釀酒酵母Y3401產(chǎn)乙醇條件優(yōu)化及其產(chǎn)香特性

劉朋肖，劉玉春，李晨語，李秀婷，成柳潔，朱宇婷，范光森*

（1 北京工商大學食品與健康學院 北京100048 2 北京工商大學 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心 北京100048 3 北京工商大學 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京100048 4 國家糧食和物資儲備局科學研究院 北京100037）

白酒是中國傳統(tǒng)蒸餾酒，以高粱、大米等谷物為主要原料，經(jīng)大曲、麩曲及酒母等特殊發(fā)酵劑固態(tài)發(fā)酵獲得[1]。釀酒酵母是白酒發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株，其對白酒的質(zhì)量、出酒率及降低成本有重要影響[2]。深入研究釀酒酵母產(chǎn)乙醇發(fā)酵條件，有助于提高白酒發(fā)酵速率，改善白酒風味及品質(zhì)。

目前，中國白酒大多數(shù)采用固態(tài)發(fā)酵工藝，與液態(tài)、半固態(tài)-液態(tài)發(fā)酵相比，難以實現(xiàn)機械化控制[3]。此外，勞動力成本增加，也給傳統(tǒng)固態(tài)釀造工藝發(fā)展帶來困難。而液態(tài)通氣式發(fā)酵在生產(chǎn)的安全性，以及擴大生產(chǎn)的便捷性方面都優(yōu)于固態(tài)厭氧發(fā)酵[4]。白酒釀造方式在可預(yù)見的將來一定會發(fā)生改變，而白酒釀造方式的改變勢必會引起釀造環(huán)境的變化，在這些變化中較為突出的便是釀造環(huán)境中含氧量的增加[5-7]。為滿足白酒釀造行業(yè)未來向半固態(tài)-液態(tài)發(fā)酵或液態(tài)有氧發(fā)酵等釀造方式轉(zhuǎn)變的需要，有必要研究釀酒酵母在有氧條件下產(chǎn)乙醇的情況[5]。此外，該研究也將助推白酒釀造方式的改變，提高白酒產(chǎn)量，縮短生產(chǎn)周期。本研究團隊在前期篩選獲得多株性能優(yōu)良的釀酒酵母菌株，其中釀酒酵母Y3401 在有氧條件下以高粱浸出液為培養(yǎng)基時，能高產(chǎn)乙醇，并且與異常威克漢姆酵母Y3604 共培養(yǎng)時，為后者產(chǎn)乙酸乙酯提供前體物質(zhì)——乙醇，表現(xiàn)出優(yōu)越的特性[8-9]。為此，本文以該酵母為出發(fā)菌株，采用Step-by-step單因素試驗及正交試驗優(yōu)化其在有氧條件下高產(chǎn)乙醇的發(fā)酵條件，并研究其在高粱浸出液培養(yǎng)基中的產(chǎn)香特性，探索其在液態(tài)發(fā)酵模式下釀造白酒的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）Y3401 為本實驗室自行篩選和保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）YPD 培養(yǎng)基 20 g/L 胰蛋白胨，20 g/L 葡萄糖，10 g/L 酵母浸粉，115 ℃滅菌20 min；

2）乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基 10 g/L 酵母浸粉，200 g/L 葡萄糖，20 g/L 蛋白胨，1 g/L KH2PO4，1 g/L（NH4）2SO4，1 g/L MgSO4，115 ℃滅菌20 min；

3）高粱浸出液培養(yǎng)基 參照文獻[10]配制。稱取250 g 高粱樣品粉碎至100 目以下，加入1 L去離子水混合；煮沸糊化，加入200 μL 耐高溫α-淀粉酶，90 ℃液化1 h；冷卻后加入0.125 g 糖化酶，60 ℃糖化2 h；冷卻至室溫，用4 層紗布過濾；將濾液10 000 r/min，離心10 min，取上清；調(diào)糖度至10 Brix，分裝于三角瓶中（30 mL/250 mL），115℃滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑及儀器 高粱，山東沂南；葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、瓊脂粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂等試劑為國產(chǎn)生物或分析純級試劑；二辛醇、乙醇，美國Sigma 公司。

