紅嘴相思鳥貿(mào)易種群性比調(diào)查

蘇英鈺，謝金生，程彬彬，徐永濤，胡曉龍，張微微*，王 丹，2

（1.江西農(nóng)業(yè)大學林學院∕野生動植物與自然保護地研究中心，江西南昌 330045；2.盤錦職業(yè)技術學院，遼寧盤錦 124000）

【研究意義】紅嘴相思鳥（Leiothrix lutea）是雀形目（Passeriformes）噪鹛科（Leiothrichidae）鳥類[1]。廣泛分布于我國南方各省以及越南北部、緬甸西部和北部，并在日本、美國夏威夷群島以及歐洲中西部有穩(wěn)定的人工引入種群[2]。紅嘴相思鳥叫聲婉轉悅耳，顏色艷麗，是重要的觀賞鳥類[3]。過去紅嘴相思鳥的貿(mào)易量很大，據(jù)統(tǒng)計，僅1991－1995年4年時間合法出口量就在45萬只以上，導致資源破壞嚴重[4]，因此被列入瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約（CITES）附錄Ⅱ，也被列入我國“三有”保護物種名錄[5]。其研究主要集中在消化系統(tǒng)[6-7]，神經(jīng)系統(tǒng)[8]，繁殖生態(tài)[9]、寄生蟲[10-11]等方面，性比方面研究缺乏報道。性比（sex ratio）是指種群中雄性個體數(shù)目和雌性的數(shù)目的比例，通常也指雄性個體在群體中的比例[12]，是反映動物種群狀況的基本特征參數(shù)之一，可分為初級性比（卵性比）和次級性比（雛鳥性比）以及成年性比（Adult Sex Ratio，ASR）。種群水平的成年性比對種群配偶關系及繁殖潛力有很大影響，它決定有效種群的大小，是種群走向繁榮還是沒落的一個重要指標[13]。因此，性比是動物種群生態(tài)中的重要研究內(nèi)容，特別是瀕危物種?！厩叭搜芯窟M展】了解鳥類種群性比狀況，首先要鑒定鳥類性別，其方法主要包括形態(tài)學方法、細胞生物學方法（染色體核型分析）和分子生物學方法，但形態(tài)學方法與細胞生物學方法對鳥類的傷害性較大[14]，而分子生物學方法更安全可靠，特別是聚合酶鏈式反應（PCR）擴增法。Ellegren等[15]克隆了第一個定位在鳥類W染色體的基因CHD1-W。由于CHD1基因的高度保守性，所以一對引物可以用于多種非平胸目鳥的性別鑒定；Griffiths等[16]設計了P2∕P8引物可用于絕大多數(shù)鳥類的性別鑒定，至今仍廣泛應用于鳥類性別鑒定和性比研究[17-19]。利用分子生物學手段對單態(tài)型鳥類進行性別鑒定，具有準確性高、簡便、成本低且傷害較小等優(yōu)點[17]?！颈狙芯壳腥朦c】紅嘴相思鳥屬單型性鳥類，雌雄形態(tài)差異不顯著[20]，但市場上仍采用形態(tài)鑒定性別的方法。因此，本研究擬通過分子生物學手段對紅嘴相思鳥進行性別鑒定，探討不同市場上紅嘴相思鳥種群性比?！緮M解決的關鍵問題】研究主要通過分子生物學手段對紅嘴相思鳥進行性別鑒定，探討全國范圍內(nèi)不同市場上的紅嘴相思鳥種群性比，同時驗證市場利用形態(tài)鑒定紅嘴相思鳥性別的準確率，以此來評估其種群整體性比狀況及其貿(mào)易捕捉是否存在性別選擇，為野生紅嘴相思鳥種群的保護和管理提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 血液樣本采集

2018年11月—2019年6月，實地調(diào)查市場中紅嘴相思鳥的貿(mào)易現(xiàn)狀及部分鳥市基于形態(tài)特征的性比狀況，并采集紅嘴相思鳥血液樣本10～20μL用于分子生物學實驗。共采集到血液樣本361份，采集地分布見表1。

