基于微流變技術(shù)研究不同嗜熱鏈球菌對(duì)發(fā)酵乳凝膠化的影響

王月嬌，郭 帥，韓之皓，黃 天，孫浩天，劉凱龍，王記成，孫天松，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特010018）

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品中，常與德氏乳桿菌保加利亞亞種 （Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）一起作為發(fā)酵劑菌株。嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸可促進(jìn)乳制品發(fā)酵，縮短發(fā)酵周期，改善乳制品風(fēng)味。發(fā)酵過程中產(chǎn)生胞外多糖使發(fā)酵乳形成黏稠的質(zhì)地，提高其穩(wěn)定性。嗜熱鏈球菌還具有良好的益生特性，如抗氧化能力，調(diào)節(jié)腸道菌群等[1-2]。

微流變學(xué)是通過研究嵌入樣品中微小粒子的布朗運(yùn)動(dòng)，分析流體在微米尺度的黏彈性和動(dòng)力學(xué)特性，測(cè)量流體中顆粒因熱能產(chǎn)生的位移，從而得到黏性性能。微流變?cè)硎抢寐洳ü庾V法（Diffusing wave spectroscopy，DWS）[3-4]測(cè)定樣品中顆粒大小及樣品的微流變性質(zhì)，也可用于研究食品凝膠過程，并測(cè)定凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的黏彈性[5]。例如：He 等[6]利用微流變技術(shù)研究淀粉對(duì)酸奶凝膠化過程的影響，結(jié)果表明淀粉可以增加酸奶的黏度，改善酸奶品質(zhì)。

相比傳統(tǒng)流變學(xué)，微流變學(xué)在靜止?fàn)顟B(tài)下分析軟物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)，不會(huì)施加外力破壞樣品凝膠結(jié)構(gòu)，也不會(huì)影響樣品原有狀態(tài)[4]。本試驗(yàn)以不同嗜熱鏈球菌復(fù)配保加利亞乳桿菌為發(fā)酵菌株，通過分析其發(fā)酵特性、貯藏特性和微流變學(xué)特性，篩選發(fā)酵性能較好的嗜熱鏈球菌，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗(yàn)所用的3 株嗜熱鏈球菌和1 株保利加亞乳桿菌由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，菌株來源詳細(xì)信息見表1。試驗(yàn)所用純牛奶為市售產(chǎn)品。MRS 液體培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；MRS 固體培養(yǎng)基，賽默飛世爾科技（北京）有限公司；ST 固體培養(yǎng)基，北京鼎持生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋、生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；高壓均質(zhì)機(jī)，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；光學(xué)法微流變分析儀，法國(guó)Formulaction 儀器公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌株活化

將真空冷凍干燥保存的嗜熱鏈球菌分別接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，按2%的接種量接入MRS 液體培養(yǎng)基中，活化至3 代，使菌株活力達(dá)到最大，采用平板計(jì)數(shù)法確定活菌數(shù)，用0.85%的生理鹽水重懸3 次得到菌懸液。

表1 菌株來源詳細(xì)信息Table 1 Strain source details

2.1.1 發(fā)酵乳的制備 將鮮牛奶（94%）加熱至60℃，加入蔗糖（6%），攪拌均勻至全部溶解，然后于65 ℃，20 MPa 條件下均質(zhì)，在95 ℃，5 min 進(jìn)行巴氏殺菌，冷卻至（37±0.5）℃，接種發(fā)酵劑。嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌按接種活菌數(shù)比例為1 000∶1 添加，其中嗜熱鏈球菌接種量為2×106CFU/mL，發(fā)酵至pH 值接近4.50，轉(zhuǎn)置4 ℃冰箱后熟。發(fā)酵過程中每隔2 h 取樣檢測(cè)，貯藏期間每隔7 d 取樣檢測(cè)。

2.1.2 pH 值的測(cè)定 采用雷磁pH SJ-3F 型pH計(jì)直接測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。

2.1.3 滴定酸度的測(cè)定[7]利用電子天平稱取發(fā)酵乳樣品10.0 g 于250 mL 三角瓶中，加入20 mL去CO2的蒸餾水，加入2 mL 0.5%的酚酞指示劑，充分搖勻后，用0.1 mol/L 的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色，且5 s 內(nèi)不消失為止。記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL），每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。