高壓蒸汽滅菌器（YQX-SG46-280S），上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；生物潔凈工作臺（BCN-1360），北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LHS-100CL），上海一恒儀器設(shè)備有限公司；紫外-可見分光光度計（TU-19），北京普析通用儀器有限責任公司；離心機（Microfuge 2R），北京田林恒泰科技有限公司；高效液相色譜儀（1260series），Agilent 科技有限公司；三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀 （TSQTM8000 evo），美國Thermo Fisher Scientific。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵液pH 值和酵母生物量測定 利用pH計測定發(fā)酵液的pH 值，采用分光光度計在波長560 nm 處測定其吸光值，通過濁度法計酵母生物量。

1.2.2 葡萄糖和乙醇濃度測定 發(fā)酵液在室溫條件下10 000 r/min 離心10 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后采用HPLC 測定葡萄糖和乙醇濃度。具體測定方法參數(shù)：BioRad Aminex HPX-87H （300 mm×7.8 mm）；流動相0.01 mol/L H2SO4；流速0.6 mL/min；柱溫25 ℃，進樣量10 μL，使用外標法定量。

1.2.3 標準曲線的繪制 按照一定的濃度梯度配制不同濃度的乙醇和葡萄糖標品溶液，采用1.2.2節(jié)所述方法繪制標準曲線。

1.2.4 酵母Y3401 發(fā)酵產(chǎn)乙醇條件優(yōu)化

1.2.4.1 葡萄糖初始濃度 將釀酒酵母Y3401 接種于YPD 中，活化培養(yǎng)24 h。取100 μL 種子液接種于不同葡萄糖初始質(zhì)量濃度（100，150，200，250，300，350，400 g/L） 的乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃，120 r/min 培養(yǎng)24 h。按照1.2.2 節(jié)所述方法測定產(chǎn)乙醇濃度。

1.2.4.2 氮源種類 將活化釀酒酵母Y3401 接種于以不同氮源（初始復(fù)配氮源、酵母浸粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨和硫酸銨）配制的乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其它條件選擇1.2.4.1 節(jié)篩選的最優(yōu)條件。

1.2.4.3 氮源濃度 菌體活化階段方法如1.2.4.1節(jié)所述，在不同氮源的質(zhì)量濃度（原始質(zhì)量濃度，20，30，40，50，60，70，80 g/L）乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其它條件選擇1.2.4.2 節(jié)篩選的最優(yōu)條件。

1.2.4.4 發(fā)酵溫度 菌體活化階段方法如1.2.4.1節(jié)所述，在不同溫度（22，24，26，28，30，32，34，36，38，40 ℃）條件下發(fā)酵，其它條件選擇1.2.4.3 節(jié)篩選的最優(yōu)條件。

1.2.4.5 培養(yǎng)基初始pH 值 菌體活化階段方法如1.2.4.1 節(jié)所述，按照上述最優(yōu)培養(yǎng)基配方配制乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基，分別調(diào)節(jié)初始pH 值為 （原始pH，2，3，4，5，6，7，8，9，10），其它條件選擇1.2.4.4節(jié)篩選的最優(yōu)條件。

1.2.4.6 轉(zhuǎn)速 菌體活化階段方法如1.2.4.1 節(jié)所述，在發(fā)酵階段，于不同轉(zhuǎn)速（0，40，60，80，100，120，140，160，180，200 r/min）條件下培養(yǎng)，其它條件選擇1.2.4.5 節(jié)篩選的最優(yōu)條件。

1.2.4.7 裝液量 菌體活化階段方法如1.2.4.1 節(jié)所述，按照上述優(yōu)化好的條件配制乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基，按不同的裝液量（15，30，60，90，120，150，180，210 mL/250 mL）進行分裝，其它條件選擇1.2.4.6節(jié)篩選的最優(yōu)條件。