表1 采集地分布表Tab.1 Distribution of collection sites

1.2 分子生物學方法性別鑒定

1.2.1 DNA提取 采用Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）提取樣本DNA，4 ℃保存待用。

1.2.2 引物設計及PCR反應條件優(yōu)化 在通用引物P2∕P8基礎上，對擴增片段進行測序，再用獲得序列重新設計專一性更高的引物，引物設計在NCBI網(wǎng)站完成。為保證鑒定體系的穩(wěn)定性，實驗中對PCR體系進行不同設定以摸索出最優(yōu)反應條件。

PCR反應產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。個體性別判斷標準為雄性1條條帶，雌性2條條帶，每個樣本電泳結果3次一致則確定其性別，對于不能成功擴增或結果不一致的個體則舍棄。

1.3 形態(tài)學性別鑒定

14個采樣組中有7組進行了紅嘴相思鳥的形態(tài)學性別鑒定，通過詢問市場攤主，由其根據(jù)經(jīng)驗進行性別判定，即:（1）胸部紅色區(qū)域更寬者為雄；（2）翅膀上黃色斑塊更大為雄；（3）具黃色眼紋為雄等。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以分子生物學鑒定性別的結果為標準，計算市場上形態(tài)學鑒定方法的準確率（A），雄性鑒定準確率（AM）和雌性鑒定準確率（AF）[21]，并計算紅嘴相思鳥貿(mào)易種群的實際性比（R）。

式中，NM、NF、NT分別為雄性鑒定正確個數(shù)、雌性鑒定正確個數(shù)和樣本總數(shù)，NM0，NF0分別為用于性別鑒定的雄性個體數(shù)和雌性個體數(shù)。NM1和NT1分別為分子生物學成功鑒定的雄性個數(shù)和樣本總數(shù)。

所有數(shù)據(jù)均在Excel2013及SPSS19.0軟件中進行處理。

2 結果與分析

2.1 性別鑒定引物及其效果

對原P2引物序列進行了改進，獲得了新引物A1，引物序列見表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer sequence

PCR擴增的反應體系為10 μL，含2×GoTaq?Green Master Mix 5μL，Nuclease-Free Water 3 μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL；PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，退火溫度1 min，循環(huán)35次，72 ℃延伸10 min，A1∕P8退火溫度（51±1）℃。

利用A1∕P8引物對紅嘴相思鳥性別進行分子生物學鑒定，結果與P2∕P8引物的鑒定結果一致，但A1∕P8引物PCR擴增條帶更清晰、穩(wěn)定（圖1）。

圖1 不同引物的擴增結果比較Fig.1 Comparison of amplification results of different primers

2.2 性比結果

利用新的引物成功鑒定出361份樣本的性別，成功率100%。其中雄鳥163只，雌鳥199只。整體性比為0.45，偏雌。在14個采樣組中有5組性比偏雄，7組性比偏雌，2組性比基本平衡（表3，圖2）。

2.3 分子鑒定與形態(tài)學鑒定比較

7個采樣組的紅嘴相思鳥形態(tài)學性別鑒定結果為雄性114只，雌性65只。由表3可知，形態(tài)性別鑒定的總準確率為0.79，其中雄性準確率為0.82，高于雌性（0.74）；7個采樣組的性別鑒定準確率不同，僅有1組準確率達到100%。

表3 分子生物學性別鑒定結果Tab.3 Results of sex identification in molecular biology

圖2 不同采集點紅嘴相思鳥性比結果Fig.2 Sex ratio of Leiothrix lutea collected from different sites

