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    MicroRNA-194緩解高脂環(huán)境下肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制研究

    2021-05-17 02:29:24羅昕徐梓馨周璀徐銘益
    肝臟 2021年4期
    關(guān)鍵詞:油紅高脂脂肪肝

    羅昕 徐梓馨 周璀 徐銘益

    MicroRNA(miRNA)是一類在人體中廣泛分布非編碼小RNA,有多種miRNA如miR-29a、miR-223等與非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)疾病的進(jìn)展有關(guān)[1-4]。肝細(xì)胞的脂質(zhì)沉積及炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致脂肪肝的核心環(huán)節(jié)[5,6]。本研究通過構(gòu)建脂肪肝小鼠模型及脂肪肝細(xì)胞模型,了解在高脂環(huán)境下miR-194調(diào)控肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)的作用。

    材料與方法

    一、材料與試劑

    實(shí)驗小鼠購于上海斯萊克實(shí)驗動物中心,LO2細(xì)胞系購于中科院上海細(xì)胞庫。小鼠低脂飼料及高脂飼料均購于南通特洛菲實(shí)驗飼料有限公司,胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司,1%青霉素鏈霉素雙抗溶液、棕櫚酸、LipofectamineTM3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,TNF-α單克隆熒光抗體購自美國Abcam公司,PCR引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR 試劑盒,HE染色、油紅染色試劑盒均購于上海懿圣生物科技有限公司。

    二、方法

    (一)動物模型構(gòu)建 共有10只8周齡雄性SPF級C57BL/6小鼠用于脂肪肝小鼠模型的構(gòu)建。小鼠體質(zhì)量為25~30 g,由上海斯萊克實(shí)驗動物中心提供,飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗動物中心。10只小鼠隨機(jī)分為低脂組(LFD)與高脂組(NFD),每組5只,LFD組小鼠喂養(yǎng)普通飼料(即低脂飼料),HFD組小鼠喂養(yǎng)高脂飼料。喂養(yǎng)相應(yīng)飼料16周后處死小鼠,取部分肝組織經(jīng)脫水、石蠟包埋或OCT凝膠包埋用于病理學(xué)檢測。取適當(dāng)組織行qPCR檢測,余組織凍存于液氮中。

    (二)肝組織病理檢查 建模小鼠處死后,取適當(dāng)大小的新鮮組織塊置于4%甲醛溶液中固定48 h,后常規(guī)脫水處理,石蠟包埋。蠟塊以4 μm切片用以HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察其病理改變。

    新鮮肝組織經(jīng)過4%甲醛中固定48 h,依次經(jīng)過20%、10%蔗糖溶液梯度各24 h脫水后,用OCT溶膠包埋。以10 μm厚度進(jìn)行冰凍組織切片,用于油紅染色,光學(xué)顯微鏡下檢測其病理程度并拍照。

    (三)細(xì)胞培養(yǎng) 采用含有10%FBS及1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝細(xì)胞系LO2,細(xì)胞培養(yǎng)置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時行細(xì)胞傳代。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞后,以1∶3的比例行細(xì)胞傳代。

    (四)細(xì)胞轉(zhuǎn)染 用0.25%的胰酶消化細(xì)胞后,以1×105/孔的密度將生長狀態(tài)良好的LO2細(xì)胞接種于十二孔板中,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,次日觀察細(xì)胞生長狀態(tài),細(xì)胞透亮伸展,融合度達(dá)到約80%時細(xì)胞轉(zhuǎn)染處理。使用 LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為空白轉(zhuǎn)染對照組(miR-NC組)和miR-194過表達(dá)組(miR-194),分別轉(zhuǎn)染micro-RNA 陰性對照mimics和microRNA-194 mimics,轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/mL,轉(zhuǎn)染完成48 h后收集細(xì)胞,以200 μmol PA刺激LO2細(xì)胞24 h(模擬高脂環(huán)境)。

    (五)RT-qPCR檢測相關(guān)基因miRNA及mRNA表達(dá) 建模后的小鼠組織及轉(zhuǎn)染后的LO2細(xì)胞按照說明書提取總RNA,檢測RNA純度及豐度。按照說明書將獲取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix染料進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。目的基因相對表達(dá)量采用 △△CT 方法計算,目的基因的相對表達(dá)率(relative expression,RQ)=2-△△CT。miRNA的檢測以U6作為內(nèi)參,mRNA的檢測以GAPDH作為內(nèi)參。內(nèi)參基因及目標(biāo)基因均設(shè)3個復(fù)孔。各基因引物見表1。