1.2.4.8 種齡 采用不同活化時間（0，6，12，18，24，30，36 h）的菌體進行接種，探究菌齡對乙醇產(chǎn)量的影響，其它條件使用上述最優(yōu)條件，分別按照1.2.1 和1.2.2 節(jié)所述方法測定酵母生物量和乙醇濃度。

1.2.4.9 接種量 菌體活化階段方法如1.2.4.1 節(jié)所述，按照上述優(yōu)化好的條件配制乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基，分別按照不同的接種量（0.05%，0.1%，0.3%，0.5%，1%，3%，5%，10%，15%）接種，其它條件選擇1.2.4.8 節(jié)篩選的最優(yōu)條件。

1.2.4.10 發(fā)酵時間 其它條件采用上述最優(yōu)結(jié)果，分別在搖動（0，8，16，24，32，40，48，56 h）和靜置（0，8，16，24，32，40，48，56，64，72，80，88，96，104，112，128，136，144 h）2 種培養(yǎng)方式下探究發(fā)酵時間對其產(chǎn)乙醇的影響；按照1.2.1 和1.2.2 節(jié)所述方法測定發(fā)酵液pH 值、酵母生物量、乙醇濃度和葡萄糖殘留量。

1.2.5 正交試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對數(shù)據(jù)進行顯著性分析后，選擇發(fā)酵溫度、初始pH值、轉(zhuǎn)速和接種量4 個因素進行L9（34）正交試驗，以確定酵母Y3401 發(fā)酵產(chǎn)乙醇的最佳工藝條件。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Level of factors selected for orthogonal experiment

1.2.6 酵母產(chǎn)香試驗 將在YPD 活化菌株以3%的接種量接種于高粱浸出液培養(yǎng)基中，在30 ℃，100 r/min 條件下培養(yǎng)32 h。發(fā)酵液于4 ℃，10 000 r/min 離心10 min，取上清液，采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用儀（SPME-GC-MS）檢測該酵母所產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)香氣成分。

1.2.7 頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用測定揮發(fā)性成分 參照范光森等[11]的方法。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 每組試驗做3 個平行，采用SPSS 21.0 對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢驗分析；利用Excel 2016 和Origin 9.1 繪圖軟件處理試驗數(shù)據(jù)并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母Y3401 發(fā)酵產(chǎn)乙醇條件單因素優(yōu)化

2.1.1 葡萄糖初始質(zhì)量濃度 由圖1可見，酵母Y3401 所產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度隨著葡萄糖初始質(zhì)量濃度的增加，呈先增加后下降的趨勢，當葡萄糖初始質(zhì)量濃度為300 g/L 時，乙醇質(zhì)量濃度達到最大值，為85.7 g/L，相比初始發(fā)酵培養(yǎng)基（52.4 g/L）提高了63.5%。葡萄糖是酵母轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇的原料，故在合適的初始濃度下有利于酵母產(chǎn)乙醇。葡萄糖濃度較低時，不足以滿足酵母生長繁殖和代謝轉(zhuǎn)化為乙醇的需求，從而導致其產(chǎn)乙醇能力受限，乙醇積累不夠；當葡萄糖濃度較高時，則又因高濃度葡萄糖形成的高滲透壓，抑制了酵母的正常生長和代謝過程中的酶活力，最終導致其產(chǎn)乙醇能力降低[5，12]。不同酵母菌株因?qū)ζ咸烟悄褪苄杂兴町?，因此不同菌株利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇的初始濃度也有所不同。如前期，本課題組篩選獲得的另1 株高產(chǎn)乙醇釀酒酵母YF1914，在葡萄糖初始質(zhì)量濃度為350 g/L 時產(chǎn)量最高，明顯高于本研究的葡萄糖初始質(zhì)量濃度[5]；而曹宇龍等[13]和伍保龍等[14]所用釀酒酵母其產(chǎn)乙醇最佳葡萄糖初始質(zhì)量濃度與本文研究相近，分別為286.5 g/L 和320 g/L。

