子癇前期外周血GLUT-1表達(dá)水平與代謝指標(biāo)的相關(guān)性

羅沛芬 陳小蘭 黃文

妊娠高血壓綜合征，是一種由多種原因引起患者妊娠20 周后出現(xiàn)血壓升高及伴隨癥狀的疾病，隨著疾病的發(fā)展可進(jìn)展為子癇前期，并可出現(xiàn)蛋白尿、頭痛、眼花、惡心、嘔吐、上腹不適等癥狀。Cao［1］等人研究發(fā)現(xiàn)在高血壓患者中葡萄糖有氧酵解過程產(chǎn)生的ATP 少于正常細(xì)胞每摩爾葡萄糖經(jīng)酵解產(chǎn)生36 mol ATP，同時(shí)乳酸、丙酮酸等糖酵解產(chǎn)物水平升高，表明高血壓機(jī)體內(nèi)存在葡萄糖酵解異常。葡萄糖攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)［2］。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1（Glucose transporter-1，GLUT-1）是機(jī)體主要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Hien［3］等人在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)血管平滑肌細(xì)胞中葡萄糖攝取降低可導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-1 升高。這表明，機(jī)體處高血壓狀態(tài)時(shí)在胰島素抵抗或葡萄糖穩(wěn)態(tài)改變的情況下，可能發(fā)生葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT-1 表達(dá)的改變。本研究納入妊高癥及子癇前期患者探究GLUT-1 表達(dá)水平差異及其與代謝指標(biāo)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2019年4月本院收治的100 例子癇前期患者設(shè)為子癇前期組，納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)2015年版《妊娠期高血壓疾病診治指南》［4］中“子癇前期”的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡在25～30 歲；③單胎妊娠；④白蛋白≥40 g/L；⑤血鈣（2.25～2.75）mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并心、腦等嚴(yán)重的器質(zhì)性病變者；②原發(fā)性高血壓者；③合并其他自身免疫性疾病或嚴(yán)重感染者；④凝血功能障礙者。另選取同期于本院健康體檢的人群100 例，設(shè)為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在25～30 歲；②單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并糖尿病、高血壓、高脂血癥等；②合并代謝性疾?。虎奂韧影B前期病史；④具有心、肝、腎等功能障礙。研究對(duì)象均簽署知情同意書，研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 代謝指標(biāo)

1.2.1GLUT-1mRNA 表達(dá)水平測(cè)定

收集所有受試者外周靜脈血樣本2 mL；在4℃，1 000 r/min 的條件下離心10 min，使用TRIzol 從全血中分離總RNA。使用美國(guó)BioTek Synergy?H1 雜交解讀器測(cè)定RNA 純度。使用日本Takara Biotechnology 公司生產(chǎn)的PrimeScript RT 試劑盒將RNA 樣本逆轉(zhuǎn)錄；反應(yīng)條件：42℃20 min，99℃5 min，72℃10 min，獲得cDNA 模板。使用美國(guó)Thermo Fisher Scientific 生產(chǎn)的SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒和ABI 7500 Real -Time PCR 系統(tǒng)檢測(cè)GLUT-1 mRNA相對(duì)于GAPDH的水平；定量測(cè)量使用2-ΔΔCt方式；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性60 s，98℃變性10 S，58℃退火2 s，74℃延伸30 s，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)，74℃最終延伸7 min。引物序列為：GLUT-1 上游引物為5′-CAAACAAAGGACCAAGAAATT-3′，下游引物為5′-UUUCUUGGUCCUUUGUUUGT-3′；GAPDH 前 進(jìn)，5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′和反向，5′-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′。

1.2.2 免疫單邊印跡法檢測(cè)GLUT-1 蛋白表達(dá)

將樣品懸浮在十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）緩沖液（125 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，20%甘油，100 mmoL/L PMSF，10 mg/mL 抑肽酶，1 mg/mL 亮肽素，1 mg/mL胃抑素A）中；加入FLAG 抗體（1∶1 000 稀釋）和內(nèi)參B-actin 抗體（1∶4 000 稀釋）4℃孵育過夜；后用武漢艾美捷科技有限公司GLUT-1 抗血清（純化的山羊抗二抗抗體1∶10 000 稀釋）進(jìn)行免疫印跡。采集圖像后，用凝膠成像儀對(duì)免疫印跡條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.2.3 代謝指標(biāo)檢測(cè)

