硅藻土吸附固定化Bacillus sp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶拆分制備（S）-乙酸蘇合香酯

王曉敏，董 璐＊，徐湘薇，張繼福，張 云，胡云峰*

（1.中國科學院南海海洋研究所∕中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室∕廣東省海洋藥物重點實驗室，廣東廣州 510301；2.中國科學院大學，北京 100049；3.廣東省中醫(yī)院，廣東廣州 510120；4.南方海洋科學與工程廣東省實驗室（廣州），廣東廣州 511458）

【研究意義】手性香料是一類重要的化合物，不同對映體香料可顯示出不同的香氣特征、香氣強度和生物活性[1-3]。在眾多香料中，羧酸酯類是一類非常重要的香料。在食品香精中，酯類香料是用途最廣、用量最大的一類香料產(chǎn)品，它們經(jīng)合理配制可制成各種香型的香精，賦予白酒、無酒飲料、糕點、糖果以及其它食品所需香氣；同時它還廣泛用于配置各種香水、化妝品等日用品香精。（S）-乙酸蘇合香酯香味與所含對映體比例有關(guān)，如對映體過量值（e.e.）為78.3%的（S）-乙酸蘇合香酯帶有鱷梨的青香味和草莓醬的香味；而e.e.為81.1%的（R）-乙酸蘇合香酯帶有杏香、蘋果香和草莓醬香味[1,4]?！厩叭搜芯窟M展】通常，手性化合物的合成可以通過傳統(tǒng)的化學方法合成，但是化學合成需要有毒有機溶劑及重金屬的參與，對環(huán)境及人類具有嚴重的危害，同時還會破壞產(chǎn)品的品質(zhì)，并且通過化學合成得到的手性化合物的光學純度較低[5]。此外，手性化合物還可以通過生物催化劑的方法進行制備[6-10]。與傳統(tǒng)的化學合成相比，酶法選擇性拆分消旋體化合物，具有高立體專一性和區(qū)域選擇性、副反應(yīng)少、產(chǎn)率高、產(chǎn)物光學純度好以及反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點，是一種被廣泛認可的拆分方法[11-13]。微生物是許多有價值的酶、蛋白質(zhì)、高附加值的多不飽和脂肪酸等的重要來源，而大部分的代謝產(chǎn)物存在于細胞內(nèi)，酶法破碎細胞技術(shù)具備條件溫和、設(shè)備簡易和利于環(huán)保等優(yōu)勢。因此，國內(nèi)外的專家學者在這一領(lǐng)域進行了一系列廣泛而深入的研究[14]。劉紅等[15]采用酶解和超聲波相結(jié)合的方式進行了大腸桿菌的破碎實驗研究，確定了此方法可獲得純度更高的包涵體。本實驗室在前期工作中經(jīng)過實驗表明，利用溶菌酶破碎Bacillussp.DL-2以獲取胞內(nèi)蛋白酶拆分乙酸蘇合香酯效果較好[16]。

【本研究切入點】游離酶由于在水溶液中不穩(wěn)定、重復利用性差、不易回收和反應(yīng)產(chǎn)物難以分離等缺點，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。而工業(yè)酶經(jīng)過固定化后可以克服這些缺點，提高其穩(wěn)定性和重復使用性，實現(xiàn)操作連續(xù)性使其經(jīng)濟高效[17-19]。工業(yè)酶的固定化方法主要有物理吸附法、離子結(jié)合法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法[20]。吸附法是常用的酶固定化方法之一，以吸附法固定酶，酶的構(gòu)象很少改變或基本不變，因此，酶的催化活力損失少；另外載體選擇范圍較廣，價格低廉，固定化操作過程簡單，因此吸附法在經(jīng)濟上是最具吸引力的固定化方法[21]。硅藻土由硅藻的細胞壁沉積而成，硅藻土表面的多孔性與負電性使其呈現(xiàn)明顯表面吸附性，因而被常用做吸附載體。硅藻土表面還存在有大量的硅羥基及氫鍵，這些硅羥基及氫鍵同時存在于硅藻土眾多的微孔之中，這些也是硅藻土具備吸附性能的重要原因[22]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本工作利用溶菌酶破碎Bacillussp.DL-2獲取胞內(nèi)蛋白酶，采用硅藻土固定化胞內(nèi)蛋白酶以拆分乙酸蘇合香酯，通過優(yōu)化吸附固定化條件以及拆分條件，制備了高光學純的（S）-乙酸蘇合香酯，為工業(yè)化生產(chǎn)（S）-乙酸蘇合香酯提供了參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 從西太平洋深海沉積物中篩選并鑒定出一株芽孢桿菌Bacillussp.DL-2。