2.1.2 氮源種類 在促進Y3401 發(fā)酵產(chǎn)乙醇方面，有機氮源明顯優(yōu)于無機氮源（圖2），并且在相同有效氮源質(zhì)量濃度（3.4 g/L）下，以酵母浸粉為單一氮源時乙醇產(chǎn)量最高，達到88.5 g/L，并且稍高于初始復(fù)合氮源（酵母浸粉和蛋白胨）條件下乙醇的產(chǎn)量（圖2）。這與酵母YF1914 產(chǎn)乙醇的最佳氮源一致[5]。酵母浸粉是營養(yǎng)豐富的有機氮源，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、核酸、維生素和微量元素等，能有效促進酵母的生長、繁殖及活躍酵母代謝，尤其是與乙醇轉(zhuǎn)化和合成相關(guān)的基因和酶[15]。

2.1.3 氮源質(zhì)量濃度 酵母浸粉質(zhì)量濃度對酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇具有一定的影響，隨其質(zhì)量濃度的增加，酵母Y3401 所產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度先增加后減少（圖3）。當酵母浸粉的質(zhì)量濃度為原乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基的有效氮對應(yīng)濃度時，即41.6 g/L，乙醇產(chǎn)量最高，為90.7 g/L。氮源濃度的高低會引起酵母生長過于旺盛或不足，從而導致酵母過早衰亡或生長不足，最終影響其產(chǎn)乙醇能力[15-16]。

2.1.4 溫度 考慮到酵母菌的生長溫度范圍，本研究選擇22～40 ℃，探究溫度對酵母菌Y3401 發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響。結(jié)果表明，酵母Y3401 在30 ℃發(fā)酵時，乙醇產(chǎn)量最高為88.7 g/L（圖4），這與釀酒酵母YF1914 發(fā)酵產(chǎn)乙醇的溫度一致[5]。溫度不僅影響微生物的生長，而且也會影響其代謝活動，改變代謝產(chǎn)物合成量。綜合考慮釀酒酵母生長溫度及發(fā)酵產(chǎn)乙醇的試驗結(jié)果，后續(xù)試驗依舊選擇在30 ℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

圖1 葡萄糖初始質(zhì)量濃度對酵母Y3401 發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.1 Effect of glucose mass concentration on ethanol production from yeast strain Y3401

圖2 氮源種類對酵母Y3401 發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on ethanol production from yeast strain Y3401

圖3 酵母浸粉質(zhì)量濃度對酵母Y3401 發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.3 Effect of mass concentration of yeast extract on ethanol production from yeast strain Y3401

圖4 溫度對酵母Y3401 發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.4 Effect of temperature on ethanol production from yeast strain Y3401

2.1.5 pH 值對酵母Y3401 產(chǎn)乙醇的影響 生長環(huán)境的pH 值會引起酵母細胞膜的通透性及培養(yǎng)基成分的離子狀態(tài)變化，進而影響酵母的生長和調(diào)控代謝通路。優(yōu)化酵母Y3401 發(fā)酵產(chǎn)乙醇的培養(yǎng)基初始pH 值發(fā)現(xiàn)，隨著初始pH 值的升高，酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力先上升后緩慢下降（圖5）。值得注意的是，當初始pH 值在較寬的pH 值范圍（4～9）時，酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇含量都相對較高（圖5）。白酒釀造過程中pH 值會因各種微生物的代謝活動發(fā)生較大變化，而酵母Y3401 長期處在白酒釀造環(huán)境中，已經(jīng)適應(yīng)了白酒釀造過程中pH值的變化，因此能夠在較寬的pH 值范圍內(nèi)生長和發(fā)酵產(chǎn)乙醇。由圖5可見，酵母Y3401 在pH 5.2（自然pH 值）時，發(fā)酵所產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度達到最高，為89.4 g/L。為保證后續(xù)試驗的準確性和一致性，接下來發(fā)酵所用培養(yǎng)基的pH 值統(tǒng)一調(diào)整為5.2 進行研究。

