中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品來(lái)源典型小分子脂肪酸酯合成微生物及酶的研究進(jìn)展

王曉程，徐友強(qiáng)，李秀婷，孫寶國(guó)

（北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程中心 北京100048）

中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的歷史悠久，風(fēng)味獨(dú)特，品種多樣，深受廣大人民喜愛(ài)，是食品工業(yè)的重要組成部分。酯類(lèi)物質(zhì)是傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的一類(lèi)重要風(fēng)味物質(zhì)，以小分子脂肪酸酯類(lèi)為代表。傳統(tǒng)發(fā)酵食品來(lái)源的小分子脂肪酸酯是一類(lèi)低分子質(zhì)量的具有芳香氣味的化合物。以乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯等為典型代表，呈現(xiàn)獨(dú)特的風(fēng)味，例如：乙酸乙酯具有蘋(píng)果樣風(fēng)味，味短，刺激帶澀；丁酸乙酯略帶脂肪臭氣味，似菠蘿樣果香氣味，味澀，爽口；己酸乙酯有菠蘿樣果香氣味，味甜爽口，帶刺激澀感[1]。小分子脂肪酸酯本身的特性，使其成為決定發(fā)酵食品感官和風(fēng)味的一類(lèi)重要化合物。

發(fā)酵食品中的小分子脂肪酸酯類(lèi)主要來(lái)源于微生物的合成代謝。研究表明，發(fā)酵食品制作過(guò)程中有大量微生物參與，微生物可以分泌各種酶，包括酯酶、脂肪酶、蛋白酶、半纖維素酶、纖維素酶和淀粉酶等，作用于原料中的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪酸等。在一系列酶的作用下，一方面產(chǎn)生有利于微生物生長(zhǎng)的小分子糖類(lèi)和氨基酸等主要碳源和氮源，另一方面產(chǎn)生益生元，如低聚糖以及功能性短肽等物質(zhì)，提升了發(fā)酵食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。在發(fā)酵過(guò)程中，微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸和醇，可在酯酶和脂肪酶等羧酸酯水解酶催化下合成小分子脂肪酸酯，增強(qiáng)發(fā)酵食品的獨(dú)特風(fēng)味[2]。這些小分子脂肪酸酯，如乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯，在人體內(nèi)水解產(chǎn)生己酸、丁酸和乙酸等短鏈脂肪酸，對(duì)人體健康具有重要影響。如丁酸可以修復(fù)腸黏膜，治療腸炎以及抑制多種癌細(xì)胞的增值，乙酸可以消除疲勞，抗衰老和增強(qiáng)腎臟功能等。研究解析發(fā)酵食品中小分子脂肪酸酯的合成機(jī)制，對(duì)于確保發(fā)酵食品的產(chǎn)品品質(zhì)具有重要意義。

微生物的酯合成能力來(lái)源于其所表達(dá)的酯合成酶。微生物中具有催化酯合成能力的酶有很多種，本文主要介紹酯酶（EC 3.1.1.1）和脂肪酶（EC 3.1.1.3），二者催化反應(yīng)的最適溫度和最適pH 值隨底物及發(fā)酵食品中酶濃度的變化，以及在食品發(fā)酵過(guò)程中催化小分子脂肪酸酯的合成情況。

1 酯合成微生物的多樣性

中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品品類(lèi)豐富，以發(fā)酵酒、食醋、醬油、泡菜、發(fā)酵乳制品為典型代表，均具有“多微共窖”的特點(diǎn)。在發(fā)酵過(guò)程中，部分微生物對(duì)小分子脂肪酸酯類(lèi)化合物的形成起到了重要作用，如文獻(xiàn)報(bào)道（見(jiàn)表1），多種具有酯合成的微生物，包括細(xì)菌、酵母菌和霉菌均被發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵食品中。

1.1 酯合成細(xì)菌的多樣性

傳統(tǒng)發(fā)酵食品營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，這些風(fēng)味物質(zhì)的來(lái)源主要包括3 個(gè)方面，原料的帶入、發(fā)酵過(guò)程中的化學(xué)轉(zhuǎn)化以及生物作用。其中，生物作用即微生物代謝產(chǎn)生了大量的風(fēng)味物質(zhì)。細(xì)菌對(duì)于小分子脂肪酸酯類(lèi)風(fēng)味物質(zhì)的合成具有重要作用。例如：一些重要的產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌可以通過(guò)深層發(fā)酵方式產(chǎn)生胞外脂肪酶，包括芽孢桿菌、假單胞菌、伯克霍爾德氏菌等[28]；微生物酯酶在細(xì)菌中亦有廣泛分布，在鏈球菌、葡萄球菌、新型隱球菌、乳酸菌、魏斯氏菌等多種細(xì)菌中均有發(fā)現(xiàn)[29]。