1.1.2 主要儀器 MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌鍋購于日本SANYO公司，OJS-2012R型恒溫搖床購于上海世平實驗設(shè)備有限公司，Allegra X-30R型冷凍離心機購于美國貝克曼庫爾特有限公司，F(xiàn)ULI GC-9700II型氣相色譜儀購于浙江福立分析儀器股份有限公司，ACB-4A1型垂直流超凈工作臺購于新加坡藝思高（ESCO）科技有限公司，MDF-U73V型-80 ℃低溫冰箱購于日本SANYO公司，KB-5010型振蕩器購于海門市其林貝爾儀器制造有限公司，SPL-250型生化培養(yǎng)箱購于天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.1.3 主要試劑 高蛋白脫脂高鈣奶粉（內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司），乙酸蘇合香酯（上海阿達瑪斯試劑有限公司），酵母提取粉和胰蛋白胨（廣州環(huán)凱微生物科技有限公司），溶菌酶（生工生物工程上海股份有限公司），硅藻土（天津大茂化學試劑公司），其他試劑皆為分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基（1）脫脂奶粉固體培養(yǎng)基:1%脫脂奶粉水溶液加1%瓊脂后高壓滅菌待冷卻到50 ℃左右倒平板。（2）種子培養(yǎng)基（Luria-Bertani培養(yǎng)基）:1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，1%NaCl。（3）基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:1%脫脂奶粉水溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 胞內(nèi)蛋白酶的制備 將保存于-80 ℃的Bacillussp.DL-2用脫脂奶粉固體培養(yǎng)基活化后，接種于種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再按1%的接種量接種于基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h（培養(yǎng)基變澄清），然后離心去掉上清液，磷酸（PB）緩沖液清洗2次細胞，取濕重細胞0.5 g，加入1 mg∕mL的溶菌酶溶液20 mL，35 ℃震蕩破碎30 min，離心后去掉細胞殘渣，其上清液即為該菌的胞內(nèi)蛋白酶溶液。

1.2.2 硅藻土固定化Bacillussp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶的條件優(yōu)化 溫度的優(yōu)化。每1 L胞內(nèi)蛋白酶溶液加入50 g的硅藻土，分別在20，25，30，35，40，45，50，55 ℃下震蕩固定化8 h，震蕩器轉(zhuǎn)速為200 r∕min，檢測溫度對固定化效果的影響。

pH的優(yōu)化。將胞內(nèi)蛋白酶液的pH分別調(diào)成5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，每1 L胞內(nèi)蛋白酶溶液加入50 g的硅藻土，在最優(yōu)溫度40 ℃下震蕩固定化8 h，震蕩器轉(zhuǎn)速為200 r∕min，檢測不同pH對固定化效果的影響。

時間的優(yōu)化。在1 L胞內(nèi)蛋白酶溶液中加入50 g的硅藻土，調(diào)節(jié)pH至7，40 ℃，200 r∕min震蕩條件下分別固定化2，4，6，8，10，12，14 h，檢測不同固定化時間對固定化效果的影響。

載體量的優(yōu)化。每1 L pH為7的胞內(nèi)蛋白酶溶液分別加入10，20，40，50，60，80，100 g硅藻土，40 ℃，200 r∕min震蕩條件下固定化10 h，檢測不同載體量對固定化效果的影響。