圖5 pH 值對酵母Y3401 發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.5 Effect of pH value on ethanol production from yeast strain Y3401

2.1.6 轉(zhuǎn)速和裝液量對酵母Y3401 產(chǎn)乙醇的影響酵母一般屬于兼性厭氧菌，在有氧條件下生長較好，然而從產(chǎn)乙醇角度來講，有氧條件不利于其進行無氧呼吸發(fā)酵產(chǎn)乙醇。其實，在一定氧氣含量條件下，因有利于前期酵母細胞的積累，從而對發(fā)酵產(chǎn)乙醇有積極作用，隨著細胞數(shù)量的增加，雖然提供氧氣的條件未發(fā)生變化，但因大量的細胞耗氧量增加，從而為后期無氧呼吸產(chǎn)乙醇創(chuàng)造條件。由圖6可以看出，酵母Y3401 不僅在靜置培養(yǎng)方式下發(fā)酵產(chǎn)乙醇，在搖動培養(yǎng)條件下也能高產(chǎn)乙醇，并且在培養(yǎng)24 h 時，即使高轉(zhuǎn)速搖動發(fā)酵所產(chǎn)乙醇含量也高于靜置，這可能是高濃度菌密度的優(yōu)勢?？傮w來看，酵母Y3401 隨發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的提高，發(fā)酵產(chǎn)乙醇濃度先增加后緩慢下降，在轉(zhuǎn)速達到100 r/min 時，乙醇產(chǎn)量為93.8 g/L，略高于其它培養(yǎng)條件（圖6），因此選擇100 r/min 作為后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)乙醇的轉(zhuǎn)速。通過裝液量試驗結(jié)果也能得出相同的結(jié)論，通過調(diào)整裝液量可以調(diào)控發(fā)酵環(huán)境中的含氧量，從而影響酵母發(fā)酵乙醇的能力（圖7）。在150 mL/250 mL 以下時，發(fā)酵產(chǎn)乙醇效果較好，其中，在裝液量為30 mL/250 mL 時，乙醇質(zhì)量濃度達到95.5 g/L（圖7），因此后續(xù)以此裝液量進行其它條件的考察。綜上可見，適當?shù)娜苎趿坑欣诎l(fā)酵前期酵母的生長繁殖，保障其發(fā)酵產(chǎn)乙醇應(yīng)有的細胞數(shù)量基礎(chǔ)，而后期因細胞數(shù)量多而消耗更多的氧氣，從而為自身發(fā)酵創(chuàng)造了一個厭氧環(huán)境，保證后期通過無氧呼吸發(fā)酵產(chǎn)乙醇。通過該研究結(jié)果，后期可以通過分階段進行發(fā)酵產(chǎn)乙醇，即前階段通過通氣式進行細胞積累，后期無氧發(fā)酵進行乙醇積累。

圖6 轉(zhuǎn)速對酵母Y3401 發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.6 Effect of agitation speed on ethanol production from yeast strain Y3401

2.1.7 種齡對酵母Y3401 產(chǎn)乙醇的影響 不同種齡的酵母菌對外界環(huán)境適應(yīng)能力不同，在對數(shù)期，菌體的生命活動旺盛，常被用作種子液，可有效縮短發(fā)酵適應(yīng)期[17]。圖8為不同種齡酵母培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)乙醇情況，結(jié)果表明，當接入不同種齡酵母時，乙醇質(zhì)量濃度會有差異：種齡0～12 h 的種子液發(fā)酵產(chǎn)乙醇量處于較低水平（圖8），可能是因為酵母生長處于延緩期以及對數(shù)前期，此時細胞數(shù)量少，且正處于適應(yīng)環(huán)境的狀態(tài)；種齡18～36 h的種子液發(fā)酵所產(chǎn)乙醇含量較高，這不僅是由于細胞數(shù)量多，而且也因為此時的細胞已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境（圖8）。考慮到經(jīng)濟效率，酵母Y3401 以活化18 h 為宜，乙醇產(chǎn)量達到105.1 g/L（圖8），這與絕大多數(shù)酵母接種時對菌體菌齡的要求基本一致，處于對數(shù)中后期[5]。