    表1 qPCR相關(guān)引物序列

    (六)LO2細(xì)胞油紅染色 取生長狀態(tài)良好的LO2細(xì)胞接種于十二孔板中,接種密度為1×105/孔,行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,在細(xì)胞瞬轉(zhuǎn)完成后的24 h后更換濃度為200 μmol PA的完全培養(yǎng)基進(jìn)行高脂處理24 h。細(xì)胞處理完成后,按照說明書進(jìn)行細(xì)胞油紅染色,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積。

    (七)免疫熒光檢測LO2細(xì)胞TNF-α表達(dá) 生長狀態(tài)良好的LO2細(xì)胞接種于十二孔板細(xì)胞爬片中,接種密度為 1×105/孔。完成預(yù)處理的細(xì)胞爬片后用4%多聚甲醛固定15 min, 然后以0.2%Triton X-100室溫通透20 min; 5%BSA溶液, 室溫封閉30 min;以1∶100稀釋一抗孵育細(xì)胞爬片并入濕盒, 4 ℃孵育過夜,以上各步驟之間以PBS浸洗3次, 每次3 min;次日室溫復(fù)溫1 h, 以1∶200的濃度稀釋熒光二抗, 濕盒中室溫孵育爬片1 h。滴加DAPI避光孵育5 min, 對標(biāo)本進(jìn)行染核, 并用含抗熒光淬滅劑的封片液封片, 在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

    三、統(tǒng)計學(xué)分析

    采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件分析。滿足正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有實(shí)驗均獨(dú)立重復(fù)3次。

    結(jié) 果

    一、脂肪肝小鼠造模情況

    LFD組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞排列整齊,細(xì)胞核居于細(xì)胞正中,無明顯脂肪變性及氣球樣變(圖1A)。HFD組小鼠可見肝小葉中肝細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的脂肪變性及氣球樣變,有大量炎細(xì)胞浸潤(圖1B)。油紅染色顯示,LFD組小鼠細(xì)胞形態(tài)正常,肝臟脂質(zhì)沉積較少(圖1C);HFD組小鼠可見胞內(nèi)大量鮮紅色脂滴沉積(圖1D)。HE染色及油紅染色顯示脂肪肝小鼠模型成功構(gòu)建。

    A:低脂小鼠(HE染色×100);B:高脂小鼠(HE染色×100);C:低脂小鼠(油紅染色×100);D:高脂小鼠(油紅染色×100)

    二、miR-194在脂肪肝小鼠肝組織中明顯下降

    LFD組小鼠組為miR-194的相對表達(dá)水平為1.000±0.147,HFD組為0.634±0.116, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.478,P=0.025)。說明在脂肪肝的病理過程中,miR-194表達(dá)受到了抑制,相關(guān)功能受到了影響。

    三、脂肪肝小鼠肝組織中脂質(zhì)合成基因及炎癥相關(guān)基因表達(dá)明顯上升

    與LFD小鼠相比,在HFD組小鼠肝臟組織中促脂質(zhì)合成基因SCD1及ACC的表達(dá)都顯著上調(diào),分別為[LFD:1.000±0.287,HFD:1.658±0.216, (t=4.802,P=0.009]和[LFD:1.000±0.252,HFD:1.851±0.245, (t=4.194,P=0.015)]。SCD1和ACC1是脂質(zhì)合成的關(guān)鍵調(diào)控因子,能夠促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)的合成,促進(jìn)脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)沉積。此外,與LFD小鼠相比,HFD小鼠的TNF-α及IL-6表達(dá)明顯上調(diào)[LFD:1.000±0.172,HFD:1.952±0.147, (t=7.288,P=0.002)]和[LFD:1.000±0.207,HFD:1.452±0.108, (t=3.242,P=0.029)]。這表明,隨著脂質(zhì)沉積于肝細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞的炎癥反應(yīng)增多,氧化應(yīng)激明顯加強(qiáng)。

    四、高脂環(huán)境下,miR-194高表達(dá)可以緩解LO2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積