我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品領(lǐng)域尤其重視具有小分子脂肪酸酯等風(fēng)味物質(zhì)合成功能的細(xì)菌的研究與應(yīng)用[30]。例如：在中國(guó)傳統(tǒng)白酒發(fā)酵領(lǐng)域，芽孢桿菌是中國(guó)主流大曲白酒發(fā)酵中對(duì)風(fēng)味起重要作用的細(xì)菌[31]，楊帆等[32]研究了對(duì)茅臺(tái)大曲風(fēng)味有突出貢獻(xiàn)的3 株芽孢桿菌：地衣芽孢桿菌MTDB-01、地衣芽孢桿菌MTDB-02、枯草芽孢桿菌MTDB-03，根據(jù)微生物豐度解析確定3 株芽孢桿菌分別約占大曲中細(xì)菌總數(shù)的28%，37%，23%，由此微生物組群形成了較為穩(wěn)定的細(xì)菌發(fā)酵系統(tǒng)；梁龍?jiān)猍33]篩選獲得高產(chǎn)酯酶的芽孢桿菌，其酯酶催化底物具有選擇性，對(duì)己酸的親和及催化酯化效率較高，可以有效提高白酒中己酸乙酯的含量；郭通航等[34]從變質(zhì)食用油中分離出1 株具有己酸乙酯合成能力的伯克霍爾德氏菌X10，該菌株在優(yōu)化發(fā)酵條件下可產(chǎn)生胞外酯酶，用于提高濃香型白酒的風(fēng)味和品質(zhì)；黃丹等[35]從瀘香型大曲中成功篩選出1株血紅鞘氨醇單胞菌，該菌在以黃豆粉為氮源，玉米粉為碳源，pH 7.0，32 ℃，150 r/min 條件下恒溫培養(yǎng)48 h，其酯化酶的酶活可達(dá)18.26 U/mL。

食醋是一類(lèi)重要的調(diào)味品，不僅是我國(guó)的一類(lèi)代表性傳統(tǒng)發(fā)酵食品，在世界范圍內(nèi)也廣泛分布，其產(chǎn)香的小分子脂肪酸酯以乙酸乙酯為代表，催化這種酯合成的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌包括乳桿菌以及醋酸桿菌[12]。聶志強(qiáng)等[36]采用宏基因組學(xué)的方法分析了天津獨(dú)流老醋醋酸發(fā)酵階段的細(xì)菌組成，發(fā)現(xiàn)乳桿菌和醋酸桿菌的豐度較高。乳桿菌是一類(lèi)重要的益生菌，其主要功能是產(chǎn)生大量乳酸并且合成酯化酶催化乳酸乙酯的生成，形成食醋的獨(dú)特風(fēng)味[14]。雷瑪莎[37]在研究微生物及其酶在固態(tài)發(fā)酵制醋中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳酸菌的發(fā)酵有一個(gè)重要的生化過(guò)程，即可以使最后生成的部分乙酸與乙醇生成乙酸乙酯，對(duì)食醋獨(dú)特的濃郁香味具有重要的感官貢獻(xiàn)。醋酸桿菌是食醋中一類(lèi)重要的生產(chǎn)菌株[14]，王宗敏[38]研究發(fā)現(xiàn)醋酸菌是與食醋中風(fēng)味物質(zhì)合成高度相關(guān)的核心微生物菌群之一，從鎮(zhèn)江香醋醋醅中篩選到1 株巴斯德醋酸菌（Pasteurella acetate），可產(chǎn)生酯酶催化醋酸與乙醇合成乙酸乙酯。王宗敏等[39]還從鎮(zhèn)江香醋中分離得到環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulans），該菌株可以耐受6%的乙醇，在pH＞4、醋醅浸取液的比例在20%～40%時(shí)生長(zhǎng)良好，并可促進(jìn)小分子脂肪酸酯等揮發(fā)性物質(zhì)的生成。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品的典型代表還包括醬油、泡菜和乳制品等，其中豐富的細(xì)菌可以產(chǎn)生多種風(fēng)味化合物。在醬油研究中，Xiao 等[21]研究微生物菌群與醬油風(fēng)味的關(guān)系，結(jié)果表明細(xì)菌對(duì)風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)比真菌更突出，其中乳桿菌（植物乳桿菌[40-41]）、明串珠菌、無(wú)色桿菌和片球菌與風(fēng)味密切相關(guān)；Harada 等[42]使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法研究了乳酸菌和酵母菌代謝產(chǎn)物對(duì)醬油香氣特征的影響，確定了微生物源重要香氣成分：乙酸乙酯；劉卓[43]研究了耐鹽乳酸菌對(duì)發(fā)酵工藝和醬油主要風(fēng)味的影響，結(jié)果表明耐鹽乳酸菌的添加可以促進(jìn)酵母菌的生長(zhǎng)，且對(duì)中后期醬油主體風(fēng)味的形成和提高具有良好效果，香氣成分的檢測(cè)表明，乙酸乙酯等11 種香氣成分明顯提高，說(shuō)明耐鹽乳酸菌是改善醬油風(fēng)味的重要細(xì)菌資源。魏斯氏菌（Weissella sp.）是醬油發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，可以代謝合成乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等短鏈脂肪酸；李巧玉[44]從高稀態(tài)醬油中篩選到3 株魏斯氏菌：類(lèi)腸膜魏斯氏菌（Weissella enterica）、融合魏斯氏菌（Weissella faecalis）和食竇魏斯氏菌（Weissella sinensis），并發(fā)現(xiàn)類(lèi)腸膜魏斯氏菌是醬醪來(lái)源魏斯氏菌中具有產(chǎn)酯酶和類(lèi)酯酶功能的菌株，其存在提升了成品醬油的風(fēng)味。在泡菜研究中，朱琳等[45]采用高通量測(cè)序分析了蘿卜泡菜中細(xì)菌的多樣性，其中優(yōu)勢(shì)菌群且具有酯合成性能的細(xì)菌包括乳酸菌、魏斯氏菌和片球菌；魏曉明等[23]在黃秋葵泡菜研制中，添加4%植物乳桿菌、0.3%生香酵母，在此條件下泡菜的酸味和酯香味協(xié)調(diào)，感官評(píng)分最高；張基圣等[46]以低鹽泡菜為研究對(duì)象，其發(fā)酵前期的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌是乳酸球菌和食竇魏斯氏菌，發(fā)酵中、后期的主要優(yōu)勢(shì)菌群是戊糖乳桿菌，乳酸球菌是乙酸乙酯合成的主要功能菌。在發(fā)酵乳制品研究中，李偉程等[47]在解析傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中微生物的多樣性時(shí)，發(fā)現(xiàn)酸牛奶樣品中細(xì)菌屬以乳球菌屬為主，酸馬奶和酸駝奶樣品中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌以乳桿菌屬為主，經(jīng)HS-SPME/GC-MS[48]檢測(cè)方法確定這些細(xì)菌是產(chǎn)C6～C8[49]小分子脂肪酸酯的主要菌種；王小標(biāo)[50]在酸馬奶乳酸菌與酵母菌互生關(guān)系的研究中，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌MLS5 單菌發(fā)酵酸馬奶中含有32 種風(fēng)味物質(zhì)，其中酯類(lèi)物質(zhì)有7 種，包括乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等。