圖7 裝液量對酵母Y3401 發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.7 Effect of liquid medium volume on ethanol production from yeast strain Y3401

2.1.8 接種量對酵母Y3401 產(chǎn)乙醇的影響 接種量會影響發(fā)酵進程，尤其對延緩期的長短有重要影響。通過研究接種量對酵母Y3401 產(chǎn)乙醇的影響發(fā)現(xiàn)，接種量在0.05%～10%范圍時，酵母產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度隨著接種量的增加而增加；當接種量高于10%時，其發(fā)酵產(chǎn)乙醇量降低（圖9）。接種量低時，延緩期相對較長，在培養(yǎng)24 h 時，因細胞數(shù)量相比適宜的接種量（對于該酵母為3%～10%）條件下偏低，從而導致乙醇產(chǎn)量低；而接種量較高時，則可能因營養(yǎng)物質(zhì)多用于酵母生長繁殖，從而導致乙醇產(chǎn)量下降。在適宜接種量范圍內(nèi)，偏高的接種量有利于快速達到高濃度的生物量，從而創(chuàng)造一個適度缺氧環(huán)境，有助于提高乙醇的產(chǎn)量，并且還可抑制其它細菌的生長和代謝，降低其它雜菌的污染[18]。本研究結(jié)果顯示，接種量為5%時，乙醇產(chǎn)量為105.6 g/L，在后續(xù)研究中，以此最優(yōu)接種量進行試驗。

圖8 種齡對酵母Y3401 發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.8 Effect of inoculum age on ethanol production from yeast strain Y3401

2.1.9 酵母Y3401 產(chǎn)乙醇發(fā)酵歷程 由于酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇主要通過無氧呼吸，而本研究通過前期優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，該酵母在培養(yǎng)24 h 時，有一定氧氣量存在反而優(yōu)于缺氧的情況，這可能是由于有氧條件下酵母細胞量高于缺氧條件。為驗證此結(jié)果，特對這2 種條件下產(chǎn)乙醇的發(fā)酵歷程進行研究。

圖10是酵母Y3401 在靜置培養(yǎng)方式下其產(chǎn)乙醇情況，結(jié)果表明，在該培養(yǎng)方式下，酵母Y3401 發(fā)酵產(chǎn)乙醇量隨著發(fā)酵時間的延長而不斷增加，然而增加緩慢，培養(yǎng)104 h 其產(chǎn)乙醇量最高，為83.9 g/L。而在搖動培養(yǎng)方式下，發(fā)酵前期處于生長延緩期，酵母細胞量低，乙醇產(chǎn)量不高，隨著酵母生長處于對數(shù)期，細胞數(shù)量大量增加，其乙醇產(chǎn)量也大幅增加，在培養(yǎng)32 h 乙醇質(zhì)量濃度達到107.8 g/L（圖10）。另外，無論是靜置方式培養(yǎng)還是搖動方式培養(yǎng)，酵母Y3401 產(chǎn)乙醇能力都與細胞量呈正相關(guān)，兩種培養(yǎng)方式下都是細胞量達到最高時，其產(chǎn)乙醇量達到最高，屬于產(chǎn)物形成與細胞生長相關(guān)型。由于有氧條件下，有利于酵母細胞數(shù)量的大量增殖，因此，搖動培養(yǎng)方式不僅所產(chǎn)乙醇量高于靜置培養(yǎng)方式，同時也快于靜置培養(yǎng)方式，可以縮短發(fā)酵周期，該結(jié)果與之前研究報道一致，也較為充分的證實了之前的推測[5，19]。值得留意的是，相比兩種培養(yǎng)方式，靜置培養(yǎng)方式下單位數(shù)量的細胞所產(chǎn)乙醇量高于搖動培養(yǎng)方式，這也充分表明，釀酒酵母是通過無氧呼吸途徑生產(chǎn)乙醇。