1.2.3 硅藻土固定化Bacillussp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶的制備 將胞內(nèi)蛋白酶液pH調(diào)至7，每1 L蛋白酶液加入100 g硅藻土，40 ℃、200 r∕min振蕩器中固定化10 h，抽濾后于30 ℃烘干箱中烘干，即得硅藻土固定化的胞內(nèi)蛋白酶。

1.2.4 固定化的胞內(nèi)蛋白酶制備（S）-乙酸蘇合香酯 固定化酶濃度的影響。pH為7的PB緩沖液中分別加入120，160，200，240，280，320 mg∕mL固定化酶，5 mmol∕L的底物（±）-乙酸蘇合香酯，于35 ℃震蕩反應(yīng)8 h，用氣相檢測拆分效果。

拆分時間的影響。pH為7的PB緩沖液中加入160 mg∕mL固定化酶，5 mmol∕L的底物（±）-乙酸蘇合香酯，于35 ℃分別震蕩反應(yīng)2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 h，用氣相檢測拆分效果。

拆分溫度的影響。pH為7的PB緩沖液中加入160 mg∕mL的固定化酶，5 mmol∕L的底物（±）-乙酸蘇合香酯，分別于20，25，30，35，40，45，50 ℃條件下震蕩反應(yīng)7 h，用氣相檢測拆分效果。

拆分pH的影響。配制不同pH（5-9）的緩沖液，加入160 mg∕mL的固定化酶，5 mmol∕L的底物（±）-乙酸蘇合香酯，于30 ℃下震蕩反應(yīng)7 h，氣相檢測拆分效果。

金屬離子的影響。用pH為7的PB緩沖液配制2 mmol∕L的金屬離子溶液（Li+，Na+，K+，Ba2+，Ca2+，Co2+，Cu2+，Mg2+，Ni2+，Al3+，F(xiàn)e2+，Mn2+），分別加入160 mg∕mL的固定化酶，5 mmol∕L的底物（±）-乙酸蘇合香酯，于30 ℃下震蕩反應(yīng)7 h，氣相檢測拆分效果。

1.2.5 固定化酶儲存穩(wěn)定性 按照最佳固定化條件制備一批固定化酶保存于4 ℃冰箱內(nèi)，在最優(yōu)拆分條件下每周測試1次固定化酶拆分效果，連續(xù)檢測一個月。

1.2.6 氣相檢測方法及分析方法 拆分反應(yīng)完畢立即加入與拆分體系等量的乙酸乙酯，2 000 r∕min，震蕩萃取2 min，離心后取上層有機相進氣相檢測。氣相檢測條件為:注射器溫度210 ℃，檢測器溫度210 ℃，載氣為N2，流速1.2 mL∕min，采用梯度升溫進行分析:80 ℃保持1 min，10 ℃∕min升溫到120 ℃，120 ℃保持1 min，15 ℃∕min升溫到210 ℃，保持1 min。

（S）-乙酸蘇合香酯的對映體過量值（e.e.）及轉(zhuǎn)化率（C）按如下公式計算[23]，各因素下重復3次實驗，取平均值確定實驗結(jié)果。

e.e.代表（S）-乙酸蘇合香酯的對映體過量值，Sac和Rac分別表示反應(yīng)后（S）-乙酸蘇合香酯和（R）-乙酸蘇合香酯的峰面積；C為轉(zhuǎn)化率，R0、S0分別代表反應(yīng)前對應(yīng)構(gòu)型的乙酸蘇合香酯的濃度，R、S分別代表反應(yīng)后對應(yīng)構(gòu)型的乙酸蘇合香酯的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化Bacillus sp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶條件確定

圖1 固定化Bacillus sp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶條件優(yōu)化Fig.1 The optimization of the conditions of immobilizing intracellular proteases of Bacillus sp.DL-2

