用。

      極性帶負(fù)電荷的氨基酸有天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu);極性帶正電荷氨基酸有賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)。其中在極性帶電荷手性氨基酸濃度為10 mmol/L時對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)30 min的影響如圖3所示。

      圖3 極性帶電荷手性氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)產(chǎn)物影響Fig.3 The effect of polar charged chiral amino acids on the products of DNA chain polymerization

      從圖3中可以看出,酸性氨基酸較堿性氨基酸抑制作用更明顯,并且谷氨酸的作用強于其他極性帶電荷氨基酸。極性帶正電荷氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)影響不明顯。

      在極性帶電荷的氨基酸中,通過DL構(gòu)型對比可以發(fā)現(xiàn),除谷氨酸外,其余極性帶電荷氨基酸的D構(gòu)型對DNA鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的負(fù)影響均大于L構(gòu)型。并且?guī)в胸?fù)電荷的天冬氨酸與谷氨酸的抑制作用大于帶有正電荷的賴氨酸、組氨酸、精氨酸。極性帶電荷與極性不帶電荷氨基酸相比,DL構(gòu)型的影響呈現(xiàn)出相反的趨勢。由于部分引物延伸過程未反應(yīng)完全,其質(zhì)量介于未反應(yīng)的17 bp及聚合反應(yīng)完全完成的25 bp雙鏈DNA之間。故17~25 bp之間存在其他條帶。

      2.3 手性精氨酸及苯丙氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響時間動力學(xué)分析

      精氨酸作為堿性氨基酸,是人體生長發(fā)育必不可少的氨基酸。能促使氨轉(zhuǎn)變成為尿素,從而降低血氨含量。從上述實驗得知精氨酸會促進DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的進行。通過分析在0、5、10、15、20、25、30 min時間梯度的反應(yīng)情況,得到圖4。

      圖4 手性精氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)影響的時間梯度反應(yīng)情況Fig.4 Time gradient reaction of the effect of chiral arginine on DNA chain polymerization

      從圖4中可以看出,DNA結(jié)合速率是隨著時間的增加而逐漸降低的,并且手性影響差別規(guī)律明顯,呈現(xiàn)線性相關(guān)趨勢。在相同實驗條件下,D構(gòu)型的精氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的促進作用小于其L構(gòu)型,符合之前實驗結(jié)果。精氨酸等帶正電荷的堿性氨基酸會促進DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的進行,而谷氨酸等帶負(fù)電荷的酸性氨基酸會輕微抑制。說明由于電荷作用,氨基酸對酶和核酸的結(jié)合產(chǎn)生一定的影響。

      苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一,屬芳香族氨基酸。在體內(nèi)大部分經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸,并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素,參與機體糖代謝和脂肪代謝[34]。從上述實驗得知苯丙氨酸會抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的進行。手性苯丙氨酸在0、5、10、15、20、25、30 min時間梯度反應(yīng)情況見圖5。

      由圖5苯丙氨酸動力學(xué)擬合曲線可知,作為抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的苯丙氨酸其動力學(xué)趨勢也與之前實驗相符。苯丙氨酸抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)速率并且L-苯丙氨酸抑制作用較強于D-苯丙氨酸。

      2.4 手性精氨酸及苯丙氨酸與金屬離子對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響

      非極性的苯丙氨酸和極性的精氨酸分別對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)起到明顯的抑制和促進作用,為了進一步探究其在金屬離子存在條件下的影響,故加入手性精氨酸及其與NaCl、AlCl3、KCl、CaCl2、FeCl2、FeCl3、NiCl2、CuCl2、ZrCl4金屬鹽共混溶液進行PCR實驗,實驗結(jié)果如圖6所示。

      圖5 手性苯丙氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)影響的時間梯度反應(yīng)情況Fig.5 Time gradient reaction of the effect of chiral phenylalanine on DNA chain polymerization

      圖6 手性精氨酸與金屬離子對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響Fig.6 The effect of chiral arginine and metal ions on DNA strand polymerization

      從圖6可以看出,手性精氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)起促進作用,并且在濃度為5 mmol/L金屬離子存在的情況下,這一特性及手性規(guī)律基本不變。精氨酸對Na+、Fe2+及Cu2+的促進作用影響較大,對Al3+、Ni2+、Zr4+無明顯作用。精氨酸的加入改善了金屬離子對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響,并且在精氨酸與某些金屬鹽溶液共混過程中,發(fā)現(xiàn)其容易產(chǎn)生絡(luò)合物并析出。所以推測由于精氨酸與金屬離子發(fā)生相互作用,從而減弱了金屬離子對DNA或聚合酶的影響。

      作為抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的苯丙氨酸,其含有芳香族R基團。在相同的實驗條件下,同樣加入其手性氨基酸與NaCl、AlCl3、KCl、CaCl2、FeCl2、FeCl3、NiCl2、CuCl2、ZrCl4金屬鹽共混溶液進行PCR實驗,通過變性聚丙烯酰胺凝膠進行條帶分離并進行數(shù)據(jù)分析,其實驗結(jié)果如圖7所示。

      圖7 手性苯丙氨酸與金屬離子對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)影響Fig.7 The effect of chiral phenylalanine and metal ions on DNA strand polymerization

      從圖7可以看出,手性苯丙氨酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)起抑制作用,但在金屬離子存在的情況下,其抑制程度發(fā)生變化。苯丙氨酸與Na+、Cu2+共同作用時會較單獨加入金屬離子時起到輕微促進的作用。苯丙氨酸與Ca2+、Fe2+協(xié)同對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)抑制較大。手性苯丙氨酸對Al3+、Zr4+幾乎完全抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響無明顯改變。

      3 結(jié)論

      手性氨基酸中D構(gòu)型與L構(gòu)型對于DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的影響并不完全一致,但不同種類氨基酸對其影響呈現(xiàn)一定的規(guī)律。非極性氨基酸中除苯丙氨酸抑制DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)外其余氨基酸對其影響不大。極性不帶電荷氨基酸整體對鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)無明顯影響,但其存在D構(gòu)型氨基酸的反應(yīng)速率均大于L構(gòu)型氨基酸。極性帶負(fù)電荷(酸性)氨基酸對DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)起到輕微抑制作用,極性帶正電荷(堿性)氨基酸對于鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)一定程度上起到促進作用。Na+、K+、Ca2+等9種金屬離子及與手性氨基酸共同作用中,鋁鹽及鋯鹽溶液對PCR實驗幾乎完全抑制;鎳、銅、鈣對其影響次之。手性氨基酸與金屬離子協(xié)同作用會在一定程度上促進或抑制其單獨作用于DNA鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng),并且保持一定的手性影響規(guī)律。

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