圖9 接種量對酵母Y3401 發(fā)酵合成乙醇的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on ethanol production from yeast strain Y3401

對搖動培養(yǎng)方式下葡萄糖含量和pH 值變化進行分析，結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度隨著培養(yǎng)時間的延長而迅速下降，在32 h 后幾乎耗盡 （圖11），同該菌的生長趨勢一致；pH 值則隨著時間的延長先快速降低后稍有升高，這與培養(yǎng)基中葡萄糖含量變化相關(guān)。培養(yǎng)前期酵母Y3401 利用充足的葡萄糖進行生長和代謝，產(chǎn)生大量酸類物質(zhì)，使培養(yǎng)基pH 值快速下降；后期則因葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，酵母缺乏生長和代謝所需營養(yǎng)物質(zhì)，而開始衰亡、細胞破裂，促使pH 值稍有升高。綜上可見，在有氧條件下，釀酒酵母生物量、乙醇產(chǎn)量和培養(yǎng)基pH 值都與培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量濃度有著密切的聯(lián)系，這與前期研究結(jié)果一致[5]。

圖10 酵母Y3401 發(fā)酵合成乙醇歷程Fig.10 Time course of ethanol production by yeast strain Y3401

2.2 正交試驗及驗證

由表2極差R 分析D＞C=B＞A 可知，接種量對酵母Y3401 產(chǎn)乙醇效果影響最大，其次為轉(zhuǎn)速和初始pH 值，溫度對發(fā)酵效果的影響最小。由K值結(jié)果分析可知，酵母Y3401 發(fā)酵產(chǎn)乙醇的最優(yōu)工藝組合為A2B2C2D1，即溫度30 ℃，初始pH 5.2，轉(zhuǎn)速100 r/min，接種量3%（表2）。4 個因素對酵母Y3401 產(chǎn)乙醇影響見圖12。由圖12可知，乙醇產(chǎn)量隨著發(fā)酵溫度、初始pH 值和轉(zhuǎn)速的升高均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，因此，試驗水平應(yīng)選擇發(fā)酵溫度30 ℃，初始pH 值為5.2，轉(zhuǎn)速100 r/min，即A2B2C2；而其產(chǎn)乙醇量則隨著接種量的增加呈現(xiàn)下降趨勢，因此試驗水平應(yīng)選擇接種量為3%，即D1。按最優(yōu)組合進行驗證試驗，酵母Y3401 在初始pH 5.2，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，接種量3%的條件下發(fā)酵，產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度為117.2 g/L，這與酵母YF1914 發(fā)酵產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度相似[5]。

圖11 酵母Y3401 搖動發(fā)酵過程葡萄糖質(zhì)量濃度和pH 值的變化情況Fig.11 Glucose mass concentration and pH value changes during the fermentation of yeast strain Y3401

表2 正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

圖12 酵母Y3401 發(fā)酵產(chǎn)乙醇與因素水平趨勢圖Fig.12 Tendency of ethanol production by yeast strain Y3401 and factors level

2.3 酵母Y3401 液體發(fā)酵產(chǎn)香特性

酵母Y3401 接種于高粱浸出液培養(yǎng)基中，20℃，100 r/min 培養(yǎng)32 h，發(fā)酵液上清通過SPMEGC-MS 方法檢測揮發(fā)性香氣成分。結(jié)果顯示，酵母菌Y3401 能夠產(chǎn)生40 種揮發(fā)性成分，其中醇類11 種，酯類13 種，酸類3 種，醛類2 種，呋喃1種，酮類3 種，酚類4 種，烷烴類3 種（表3）。酵母Y3401 所產(chǎn)的這些風味物質(zhì)有助于豐富白酒風味物質(zhì)，提高白酒質(zhì)量。