2.1.1 溫度的影響 在固定化階段，以拆分轉(zhuǎn)化率為檢測指標。拆分轉(zhuǎn)化率越高，說明固定化酶量越多；反之，則固定化酶越少。由圖1（a）可知，固定化溫度為20～35 ℃時，轉(zhuǎn)化率在50%左右，當固定化溫度升至40 ℃時，轉(zhuǎn)化率達到最大值89.5%，說明此條件下固定化酶效果最好；隨著溫度的繼續(xù)升高，轉(zhuǎn)化率急劇下降至10%以下，溫度過高會破壞胞內(nèi)蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)，影響酶的催化活性。因此，選擇40 ℃為最佳固定化溫度。

2.1.2 pH的影響 由圖1（b）可知，當pH為5和9時，固定化效果不佳，拆分乙酸蘇合香酯的轉(zhuǎn)化率都在30%以下，當pH升至5.5～8.5時，轉(zhuǎn)化率在90%左右，均達到了一個較高的轉(zhuǎn)化率水平，考慮破碎細胞時所用緩沖液pH即為7，為減少工業(yè)化操作復雜性，選擇pH為7為最佳固定化pH。

2.1.3 時間的影響 由圖1（c）可知，固定化時間小于6 h時，拆分轉(zhuǎn)化率處于一個較低的水平，均低于30%，此時硅藻土孵育時間較短，硅藻土只吸附了少量的蛋白酶，當超過6 h后，固定化效果有了一個明顯的提升，轉(zhuǎn)化率均高于90%，并在10 h時達到最高值95.3%，此時吸附胞內(nèi)酶量最大，但超過10 h后，吸附效果沒有明顯提升，從節(jié)省工業(yè)化制備固定化酶時間考慮，選擇固定化10 h為最佳固定化時間。

2.1.4 載體量的影響 由圖1（d）可知，載體量對固定化的效果影響不大，轉(zhuǎn)化率基本都維持在90%左右，當載體添加量為100 g∕L時，轉(zhuǎn)化率達到最佳值97.2%，同時考慮載體量添加量越大，固定化酶產(chǎn)量也越多，但高于100 g∕L時可能會造成胞內(nèi)酶液與硅藻土接觸面積減少，影響硅藻土吸附胞內(nèi)蛋白酶效果，且載體量的增加也會要求更高頻的震蕩以使酶液與固定化載體接觸充分，對工業(yè)生產(chǎn)而言需要加大投資得不償失，因此選擇100 g∕L為最佳載體添加量。

2.2 固定化酶制備（S）-乙酸蘇合香酯

圖2 固定化酶拆分制備（S）-乙酸蘇合香酯的條件優(yōu)化Fig.2 The optimization of the conditions of preparing（S）-phenylethyl acetate using immobilized enzyme

2.2.1 固定化酶量對拆分的影響 檢測固定化酶拆分效果時，要綜合考慮轉(zhuǎn)化率及e.e.值。由圖2（a）可知，當固定化酶添加量為120 mg∕mL時，轉(zhuǎn)化率和（S）-乙酸蘇合香酯的e.e.值均較低，添加酶量過少，不足以將（±）-乙酸蘇合香酯拆分完全，轉(zhuǎn)化率隨固定化酶添加量的增加逐漸升高，在200 mg∕mL后基本保持不變，說明添加固定化酶量已基本飽和；（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值在160 mg∕mL時達到最大值89.1%，固定化酶量大于160 mg∕mL后，e.e.值呈波動下降趨勢，因此，綜合考慮，選擇最佳固定化酶添加量為160 mg∕mL。

2.2.2 時間對拆分的影響 由圖2（b）可知，隨著時間的增加，拆分轉(zhuǎn)化率及（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值逐漸升高并在7 h時均達到最高值，拆分時間超過7 h后轉(zhuǎn)化率及（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值呈現(xiàn)波動下降趨勢，長時間的反應(yīng)并不能優(yōu)化固定化酶的使用效果，綜合考慮e.e.值及轉(zhuǎn)化率，選擇7 h為最佳拆分時間。