[3-27]物生微的力能成合酯酸肪脂子分小有具中品食酵發(fā)統(tǒng)傳1表[3-27]Microorganisms with small molecule fatty acid ester synthesis ability in traditional fermented foods Table 1 菌霉菌母酵菌細(xì)（Rhizopus霉（Aspergillus niger）、根霉曲黑極（Saccharomyces cerevisiae）、南母酵酒釀菌桿孢（Burkholderia sp.）、芽菌氏德?tīng)柣艨瞬?、（As-霉曲色灰（Mucor sp.）、煙霉sp.）、毛酵赤畢常（Candida antarctica）、異母酵絲假孢芽狀（Bacterium sp.）、梭菌桿（Bacillus sp.）、擬（Monascus霉曲紅色pergillus fumigatus）、紫（Torulosis母酵擬（Pichia anomala）、球母（Staphylo-菌球萄（Bacillus fusiformis）、葡菌桿（Monascus ruber）霉曲紅色purpureus）、紅sp.）（Sphingomonas菌胞單醇氨鞘紅coccus sp.）、血）sanguinis霉頭）、犁（Monascus purpureus霉曲紅色紫赤）、畢（Saccharomyces cerevisiae母酵酒釀（Staphylococ-菌球萄）、葡（Bacillus sp.菌桿孢芽、（Peni-霉）、青（Mucor sp.霉）、毛（Absidia sp.（Saccha-母酵孢膜復(fù)囊）、扣（Pichia sp.母酵屬菌）、泛（Enterobacter sp.屬菌桿）、腸cus sp.）、（Aspergillus fumigatus霉曲）、煙cillium sp.母酵姆漢科威常）、異romycopsis fibuligera屬菌）、梭（Weissella sp.菌氏斯）、魏（Sodalis sp.）（Rhizopus oryzae霉根米母酵香）、酒（Wickerhamomyces anomalus）（Lactobacillus sp.菌桿酸）乳（Clostridium sp.）（Brettanomyces sp.）、根（Aspergillus sp.霉）、曲（Mucor sp.霉毛（Saccharomycopsis fibulig-母酵孢膜復(fù)囊扣（Acineto-菌桿動(dòng)）、不（Lactobacillus sp.菌桿乳、）、犁（Penicillium sp.霉）、青（Rhizopus sp.霉（Wickerhamomyces母酵姆漢克威常）、異era桿孢）、芽（Pseudomonas sp.菌胞單）、假bacter sp.）（Absidia sp.酶頭母酵絲）、假（Pichia sp.母酵赤）、畢anomalus）、鏈（Acetobacter sp.菌桿酸）、醋（Bacillus sp.菌）、裂（Hansenula sp.母酵遜）、漢（Candida sp.（Actinomadura菌線(xiàn)）、放（Streptococcus sp.菌球母酵擬）、球（Schizosaccharomyces sp.母酵殖）sp.）（Torulopsis sp.（As-霉曲）、黑（Aspergillus oryzae霉曲米酵氏）、魯（Candida versatilis母酵絲假變多（Staphylococ-菌球萄）、葡（Bacillus sp.菌桿孢芽）pergillus niger（Toru-母酵擬）、球（Saccharomyces rouxii母（Pe-菌球）、片（Weissella sp.菌氏斯）、魏cus sp.（Torulopsisversatilis母酵圓變）、易lopsis sp.）（Lactobacillus sp.菌酸）、乳diococcus sp.）（Zygosaccharomyces sp.母酵合）、結(jié)sp.母酵紅）、膠（Candida sp.母酵絲假（Weissella菌氏斯）、魏（Lactobacillus sp.菌桿酸乳母酵赤畢）、（Rhodotorula mucilaginosa菌桿色）、無(wú)（Leuconostoc sp.菌珠串）、明sp.（Saccharomyces母酵酒）、釀（Pichia sp.）（Pediococcus sp.菌球）、片（Achromobacter sp.）cerevisiae（Gibberella sp.）菌霉赤母酵氏（Trichosporon asahii）、范母酵堿耐（Strepto-菌球（Lactococcus lactis）、鏈菌球乳酸乳母酵維魯克斯克）、馬（Vanderwaltozyma sp.球片酸）、乳（Lactobacillus sp.菌桿）、乳coccus sp.（Sac-母酵酒）、?。↘luyveromyces marxianus（Bifi-菌桿歧）、雙（Pediococcus acidilactici菌（Candida母酵絲）、假charomyces cerevisiae串）、明（Enterococcus sp.菌球）、腸dobacterium sp.）、（Saccharomyces unisporus母酵孢）、單sp.）（Leuconostoc sp.菌珠）（Pichia sp.母酵赤畢料原米、玉米、大米、糯豆、豌米、玉米、黍麥、小粱、高米、大粉乳或乳羊粱高麥小米稻米小米玉米小豆大菜蔬牛生酵發(fā)品食酒白酒黃醋食油醬菜泡乳酵發(fā)品制