由表3可見，酵母Y3401 能產(chǎn)生少量異丁醇、正戊醇、異戊醇和糠醇等高級醇，這些高級醇在合理濃度范圍內(nèi)有助于白酒的醇甜，同時也是白酒中重要的助香劑和關(guān)鍵風味物質(zhì)（如乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、乙酸糠酯等）的前驅(qū)物質(zhì)[5，20-21]。酵母Y3401 發(fā)酵所產(chǎn)的2，3-丁二醇是白酒甜感的重要風味物質(zhì)，能夠增強白酒的甜味[22]；該酵母發(fā)酵高粱浸出液還能產(chǎn)生多種保健功效的醇類風味物質(zhì)，如具有木香味的芳樟醇，花香的α-松油醇，檸檬香的香葉醇，兼具玫瑰和蘋果香的反式-橙花叔醇，以及甜香的3，7，11-三甲基-2，6，10-十二烷三烯-1-醇[23-27]。值得關(guān)注的是，該酵母具有突出的產(chǎn)玫瑰香味的苯乙醇能力，已有文獻報道，部分釀酒酵母具有高產(chǎn)苯乙醇能力[28-29]。

表3 酵母Y3401 發(fā)酵液中揮發(fā)性成分檢測Table 3 Detection of volatile components of yeast strains Y3401 in the fermentation

酯類化合物對白酒的主體香型及風格等感官特征有著非常重要的影響[8，30]。酵母Y3401 不僅能夠產(chǎn)生較多種類的酯類化合物，而且還具有突出的乙酸乙酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的能力，這可能與其具有突出的產(chǎn)相應(yīng)醇類化合物有關(guān)。乙酸乙酯具有香蕉或蘋果香，是清香型、老白干香型和米香型等白酒中的主要特征香味[8-9]；乙酸異戊酯具有強烈的水果香氣，且?guī)в欣娴奶鹚嵛?，是酒飲料中重要的酯類化合物，促進酒飲料具有香氣幽雅的特性[31-32]；乙酸苯乙酯具有舒適的花香，能賦予酒飲料愉悅的風味特征[33]。由此可見，酵母Y3401 在一定程度上能夠有效提高白酒香味，提升其品質(zhì)。

除此之外，酵母Y3401 還能夠產(chǎn)生具有典型水果香氣的苯甲醛、油酯香味的3-羥基-2-丁酮、優(yōu)雅奶酪氣息的大馬士酮和熏制食品香的愈創(chuàng)木酚等多種風味物質(zhì)，對于酒飲料的風味具有突出的貢獻[34-38]。綜上可見，釀酒酵母Y3401 不僅能夠在有氧條件下高產(chǎn)乙醇，而且還具有突出的產(chǎn)香特性，在白酒釀造中具有重要的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)研究了釀酒酵母Y3401 產(chǎn)乙醇發(fā)酵條件優(yōu)化及其產(chǎn)香特性，為其在白酒釀造中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。本文采用Step-by-step 單因素試驗及正交試驗優(yōu)化確定了該酵母產(chǎn)乙醇的最佳條件：葡萄糖300 g/L，酵母浸粉37.8 g/L，初始pH 5.2，接種量3%，裝液量30 mL/250 mL，在30 ℃，100 r/min 條件下培養(yǎng)32 h，最終產(chǎn)乙醇質(zhì)量濃度高達117.2 g/L，與初期菌株的產(chǎn)乙醇量52.4 g/L相比，提高了1.24 倍。該釀酒酵母能夠產(chǎn)生苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、苯甲醛、大馬士酮和愈創(chuàng)木酚等多種風味物質(zhì)。可見，在白酒釀造中，該酵母不僅具有提高白酒產(chǎn)率的潛力，而且還具有增強白酒的風味和提升白酒品質(zhì)的能力。