采用全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)，貝克曼庫爾特，AU5800）測(cè)量患者24 h 尿蛋白、尿酸、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血清肌酐、乳酸、丙酮酸水平。

1.3 觀察指標(biāo)

①兩組患者臨床資料比較。②GLUT-1mRNA表達(dá)水平與子癇前期代謝指標(biāo)乳酸水平、丙酮酸水平的相關(guān)性。③GLUT-1 蛋白表達(dá)水平與子癇前期代謝指標(biāo)乳酸水平、丙酮酸水平的相關(guān)性。

1.4 亞分組

以妊高癥嚴(yán)重程度分組，分析GLUT-1 表達(dá)水平與妊高癥嚴(yán)重程度及代謝指標(biāo)的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；計(jì)量資料用（±s）表示，使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；兩變量間進(jìn)行Pearson 相關(guān)分析；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子癇前期組與對(duì)照組患者臨床資料比較

子癇前期組GLUT-1 表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；代謝指標(biāo)乳酸水平、丙酮酸水平子癇前期組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較（±s）Table 1 Characteristics of the two groups of patients（±s）

表1 兩組患者臨床資料比較（±s）Table 1 Characteristics of the two groups of patients（±s）

臨床資料年齡（歲）身高（cm）體重（kg）BMI(kg/m2)收縮壓(mmHg)舒張壓(mmHg)丙酮酸（mmol/L）乳酸（mmol/L）谷丙轉(zhuǎn)氨酶（mg/L）尿酸（μmol/L）谷草轉(zhuǎn)氨酶(mmol/L)血清肌酐（μmol/L）尿蛋白(g/24 h)腎小球?yàn)V過率［mL/（min-1。GLUT-1mRNA表達(dá)水平GLUT-1 蛋白表達(dá)子癇前期組（n=100）27.56±1.14 156.27±4.62 63.75±4.27 27.21±3.26 149.16±5.11 98.63±4.92 0.12±0.02 1.09±0.06 38.74±4.32 226.89±74.40 33.21±2.44 115.47±12.82 0.67±0.21 131.54±9.30對(duì)照組（n=100）27.84±1.63 157.01±5.13 62.87±5.41 26.84±3.84 124.87±14.39 84.18±6.80 0.07±0.02 0.94±0.05 36.17±2.23 219.45±56.87 31.47±2.14 62.94±19.71 0.25±0.02 134.51±8.27 t 值0.939 0.753 0.872 0.509 9.773 11.557 11.346 14.472 4.483 0.612 3.988 14.715 19.746 1.769 P 值0.353 0.455 0.387 0.613＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.542＜0.001＜0.001＜0.001 0.082 1.00±0.08 0.70±0.15 0.81±0.09 0.64±0.13 11.054 3.023＜0.001 0.003

2.2 GLUT-1 mRNA 表達(dá)水平與子癇前期代謝指標(biāo)乳酸水平、丙酮酸水平的相關(guān)性

GLUT-1mRNA 表達(dá)水平與子癇前期代謝指標(biāo)乳酸水平、丙酮酸水平呈正相關(guān)（P＜0.05）。見圖1。

圖1 GLUT-1 mRNA 與乳酸及丙酮酸水平相關(guān)性Figure 1 GLUT-1 mRNA is associated with lactate and pyruvate levels

2.3 GLUT-1 蛋白表達(dá)水平與子癇前期代謝指標(biāo)乳酸水平、丙酮酸水平的相關(guān)性

GLUT-1 蛋白表達(dá)水平與子癇前期代謝指標(biāo)乳酸水平、丙酮酸水平呈正相關(guān)（P＜0.05），見圖2。

3 討論

圖2 GLUT-1 蛋白與乳酸及丙酮酸水平相關(guān)性Figure 2 Glut-1 protein is associated with lactate and pyruvate levels