2.1.4 活菌數(shù)的測(cè)定 用移液槍吸取0.5 mL 發(fā)酵乳樣品于4.5 mL 已滅菌的0.85%生理鹽水中，搖勻后依次進(jìn)行10 倍梯度稀釋，采用MRS 固體培養(yǎng)基平板傾注法，37 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h，計(jì)算菌落總數(shù)。

2.1.5 黏度的測(cè)定 將裝有40 mL 發(fā)酵乳樣品至于室溫 （25 ℃） 下，采用Brookfield DV-1 VISCOMETER 型粘度儀進(jìn)行3 次平行樣測(cè)定，測(cè)定條件：選取4# 轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速100 r/min，扭矩10%～100%，測(cè)定時(shí)間30 s。

2.1.6 流變特性的測(cè)定 將20 mL 牛乳倒入特制的平底圓柱形帶塞玻璃瓶中（內(nèi)徑27.5 mm），迅速轉(zhuǎn)移至測(cè)定槽中，將流變儀主裝置設(shè)置為37 ℃，每隔1 min 采集1 次數(shù)據(jù)，待發(fā)酵乳的pH 值接近4.50 后，立即取出玻璃瓶并放入4 ℃冷藏24 h，然后再將樣品恢復(fù)到室溫（25 ℃），攪拌后放入測(cè)定槽中繼續(xù)采集數(shù)據(jù)[6]。

2.1.7 數(shù)據(jù)分析與處理 微流變數(shù)據(jù)使用Rheolaser Master 型光學(xué)法微流變分析儀中自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；各指標(biāo)測(cè)定3 個(gè)平行值，利用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)（Independent-samples T-test）對(duì)3 組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，顯著性水平設(shè)定為0.05；所有圖表采用Orginla lab 2017 軟件繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 發(fā)酵乳在發(fā)酵過程及貯藏期間酸度的變化

菌株的產(chǎn)酸能力是篩選發(fā)酵劑的重要指標(biāo)，產(chǎn)酸速率可以直接影響發(fā)酵乳的發(fā)酵時(shí)間、生產(chǎn)效率及風(fēng)味[8]。3 株嗜熱鏈球菌在37 ℃下恒溫發(fā)酵牛乳樣品，在發(fā)酵過程中及貯藏期間pH 值及滴定酸度變化如圖1所示。在0～4 h，由于菌株處于延滯期，活力較低，生長(zhǎng)速率慢，3 組樣品的pH 值和滴定酸度無明顯差異；發(fā)酵至4 h 時(shí)，菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)速率提高，GW21-4 組樣品較其它2 組的pH 值變化明顯，pH 值由6.51 下降至5.49，滴定酸度從15.12°T 上升至38.23°T；發(fā)酵至8 h 時(shí)，GW21-4 組樣品到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)，pH 值為4.51，滴定酸度為85.3°T；XJ57-3 和ND03 組樣品在9 h 到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)，pH 值分別為4.47，4.52，滴定酸度分別為80.2，72.12 °T。3 組樣品相比，GW21-4 組樣品的發(fā)酵時(shí)間最短，產(chǎn)酸速率最快。

貯藏期間酸度變化是衡量發(fā)酵乳品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，樣品酸度在70～110°T 之間口感較好，高于120°T 時(shí)則無法被消費(fèi)者接受[9-10]。由于菌株產(chǎn)酸能力不同，樣品在貯藏期間后酸化程度也有差異，菌株GW21-4 具有弱后酸化能力，pH 值僅降低0.26，滴定酸度增加20.12°T。低溫條件下雖抑制乳酸菌活性，但仍有部分乳酸菌在β-半乳糖苷酶和其它酶的催化作用下繼續(xù)產(chǎn)酸，使發(fā)酵乳酸度升高[10]。

圖1 發(fā)酵過程及貯藏期間pH 值及滴定酸度變化Fig.1 Changes of pH value and titration acidity of different S.thermophilus during fermentation and storage period