1.2 酯合成霉菌的多樣性

霉菌中關(guān)于紅曲霉（Monascus sp.）產(chǎn)酯化酶催化小分子脂肪酸酯合成的研究最多[51]，其次是青霉（Penicillium sp.）、根霉（Rhizopus sp.）、黑曲霉（Aspergillus niger）、米曲霉（Aspergillus oryzae）等。紅曲霉能促進(jìn)己酸、丁酸與乙醇的酯化過(guò)程，且產(chǎn)物以己酸乙酯為主，酯化能力極強(qiáng)，有文獻(xiàn)報(bào)道以紅曲霉生產(chǎn)酒用調(diào)香液，其己酸乙酯的含量穩(wěn)定在8 g/L 的水平[52]；根霉對(duì)己酸、丁酸和乙醇的酯化作用較弱，可催化生成己酸乙酯和丁酸乙酯[53]。

紅曲霉嗜酸，耐高溫，耐乙醇性較強(qiáng)，因此常應(yīng)用于釀造和醫(yī)藥行業(yè)。杜禮泉[54]在紅曲霉酯酶酯化特性的研究中發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)乙酸、己酸、丁酸都有較強(qiáng)的酯化作用并生成相應(yīng)的乙酯，其底物專(zhuān)一性較低，屬于鍵合專(zhuān)一性的酶。紅曲霉都可以以乳酸為底物，在濃香型白酒制作過(guò)程中，可以降低乳酸及乳酸乙酯的含量并催化己酸乙酯的合成，“增己降乳”利于白酒品質(zhì)的提高[55]。煙色紅曲霉能夠分泌直接催化己酸和乙醇反應(yīng)生成己酸乙酯的胞外酶，該酶適應(yīng)的的溫度范圍較廣，pH 值穩(wěn)定范圍大，使其在濃香型大曲酒生產(chǎn)中應(yīng)用較多，能同時(shí)提高曲酒中四大乙酯的含量[54]。Guo 等[56]對(duì)來(lái)自紅曲霉M-7 的冷活性酯酶Lip10 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該酯酶最適反應(yīng)溫度為40 ℃，對(duì)有機(jī)溶劑、金屬離子有很好的耐受性，這些特性使Lip10 在食品工業(yè)和化學(xué)合成方面應(yīng)用較為廣泛。Kang等[57]從紅曲霉M-7 中得到1 種高有機(jī)溶劑耐受性的酯酶Lip2，結(jié)果顯示該酶作用的最適溫度為40℃，且在60 ℃下孵育3 h，仍能保持70%的活性，對(duì)金屬離子有較強(qiáng)的耐受性。在黃酒風(fēng)味物質(zhì)的合成過(guò)程中，紅曲霉同樣發(fā)揮重要作用。蔡琪琪[7]在研究紅曲霉在紅曲黃酒釀造過(guò)程中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，釀造體系中紅曲霉在發(fā)酵的前3 天是優(yōu)勢(shì)菌，并且紅曲霉是有機(jī)酸的主要生產(chǎn)菌，可以促進(jìn)酯的合成。