表4 形態(tài)學性別鑒定準確率Tab.4 Accuracy rate of morphological sex identification

3 討論

紅嘴相思鳥雌雄在形態(tài)上的差別很難通過肉眼進行有效分辨[22]。盡管市場認為不同性別紅嘴相思鳥在形態(tài)上存在差異，但這些差別的可靠性沒有經(jīng)過科學驗證。有研究采用比色法來檢驗紅嘴相思鳥雌雄的體色差異，結果顯示眾多測量參數(shù)中沒有任何形態(tài)學參數(shù)證明在雌雄間存在顯著差異，采用單一形態(tài)參數(shù)預測雌雄的結果準確率很低[23]。本文在驗證形態(tài)性別鑒定法的準確率時，同樣發(fā)現(xiàn)其準確率達不到100%，個別鳥市不足50%，說明形態(tài)學鑒定方法嚴重依賴于鑒定者的經(jīng)驗，存在不確定性和顯著的個體差異，且對雌性的誤判率更高。因此，采用分子生物學方法對紅嘴相思鳥進行性別鑒定仍然是最可靠的方法。本文利用引物A1∕P8進行分子生物學性別鑒定，鑒定結果準確，擴增條帶清晰、穩(wěn)定，優(yōu)于通用引物，可以應用于紅嘴相思鳥及其近源物種的性別鑒定。

成年性比呈雄性偏倚現(xiàn)象在許多鳥類中已被證明是普遍存在的，特別是在受威脅的物種和小的或分散的種群中[24-28]。Emilio等[23]在西班牙東北部的巴塞羅那采用陷阱法和霧網(wǎng)法分別在不同地點捕捉了57只紅嘴相思鳥，其中33只為雄鳥，24只為雌鳥，性比為0.579，略偏雄。本研究中紅嘴相思鳥整體成年性比略偏雌，與Emilio等的結果相反。但不同市場上的性比結果差異很大，例如南昌、合肥和梧州等鳥市的性比結果嚴重偏雌，西安和成都等鳥市性比結果則嚴重偏雄。

寵物鳥常常因雄鳥顏色更為艷麗，叫聲更為悅耳，導致價格更高，有可能會誘使捕鳥人偏好捕捉雄鳥。經(jīng)市場調(diào)查結果統(tǒng)計，部分市場雄性紅嘴相思鳥價格更高，且數(shù)量更多。因此，部分市場上紅嘴相思鳥性比偏雄的原因可能與非法捕捉中的性別篩選有關，但該理由不能解釋雌鳥更多的市場結果；實際上，紅嘴相思鳥雌雄差異整體不顯著，多數(shù)市場上紅嘴相思鳥的價格也沒有雌雄差異，所以由選擇偏好導致的捕捉上的性比偏倚應不是普遍現(xiàn)象?？紤]到紅嘴相思鳥的捕捉上市時間以秋季為主，此時紅嘴相思鳥常成群活動，采用網(wǎng)捕法很難篩選性別，因此，市場上紅嘴相思鳥的性比結果可以反映野外種群的實際情況，即很可能存在地區(qū)性性比偏倚現(xiàn)象。紅嘴相思鳥為留鳥，但季節(jié)性集群垂直遷移明顯[3,29]，誘引眾多捕鳥人前往其活動點張網(wǎng)捕捉，且捕獲數(shù)量大[2]，網(wǎng)捕個體來自同一群體的概率大，推測單次購買的鳥有很高概率是來自同一地區(qū)。從每個市場的統(tǒng)計結果來看，大部分存在性比上的顯著差異，僅2個采集地性比平衡。因此，推測紅嘴相思鳥不同地理群體的成年性比存在差異，其中個別地理種群性比偏倚可能較為嚴重。

成年性比（ASR）會影響個體的繁殖或社會地位，以及終生的繁殖成功[30]，且會對種群數(shù)量產(chǎn)生深遠影響。然而在多數(shù)物種的保護當中成年性比沒有得到足夠的重視。紅嘴相思鳥作為我國重要的觀賞鳥類，濫捕濫獵情形仍然嚴重，其野外資源亟需保護。本研究結果是紅嘴相思鳥貿(mào)易種群成年性比的情況，雖然會受無法排除的人為因素影響（例如多來源、人工篩選等），仍可一定程度上反映出野外群體性比的實際狀況及貿(mào)易對種群性比的影響，但仍需野外種群調(diào)查結果的驗證。

致謝：中國科學院動物所雷富民研究員、宋剛副研究員、貴州大學粟海軍教授、陜西動物所羅磊副研究員、劉濤、塔旗等在樣品采集中提供了幫助，謹致謝意！