2.2.3 溫度對拆分的影響 由圖2（c）可知，溫度在20～30 ℃時固定化酶拆分轉(zhuǎn)化率隨溫度的升高逐漸增大，（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值基本保持不變，均在91%左右，且轉(zhuǎn)化率在30 ℃時達到最佳值，超過30 ℃后，隨溫度上升，拆分轉(zhuǎn)化率及（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值均逐漸降低，溫度過低會影響固定化酶的活性作用的發(fā)揮，溫度過高可能會使吸附于硅藻土上的固定化酶脫落，使固定化酶轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x酶，使胞內(nèi)蛋白酶更易受高溫的破壞，綜合考慮e.e.值及轉(zhuǎn)化率，選擇30 ℃為最佳拆分溫度。

圖3 金屬離子對固定化酶拆分制備（S）-乙酸蘇合香酯的影響Fig.3 The effect of metal ions on preparing（S）-phenylethyl acetate using immobilized enzyme

2.2.4 pH對拆分的影響 由圖2（d）可知，拆分效果隨pH的增加呈逐漸上升的趨勢，并在pH為7時e.e.值達到最大值，超過7后，隨pH增加拆分效果呈現(xiàn)波動下降的趨勢，但下降趨勢不明顯，e.e.值保持在90%左右，轉(zhuǎn)化率在60%左右，固定化酶在中性及堿性條件下仍能很好的發(fā)揮其拆分作用，用硅藻土固定化胞內(nèi)蛋白酶增加了固定化酶對堿性環(huán)境的耐受程度，因此，選擇pH為7為最佳拆分pH。

2.2.5 金屬離子對拆分的影響 由圖3可知，對照組e.e.值為87.0%，與對照組相比，Cu2+、Na+會稍微降低固定化酶拆分效果，分別使e.e.值降為63.3%及53.0%，其余金屬離子對固定化酶的拆分效果影響不大，e.e.值均維持在80%左右，所檢測的12種金屬離子轉(zhuǎn)化率均高于40%。硅藻土固定化酶降低了胞內(nèi)蛋白酶對金屬離子的敏感程度，對反應(yīng)環(huán)境要求較低，在工業(yè)生產(chǎn)中具備一定的參考意義。

圖4 固定化酶儲存穩(wěn)定性Fig.4 Storage stability of immobilized enzyme

2.3 固定化酶儲存穩(wěn)定性

由圖4可知，4 ℃保存1周的固定化酶拆分轉(zhuǎn)化率和（S）-乙酸蘇合香酯的e.e.值最高，隨保存周數(shù)的增加，e.e.值及轉(zhuǎn)化率均逐漸降低，但在4周后e.e.值仍能達到90.1%，轉(zhuǎn)化率保持在66.6%左右，后續(xù)實驗進展中仍有進一步提升其儲存穩(wěn)定性的必要。

3 討論

（S）-乙酸蘇合香酯是重要的手性藥物中間體和手性化工產(chǎn)品。傳統(tǒng)的化學合成方法需要添加有機溶劑及重金屬，對環(huán)境危害大，且制備的手性化合物光學純度不高[5]。近年來，酶法選擇性拆分制備手性化合物因其更加經(jīng)濟、高效、環(huán)保而備受關(guān)注[24-26]。公顏慧等[27]通過對pH、溫度、有機溶劑等反應(yīng)條件的優(yōu)化提高酯酶手性拆分乙酸蘇合香酯的光學純度。曹瑩瑩等[28]利用來源南海深海的微生物酯酶EST12-7不對稱水解反應(yīng)拆分制備了高光學純的（R）-2-氯丙酸乙酯。

本實驗室在前期工作中篩選并鑒定出一株芽孢桿菌Bacillussp.DL-2，經(jīng)實驗表明，其胞外蛋白酶及全細胞均可手性拆分（±）-乙酸蘇合香酯[29-31]，進一步破碎細胞后，發(fā)現(xiàn)其胞內(nèi)蛋白酶同樣可以拆分（±）-乙酸蘇合香酯，通過優(yōu)化破碎細胞方法，確定了使用1 mg∕mL的溶菌酶在pH為7，35 ℃的條件下破碎30 min所得到胞內(nèi)蛋白酶具備良好的拆分（±）-乙酸蘇合香酯效果[16]。