其它霉菌產(chǎn)酯化酶的研究亦有報(bào)道，而相比于紅曲霉研究較少。張超等[8]對(duì)古越龍山發(fā)酵黃酒醪液中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)分離與鑒定，并使用GC-MS 對(duì)香味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)青霉（Penicillium sp.）C01 產(chǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)能力優(yōu)于其它霉菌。我國(guó)醬油生產(chǎn)所用的菌種以米曲霉為主，米曲霉在醬油的發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生豐富的酶系，包括蛋白酶、淀粉酶、酯酶等，這些酶對(duì)醬油風(fēng)味物質(zhì)的合成具有重要作用[58]；童佳等[59-60]、劉雅頎[61]研究發(fā)現(xiàn)以米曲霉作為主要菌種強(qiáng)化醬油發(fā)酵，醬醪中的特征性揮發(fā)風(fēng)味物質(zhì)包括己酸乙酯和辛酸乙酯等31 種酯類(lèi)物質(zhì)，且在發(fā)酵過(guò)程中，大量菌絲體發(fā)生自溶，菌絲體中含有豐富的蛋白質(zhì)、核酸、糖類(lèi)等，也對(duì)醬油風(fēng)味有貢獻(xiàn)。另外，通過(guò)大量的文獻(xiàn)報(bào)道也發(fā)現(xiàn)根霉和黑曲霉等具有催化合成小分子脂肪酸酯的特性。例如：盧世珩等[62]從優(yōu)質(zhì)濃香型大曲中分離得到的根霉菌種Rh-9103，該菌生長(zhǎng)快，繁殖力強(qiáng)，耐乙醇，溫度適應(yīng)范圍大，主要產(chǎn)生催化合成己酸乙酯的酶類(lèi)；孫舒揚(yáng)[63]從白酒大曲中分離出的絲狀真菌華根霉，其酯合成脂肪酶為SSL1 和SSL2，并發(fā)現(xiàn)SSL1 是在固態(tài)發(fā)酵中起重要作用的酯合成脂肪酶，該酶的最適溫度為40 ℃，最適pH 值為8.0，純化后對(duì)有機(jī)溶劑有較好的耐受性，對(duì)長(zhǎng)鏈的脂肪酸酯催化活性較高。Guldhe 等[64]研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉來(lái)源脂肪酶具有高有機(jī)溶劑耐受性，可應(yīng)用于小分子酯以及生物柴油的制備。

1.3 酯合成酵母菌的多樣性

酵母菌是一類(lèi)重要的酯合成真菌。從傳統(tǒng)發(fā)酵食品的制作過(guò)程中分離出的酵母菌在增酯增香方面起到了重要作用。如應(yīng)用于將白酒行業(yè)產(chǎn)生的大量丟糟中的有機(jī)酸轉(zhuǎn)化成呈香酯類(lèi)的南極假絲酵母（Candida antarctica）脂肪酶B，可提高釀酒副產(chǎn)物的利用率，節(jié)省成本，工藝條件為：南極假絲酵母脂肪酶B 用量0.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、食用酒精（95%，體積分?jǐn)?shù)）添加量20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、25 ℃反應(yīng)8 d 條件下效果最好，用試驗(yàn)中所優(yōu)化的工藝條件處理白酒丟糟能夠提高丟糟中呈香物質(zhì)的含量[65]。異常畢赤酵母中高產(chǎn)乙酸乙酯和乙酸的酵母菌株Ac-47 和Ac-19，分離于清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的酒醅，具有高效的乙酸乙酯催化合成特性[66]。劉飛等[67]從新疆哈薩克族奶酪中分離得到的4 株產(chǎn)脂肪酶的酵母菌菌株Y-2、Z-5、S-6、N-5，經(jīng)鑒定Y-2、Z-5 屬于馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus），S-6 屬于畢赤酵母（Pichia sp.），N-5 屬于乳酸克魯維酵母（Kluyveromyces lactis），其中馬克斯克魯維酵母Z-5 的脂肪酶酶活可達(dá)25.99 U/mL。李學(xué)偉等[68]研究了添加生香酵母對(duì)醬油風(fēng)味的影響，由于酵母發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生酯化酶對(duì)有機(jī)酸類(lèi)與醇類(lèi)進(jìn)行酯化作用，酯類(lèi)物質(zhì)在揮發(fā)性成分中的比例由0.99%提高到12.08%，顯著提升了醬油的風(fēng)味。龔加路等[18]從川南農(nóng)家泡菜中篩選到1 株生香酵母Y7，其產(chǎn)生的主體揮發(fā)性香味是乙酸乙酯、丁酸乙酯等6 種物質(zhì)，為泡菜發(fā)酵增香奠定了基礎(chǔ)。

2 微生物源酯合成酶的多樣性

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中存在酯合成能力的微生物種類(lèi)十分豐富，對(duì)發(fā)酵食品的風(fēng)味形成具有重要影響。微生物的酯合成特性，決定于微生物所攜帶的具有酯合成能力的功能酶。本節(jié)以乙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸乙酯為代表性小分子脂肪酸酯，對(duì)微生物源酶進(jìn)行概述。