    QPCR結(jié)果顯示miR-194在LX2內(nèi)升高約1 100倍,過表達(dá)miR-194 LO2細(xì)胞模型成功構(gòu)建。此外,qPCR檢測SCD1和ACC表達(dá),可以發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)miR-194后的LO2細(xì)胞內(nèi), SCD1[miR-NC:1.000±0.149,miR-194:0.625±0.112, (t=3.340,P=0.029)]和ACC[miR-NC:1.000±0.204,miR-194:0.572±0.124, (t=3.105,P=0.038)]表達(dá)明顯下調(diào)。油紅染色檢測細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積,同樣可以發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-194的LO2細(xì)胞內(nèi)紅色脂肪顆粒明顯變少(圖2)。以上結(jié)果表明,在高脂環(huán)境下,miR-194可以明顯LO2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。

    A:miR-NC; B:miR-194

    五、高脂環(huán)境下,miR-194高表達(dá)可以緩解LO2細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)

    結(jié)果表明與miR-NC組LO2相比,過表達(dá)miR-194的LO2細(xì)胞中TNF-α [miR-NC:1.000±0.149,miR-194: 0.563±0.059, (t=4.723,P=0.009)]及IL-6[miR-NC:1.000±0.156,miR-194:0.685±0.112, (t=2.853,P=0.048)]的mRNA表達(dá)水平顯著下降。免疫熒光檢測二組細(xì)胞中TNF-α表達(dá)情況,可以發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-194的LO2細(xì)胞內(nèi)紅熒光程度明顯降低,相對強(qiáng)度為[miR-NC:1.000±0.124,miR-194:0.655±0.152, (t=3.020,P=0.039)],TNF-α表達(dá)明顯下降(圖3)。以上結(jié)果表明在高脂環(huán)境下,miR-194可以明顯減輕LO2細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

    A:miR-NC; B:miR-194

    討 論

    He等[7]發(fā)現(xiàn),miR-233可以通過減輕高脂環(huán)境下肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)使脂肪肝的進(jìn)展減緩。Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)miR-27a可以通過靶向調(diào)控肝細(xì)胞FAS及SCD1基因,抑制其脂質(zhì)合成從而促進(jìn)脂肪肝的進(jìn)展。MiR-194是肝臟中豐度最高的RNA[9]。Wu等[10]在肝星狀細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-194可以通過靶向調(diào)控AKT2 基因 延緩肝纖維化的進(jìn)展。RAN等[11]發(fā)現(xiàn) miR-194可以通過靶向調(diào)控肝癌細(xì)胞RAC1基因延緩肝癌的進(jìn)展。本研究結(jié)果表明,與低脂組小鼠相比高脂小鼠肝細(xì)胞脂肪變性明顯,有大量脂肪滴沉積與肝臟內(nèi),脂肪肝小鼠模型成功構(gòu)建。通過qPCR檢測,發(fā)現(xiàn)miR-194在高脂小鼠肝臟內(nèi)表達(dá)明顯降低,說明在脂肪肝進(jìn)程中,miR-194的功能受到了抑制。

    本研究中,在棕櫚酸刺激LO2后,采用qPCR檢測miR-NC組及過表達(dá)miR-194組細(xì)胞的脂質(zhì)合成因子表達(dá),發(fā)現(xiàn)ACC及SCD1表達(dá)明顯減少。ACC和SCD1均為脂肪酸合成步驟過程中的限速酶,其豐度的高低可以作為顯示脂質(zhì)合成的活躍情況[12]。油紅染色進(jìn)一步表明在過表達(dá)miR-194組,細(xì)胞內(nèi)的脂肪沉積明顯減少。這證明miR-194起到了減緩細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的作用。采用qPCR檢測對照組及過表達(dá)miR-194 LO2細(xì)胞內(nèi)的炎癥因子的表達(dá),發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-6的表達(dá)都在過表達(dá)組中出現(xiàn)了明顯的下降。TNF-α、IL-6是經(jīng)典的炎癥因子,其豐度可以表明目前細(xì)胞的炎癥反應(yīng)狀態(tài)。此外,通過免疫熒光檢測TNF-α的表達(dá),可以發(fā)現(xiàn)在過表達(dá)組中LO2細(xì)胞紅熒光顯著減弱,這表明TNF-α的表達(dá)顯著下降。這些結(jié)果表明miR-194可以減少高脂環(huán)境下LO2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

    綜上所述,通過體內(nèi)實(shí)驗及體外實(shí)驗的結(jié)果表明miR-194可以負(fù)向調(diào)控高脂環(huán)境下肝臟的脂質(zhì)合成及炎癥反應(yīng),起到保護(hù)肝臟的作用,有望成為治療NAFLD的新靶點(diǎn)。而miR-194在脂肪肝進(jìn)程中起到保護(hù)作用的具體機(jī)制及下游靶基因的調(diào)控需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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