但游離的胞內(nèi)蛋白酶對環(huán)境高度敏感、不穩(wěn)定且可變性大，而且酶催化劑的價格通常很高，難以在反應(yīng)體系中分離回收，這些問題導致生產(chǎn)成本增加，成為酶工業(yè)化的技術(shù)瓶頸，并限制了游離酶的廣泛應(yīng)用。為了解決這個問題，酶的固定化技術(shù)被提出。酶在固定化后仍然具有較高的酶活力和回收率，而且固定化后酶的穩(wěn)定性和耐受性等重要工業(yè)性能都有相應(yīng)的提高[32-33]。因此，相對游離酶，固定化酶更具有經(jīng)濟價值，其應(yīng)用更加廣泛[34-37]。

吸附法是一種常見的固定化方法，屬于物理法固定化酶的一種，其優(yōu)點在于酶不參加化學反應(yīng)，整體結(jié)構(gòu)保持不變，酶的催化活性得到很好保留，采用吸附法固定酶，其操作簡便、條件溫和，不會引起酶變性或失活，且載體廉價易得，十分適合工業(yè)化生產(chǎn)。硅藻土作為一種價格低廉的吸附載體而備受關(guān)注[22]，硅藻土是一種硅質(zhì)巖石，它主要由古代硅藻的遺骸所組成，其化學成分以SiO2為主，顯微鏡下可觀察到天然硅藻土的特殊多孔性構(gòu)造，這種微孔結(jié)構(gòu)是硅藻土具有特征理化性質(zhì)的原因。固定化酶受固定化條件的影響較大，固定化溫度、時間、pH均能影響酶和硅藻土之間的相互作用，因此，確定最佳固定化條件極為重要。固定化的Bacillussp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶可不對稱拆分制備（S）-乙酸蘇合香酯，為獲得最佳轉(zhuǎn)化率及e.e.值，本實驗優(yōu)化確定了制備（S）-乙酸蘇合香酯的最佳拆分條件，為工業(yè)化制備（S）-乙酸蘇合香酯提供了參考。

4 結(jié)論

本實驗在前期工作的基礎(chǔ)上進一步將Bacillussp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶固定化，利用硅藻土為吸附載體對Bacillussp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶進行固定化，因吸附法主要依靠蛋白質(zhì)和載體之間的結(jié)合力聯(lián)結(jié)，溫度、pH、固定化時間等因素均可影響吸附效果，本工作經(jīng)單因素實驗優(yōu)化確定了最佳固定化條件為:溫度40 ℃，pH為7，固定化時間10 h，載體添加量100 g∕L。在最佳固定化條件下制備了固定化酶，優(yōu)化確定了制備（S）-乙酸蘇合香酯的最佳拆分條件為:固定化酶用量為160 mg∕mL，拆分時間7 h，拆分溫度30 ℃，緩沖液pH為7。在最佳固定化及拆分條件下，制備的（S）-乙酸蘇合香酯e.e.值可達到96.8%，轉(zhuǎn)化率為73.9%（圖5），優(yōu)化后氣相色譜圖與標準品的氣相色譜圖如圖6所示。固定化酶在4 ℃條件下儲存4周后仍具備較高的酶拆分活性，且對低濃度的金屬離子敏感度性較低，后續(xù)將繼續(xù)篩選更優(yōu)良的固定化載體，以期為工業(yè)化制備高光學純度的（S）-乙酸蘇合香酯做參考。

圖5 使用硅藻土固定化的Bacillus sp.DL-2胞內(nèi)蛋白酶拆分制備（S）-乙酸蘇合香酯Fig.5 Preparation of（S）-phenylethyl acetate by immobilized intracellaluar proteases using diatomite of Bacillus sp.DL-2

圖6 硅藻土固定化的胞內(nèi)蛋白酶制備（S）-乙酸蘇合香酯的氣相圖譜Fig.6 The gas chromatogram of（S）-phenylethyl acetate prepared by immobilized enzyme