2.1 合成乙酸乙酯的微生物源酶

乙酸乙酯的化學(xué)合成一般采用乙酸和無(wú)水乙醇在濃硫酸作用下生成乙酸乙酯，而化學(xué)來(lái)源的化合物在食品中應(yīng)用的接受度越來(lái)越低，隨著生活水平的提升，人們對(duì)天然來(lái)源的化合物的需求增大。通過(guò)微生物所產(chǎn)酶催化合成的化合物可被認(rèn)為是天然化合物，因而需求逐步增大。微生物酶催化合成乙酸乙酯，具有反應(yīng)效率高，條件溫和易控，副產(chǎn)物少，操作簡(jiǎn)單安全，產(chǎn)品可被認(rèn)為是天然化合物等優(yōu)勢(shì)。限制乙酸乙酯酶催化合成的主要因素包括底物的濃度、反應(yīng)的最適條件以及酶的種類(lèi)和用量等。葛清秀等[69]分離源自青霉FS1884-1 的堿性脂肪酶A，可在正庚烷中催化合成乙酸乙酯，當(dāng)乙酸濃度為0.20 mol/L，乙醇濃度為0.25 mol/L，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，每間隔一定時(shí)間加入一定量的3A，分子篩移走產(chǎn)物中的水分，反應(yīng)溫度為36 ℃，反應(yīng)時(shí)間為48 h，堿性脂肪酶A 的加入量為0.30 g/瓶 （相當(dāng)于1 700 U/g 乙酸），此時(shí)催化效果最好，乙酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到71.4%。南極假絲酵母脂肪酶B 在其用量0.2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、食用酒精（95%，體積分?jǐn)?shù)）添加量20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、25 ℃反應(yīng)8 d 條件下酯化的效果最好，所得60%（體積分?jǐn)?shù)）綜合酒樣品中乙酸乙酯質(zhì)量濃度達(dá)到112.5 mg/100 mL[65]。L?ser 等[70]研究了馬克斯克魯維酵母DSM 5422，該菌株所產(chǎn)酯酶可以催化合成乙酸乙酯。黃丹等[71]研究發(fā)現(xiàn)異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）所產(chǎn)的酶可在低溫條件下高產(chǎn)乙酸乙酯。鄭樹(shù)煬等[15]研究了山河陳醋生產(chǎn)中酵母菌產(chǎn)酯特性，分離得到的12 株菌株中，菌株QY18 發(fā)酵液中檢出7 種特征性風(fēng)味物質(zhì)，其中乙酸乙酯含量為22.79%。對(duì)微生物法合成乙酸乙酯的研究越來(lái)越多，這奠定了該方法在我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品領(lǐng)域中的應(yīng)用將更加廣泛。

2.2 合成丁酸乙酯的微生物源酶

丁酸乙酯傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法是丁酸與無(wú)水乙醇在濃硫酸的作用下酯化，而反應(yīng)體系中會(huì)含有少量的副產(chǎn)物醚等，應(yīng)用于食品行業(yè)具有安全隱患，而利用微生物產(chǎn)酶合成丁酸乙酯則安全的多。產(chǎn)自于枯草芽孢桿菌的脂肪酶BSL2，可以在有機(jī)相中催化合成丁酸乙酯，以正己烷為溶劑，初始水活度為0.33，加酶量為100 mg，丁酸濃度為40 mmol/L，底物物質(zhì)的量比（丁酸/乙醇）為1∶1.5，在40 ℃條件下振蕩反應(yīng)30 h，合成丁酸乙酯的轉(zhuǎn)化率可達(dá)94.8%[15]。邢爽等[72]研究了濃香型、醬香型以及清香型大曲的酯化酶對(duì)合成丁酸乙酯的催化活力，研究發(fā)現(xiàn)：清香型和濃香型大曲的酶活力隨丁酸濃度的升高先升高后降低，醬香型大曲的酶活力則是逐漸升高，清香型、濃香型和醬香型大曲的酶催化合成丁酸乙酯的最適pH 值分別為4.5，4.0 和3.0。不同微生物所產(chǎn)酶的催化特性各有不同，且需要考慮丁酸乙酯合成時(shí)其合適的酸濃度和pH 值范圍。

2.3 合成己酸乙酯的微生物源酶

己酸乙酯是白酒中主要的香味物質(zhì)，近年來(lái)，因?yàn)檎{(diào)制白酒行業(yè)的發(fā)展，己酸乙酯的需求量也隨之增加，己酸乙酯的合成方法也在不斷改進(jìn)，微生物酯化酶催化己酸乙酯的合成是其中一種具有良好發(fā)展前景的方法，霉菌是主要菌種。王曉丹等[73]從生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)分離得到的紅曲霉I518 可以產(chǎn)催化己酸乙酯合成的脂肪酶，該菌株較理想的產(chǎn)酶發(fā)酵條件為：麩皮∶豆粕=2∶3，接種量20%，培養(yǎng)基初始pH 值為7，培養(yǎng)溫度為32 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為5 d，該條件下所產(chǎn)的粗酶制劑所催化的香酯液中己酸乙酯量達(dá)0.38 mg/mL，含量明顯增加。煙灰色紅曲霉所產(chǎn)酯酶的最適催化溫度為40 ℃，最適催化酒精度為12%（體積分?jǐn)?shù)），最適催化pH 值為3.0，屬于鍵專(zhuān)一性酶，該胞外酶可以直接催化己酸和乙醇合成己酸乙酯[54]。另一種煙灰色紅曲霉菌種Q-306，從實(shí)驗(yàn)室篩選的大曲中分離所得，該酯化紅曲對(duì)己酸乙酯具有很強(qiáng)的催化專(zhuān)一性，在最佳催化溫度為35 ℃，最適催化酒精度為20%vol，最適催化pH 值為3.5，最佳底物濃度為9.29 mg/mL條件下，酯化力為65 mg/（g·100 h）[74]。胡靖等[75]從貴州某知名酒廠(chǎng)濃香大曲中分離得到的紫色紅曲霉IS518，該菌株的己酸乙酯酯化力較高，在實(shí)驗(yàn)室條件下可達(dá)62.79 mg/g，作為己酸乙酯脂肪酶產(chǎn)生菌有著較大的應(yīng)用潛力。唐玉明等[76]對(duì)紅曲酯化菌21-3 的特性研究中發(fā)現(xiàn)，四大酸和乙醇反應(yīng)生成相應(yīng)的乙酯，而四大酸的混合物與乙醇反應(yīng)生成的物質(zhì)卻為己酸乙酯。己酸乙酯在傳統(tǒng)發(fā)酵食品風(fēng)味的形成方面，與其它小分子脂肪酸酯相比較為重要，因此天然健康的合成方法更加受到人們的重視。