妊娠期高血壓疾病是妊娠期特有的疾病，以全身小血管痙攣為病理特性，疾病類型包括妊娠期高血壓、子癇前期等，嚴(yán)重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍生兒發(fā)病和死亡的主要原因之一［5-6］。Park［7］等人證明在中度高血壓的動(dòng)物模型中血管平滑肌細(xì)胞所產(chǎn)生的胰島素刺激的葡萄糖攝取改變，這表明在高血壓狀態(tài)下葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)及血管葡萄糖攝取發(fā)生了改變。Kevin［8］等人在高血壓大鼠動(dòng)脈樣本中發(fā)現(xiàn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)和葡萄糖攝取發(fā)生了實(shí)質(zhì)性變化，證實(shí)高血壓中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)變化獨(dú)立于胰島素信號(hào)傳導(dǎo)，依賴于高血壓狀態(tài)。因此，推測(cè)在妊高癥及子癇前期中GLUT-1 的表達(dá)水平也依賴于血壓變化。

本研究結(jié)果顯示對(duì)比健康人群與子癇前期患者GLUT-1 表達(dá)水平、代謝指標(biāo)乳酸水平、丙酮酸水平發(fā)現(xiàn)妊高癥患者均高于健康受試者。分析認(rèn)為：在Palaniappan［9］等人的研究中指出在妊娠期高血壓疾病患者中存在糖代謝異常、胰島素抵抗等。1 mol 葡萄糖有氧酵解過程產(chǎn)生的ATP 少于正常人體，機(jī)體為維持ATP 平衡狀態(tài)，可適應(yīng)性加快該葡萄糖酵解過程［10-11］。葡萄糖與氧氣在短時(shí)間內(nèi)大量消耗，可引起患者不同程度的低氧和低血糖狀態(tài)。機(jī)體低氧狀態(tài)可促發(fā)機(jī)體無氧酵解，產(chǎn)生乳酸、丙酮酸等。而低血糖狀態(tài)可引起GLUT-1mRNA 和蛋白上調(diào)，加速葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。因此，在子癇前期患者中GLUT-1 表達(dá)水平、代謝指標(biāo)乳酸、丙酮酸水平高于對(duì)照組人群。

Prasannarong［12］等人的研究中表明在高血壓患者中存在葡萄糖酵解異常。異常狀態(tài)的糖酵解過程消耗過多的氧氣及葡萄糖導(dǎo)致機(jī)體處缺氧狀態(tài)，缺氧狀態(tài)可導(dǎo)致葡萄糖攝取和葡萄糖磷酸化（己糖激酶）和乳酸脫氫酶活性的增加，導(dǎo)致葡萄糖酵解過程中產(chǎn)生更多的乳酸及丙酮酸［13］。在Polak［14］等人的研究中指出低氧、低血糖狀態(tài)雖可刺激GLUT-1mRNA 和蛋白增加，增強(qiáng)細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，但兩個(gè)糖酵解步驟的活性沒有顯著變化。證實(shí)當(dāng)考慮到糖酵解途徑，尤其是乳酸脫氫酶途徑時(shí)，GLUT-1 mRNA和蛋白表達(dá)的上調(diào)是促進(jìn)葡萄糖幾乎完全轉(zhuǎn)化為乳酸、丙酮酸的必要條件。

綜上所述，GLUT-1 表達(dá)水平在子癇前期外周血中含量高于健康人群，并與子癇前期患者代謝指標(biāo)乳酸水平、丙酮酸水平呈正相關(guān)，推測(cè)GLUT-1參與了子癇前期患者代謝過程中。葡萄糖攝取和糖酵解也是炎癥性疾病的特征，在子癇前期患者中存在核轉(zhuǎn)錄因子κB 等炎癥因子的改變，但本研究未將其納入探討，另外由于樣本量較少且來源較單一，研究結(jié)果可能存在偏倚，因此后期需將納入炎癥因子進(jìn)行大樣本、多中心的研究。