此外，還有多種微生物源酶可以催化合成己酸乙酯。例如，郭通航等[34]從變質(zhì)的食用油中分離得到1 株具有產(chǎn)己酸乙酯酯化酶能力的伯克霍爾德氏菌X10，研究發(fā)現(xiàn)該菌的最佳酯化條件為：己酸添加量2%，酯化溫度35 ℃，酯化液初始pH 4.6，連續(xù)振蕩48 h，優(yōu)化條件下酯化酶活力由1.79 U/mL 提高到3.53 U/mL，較優(yōu)化前增加了97.21%。在眾多脂肪酶中，南極假絲酵母脂肪酶B 的用途最為廣泛，它對(duì)非水溶性及水溶性物質(zhì)都有很強(qiáng)的催化活性，尤其在非水相催化中，該酶表現(xiàn)出極好的活性和操作穩(wěn)定性，該研究中利用α-凝集素表面展示系統(tǒng)成功的將南極假絲酵母脂肪酶B 錨定在釀酒酵母細(xì)胞的表面，并以該工程菌全細(xì)胞合成己酸乙酯作為應(yīng)用模型，具有反應(yīng)速度快，產(chǎn)率高，操作穩(wěn)定的特點(diǎn)，當(dāng)己酸與乙醇的摩爾比為1∶1.25 時(shí)，己酸乙酯的生成率為98.0%[77]。劉雪等[78]研究發(fā)現(xiàn)華根霉F8 發(fā)酵時(shí)可以產(chǎn)酯化酶，該酯化酶在一定條件下可以催化己酸乙酯的生成，在25 ℃下酯化25 d 可測(cè)得己酸乙酯含量為2 034.5 mg/100 mL。然而，由于中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的多元性以及微生物的多樣性，加之傳統(tǒng)發(fā)酵食品現(xiàn)代化研究程度低，發(fā)酵食品來(lái)源聚焦于微生物酶資源序列和結(jié)構(gòu)解析，以及催化機(jī)制的研究相對(duì)匱乏，也是食品領(lǐng)域今后的重要研究方向之一。

3 微生物酯合成酶的應(yīng)用

3.1 發(fā)酵食品工業(yè)

發(fā)酵食品領(lǐng)域很多品類(lèi)產(chǎn)品的風(fēng)味與酯類(lèi)物質(zhì)密切相關(guān)。酯酶所具有的酯合成、酯水解[79-80]、酯交換[79]等功能，使其在發(fā)酵食品酯類(lèi)合成中居重要地位（圖1）。以白酒為例，中國(guó)白酒為世界著名的六大蒸餾酒之一，與其它蒸餾酒相比，中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵白酒擁有獨(dú)特的風(fēng)味，具有酯高、酸高、醛酮高、高級(jí)醇低的特點(diǎn)[81]。酯類(lèi)中的己酸乙酯和乙酸乙酯等的含量和比例關(guān)系在很大程度上決定白酒的感官和風(fēng)味[82]。以白酒中消費(fèi)量最大的濃香型白酒為例，其感官及酒的品級(jí)，主要取決于己酸乙酯的含量以及與其它酯類(lèi)物質(zhì)的比例是否協(xié)調(diào)。酶制劑應(yīng)用于白酒生產(chǎn)中，可以起到增加白酒酯類(lèi)含量的作用，從而提高白酒的優(yōu)質(zhì)率。對(duì)于可應(yīng)用到白酒領(lǐng)域的酯酶，首先要耐酸，其次對(duì)乙醇有良好的耐受性，并且酯化力強(qiáng)，以縮短釀造周期，提高生產(chǎn)效率。酯酶在其它傳統(tǒng)發(fā)酵食品中也有應(yīng)用，如釀造食醋、醬油、泡菜以及營(yíng)養(yǎng)豐富的發(fā)酵乳制品。近年來(lái)，隨著宏基因組文庫(kù)、基因工程、定向進(jìn)化技術(shù)、固定化技術(shù)的發(fā)展，以及界面酶促過(guò)程等技術(shù)的深入開(kāi)展，高效產(chǎn)酯酶菌株的篩選、誘變育種、基因克隆及其定向進(jìn)化構(gòu)建高效基因工程菌的研究取得了良好成果，微生物酯酶的研究目前已經(jīng)深入到分子層面，包括酶對(duì)底物的選擇和作用機(jī)制[82]，相關(guān)科學(xué)機(jī)制的解析，必將進(jìn)一步有力推動(dòng)酯酶在發(fā)酵食品工業(yè)的應(yīng)用。

3.2 藥物合成領(lǐng)域

化學(xué)合成法是醫(yī)藥領(lǐng)域很多藥物合成的主要途徑，然而許多藥物都要求是手性化合物，這對(duì)化學(xué)合成是一個(gè)挑戰(zhàn)。酶具有手性選擇性，以酶作為工具拆分手性化合物已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，酯酶和脂肪酶是酶拆分中研究較為廣泛的酶類(lèi)[83]。Wen 等[84]考察了LipaseCAN、LipaseRH 2 種酶對(duì)α-苯乙胺的拆分效果，并與幾種商品酶做了對(duì)照，結(jié)果表明，Novozyme435 來(lái)源商品酶的拆分效果最好。Godinho 等[85]用酯酶高效的對(duì)1，2-O 異亞丙基甘油酯進(jìn)行拆分，其中對(duì)映體過(guò)量值可達(dá)到72%～94%，該酯酶還對(duì)1-乙酸苯乙酯有高對(duì)映選擇性，得到具有＞99%ee 的手性產(chǎn)物（R）-1-苯基乙醇，酶法拆分有效提高了藥物的有效值。唐良華[86]研究凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）ZJU318 和擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）TS414來(lái)源脂肪酶催化拆分1 種常用的非甾體類(lèi)抗炎手性藥物布洛芬時(shí)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展青霉TS414 脂肪酶純酶具有更高的催化活性和布洛芬對(duì)映體選擇性（圖2）。與其它化學(xué)方法相比，微生物源酶催化的反應(yīng)具有條件溫和、操作簡(jiǎn)便、安全，同時(shí)不會(huì)造成環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。又如前體藥物中的酯類(lèi)前藥，在已上市的前藥中，大約一半是經(jīng)酯酶催化作用而產(chǎn)生活性。酯類(lèi)前藥常用來(lái)掩蔽水溶性藥物中的羧酸、磷酸等帶電荷基團(tuán)，從而增加原藥的脂溶性，提高它們的被動(dòng)膜滲透性[87]。根據(jù)藥物的水溶性不同，可以設(shè)計(jì)成不同的酯類(lèi)前體藥物，以適應(yīng)其在體內(nèi)發(fā)揮作用。

圖1 酯酶的功能和在發(fā)酵食品中的應(yīng)用Fig.1 The function of esterase and its application in fermented foods

圖2 酯酶在布洛芬【2-（-異丁基苯基）丙酸】對(duì)映體拆分中的應(yīng)用Fig.2 Application of esterase in the resolution of Ibuprofen [2-（-isobutylphenyl） propionic acid]

3.3 化工領(lǐng)域

酶法合成小分子脂肪酸酯因其高效無(wú)污染，專(zhuān)一性強(qiáng)，雜質(zhì)含量低，可適應(yīng)連續(xù)化生產(chǎn)及產(chǎn)品分子質(zhì)量易控制等優(yōu)點(diǎn)[88]，廣泛應(yīng)用于化工領(lǐng)域。如在精細(xì)化工中，可用酯直接作為表面活性劑，該做法可以提高效率，即增產(chǎn)，改進(jìn)技術(shù)和質(zhì)量；在精細(xì)化工中，酯類(lèi)還可用作涂料中揮發(fā)性油漆的真溶劑，常用的有小分子脂肪酸酯類(lèi)乙酸乙酯等；同時(shí)小分子脂肪酸酯還可應(yīng)用于香料工業(yè)，例如：C8～C12酸與乙醇在酶催化作用下酯化生成的酯類(lèi)，有玫瑰花香味，因此可用于玫瑰香精[89]；還可應(yīng)用于洗滌劑中，酯酶可以提高表面活性劑的釋放，堿性脂肪酶可提高去污能力，而洗滌劑中酯類(lèi)物質(zhì)的存在可使產(chǎn)品呈現(xiàn)多種愉悅的香氣[90]。

4 結(jié)論

近年來(lái)，許多研究從不同角度對(duì)發(fā)酵食品中微生物酯合成的過(guò)程進(jìn)行解析，微生物合成的小分子脂肪酸酯類(lèi)在食品、醫(yī)藥和日用化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。酯酶和脂肪酶等羧酸酯水解酶類(lèi)具有酯合成、內(nèi)酯合成、酯交換等多種催化特性，酶催化不需要輔因子，并具有反應(yīng)條件溫和，方法簡(jiǎn)便，催化活性高，底物選擇性強(qiáng)，產(chǎn)物易于分離等優(yōu)點(diǎn)，且催化產(chǎn)物與化學(xué)合成方法相比可被認(rèn)為是天然化合物，因而應(yīng)用日益廣泛。在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，微生物（細(xì)菌、酵母菌、霉菌）合成的小分子脂肪酸酯是影響食品感官和風(fēng)味的重要物質(zhì)。微生物酯酶還是一種重要的工業(yè)酶類(lèi)，雖然在產(chǎn)酶菌株的選育、培養(yǎng)條件、酶的性質(zhì)及工業(yè)應(yīng)用上已研究了幾十年，但由于酶的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的多樣性、酶的不穩(wěn)定性、底物的水不溶性、酶的表達(dá)和提純困難等問(wèn)題[90-91]，小分子脂肪酸酯的微生物合成仍有待研究和發(fā)展。隨著微生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展，新型微生物來(lái)源酯合成功能酶的種類(lèi)必將不斷豐富，結(jié)合更加有效和精準(zhǔn)的酶定向改造技術(shù)，有助于獲得底物專(zhuān)一性和鍵合專(zhuān)一性更強(qiáng)的酶，并推動(dòng)其應(yīng)用于特定種類(lèi)的酯的合成和水解，以及化合物的精準(zhǔn)高效手性拆分，產(chǎn)生重要的應(yīng)用價(jià)值。