3.2 發(fā)酵乳在發(fā)酵過程及貯藏期間活菌數(shù)的變化

乳酸菌活菌數(shù)可以直接影響發(fā)酵乳的品質(zhì)、特性及口感[11]。3 株嗜熱鏈球菌發(fā)酵乳活菌數(shù)變化情況如圖2所示，3 組發(fā)酵乳樣品在發(fā)酵過程中，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，活菌數(shù)不斷增加，到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，菌株XJ57-3 活菌數(shù)達(dá)到1.73×108CFU/mL，明顯高于其它菌株。貯藏期間發(fā)酵乳活菌數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，發(fā)酵乳酸度升高抑制乳酸菌生長(zhǎng)，使乳酸菌總數(shù)減少；在貯藏結(jié)束后，3 組樣品活菌數(shù)差異不顯著（P＞0.05）。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302-2010 規(guī)定[12]，發(fā)酵乳中乳酸菌活菌數(shù)應(yīng)在106CFU/mL 以上，由圖可知，所有試驗(yàn)菌株在發(fā)酵過程及貯藏期間活菌數(shù)均維持在106CFU/mL 以上，說明本試驗(yàn)所用發(fā)酵劑菌株在發(fā)酵乳中具有較好活力，可用于發(fā)酵乳的生產(chǎn)。

3.3 發(fā)酵乳在發(fā)酵過程及貯藏期間黏度的變化

黏度可以影響酸奶的組織狀態(tài)和口感，有文獻(xiàn)證明發(fā)酵乳黏度與胞外多糖含量有關(guān)[13]。添加不同嗜熱鏈球菌制備發(fā)酵乳，發(fā)酵過程及貯藏期間黏度變化如圖3所示。發(fā)酵過程中，由于酸度下降導(dǎo)致發(fā)酵乳中酪蛋白凝固以及菌株代謝分泌大量高分子化合物胞外多糖（EPS）導(dǎo)致樣品黏度增加[14]；GW21-4 組樣品于6 h 時(shí)凝乳，其余2 組在發(fā)酵8 h 時(shí)凝乳；發(fā)酵結(jié)束時(shí)，3 組樣品黏度無存在顯著差異（P＞0.05）。發(fā)酵乳樣品在4 ℃條件下貯藏28 d，黏度呈先增加后降低的變化趨勢(shì)；貯藏初期，在加工過程中破壞的凝乳微粒重新結(jié)合到凝乳微粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，從而增大發(fā)酵乳的黏度；貯藏過程中由于少數(shù)乳酸菌在低溫條件下繼續(xù)產(chǎn)酸，破壞酸奶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致貯藏后期發(fā)酵乳黏度下降[15]；3 組樣品經(jīng)4 ℃后熟，黏度達(dá)到最大值，其中GW21-4 組與XJ57-3 組和ND03 組黏度存在顯著差異（P＜0.05）。貯藏28 d 時(shí)，GW21-4 組樣品黏度最大。

3.4 發(fā)酵乳發(fā)酵過程微流變檢測(cè)結(jié)果

發(fā)酵乳的凝膠結(jié)構(gòu)主要是在發(fā)酵過程中，由于乳酸菌不斷產(chǎn)酸，使pH 值降低至酪蛋白等電點(diǎn)而形成的，而凝膠結(jié)構(gòu)也會(huì)受酸度和溫度的影響，酸度升高不僅作用于表面，還影響膠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)。牛乳的pH 值約為6.7 左右，酪蛋白以酪蛋白-磷酸鈣復(fù)合體形式存在[16]；當(dāng)發(fā)酵開始時(shí)，pH 值逐漸下降，膠體磷酸鈣溶解，酪蛋白膠束開始解離[17]；pH 值下降至5.2 左右時(shí)，解離后的單體酪蛋白相互結(jié)合形成松散的、無定形結(jié)構(gòu)的聚集體，此時(shí)發(fā)酵乳形成一定的凝膠結(jié)構(gòu)，稱為凝膠點(diǎn)[14]；pH值到達(dá)酪蛋白等電點(diǎn)時(shí)，發(fā)酵乳的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成。乳的酸致凝膠形成是一個(gè)多級(jí)過程，包括低黏度的初始停滯階段、黏度的快速變化階段和高黏度階段[18]。

圖2 發(fā)酵過程及貯藏期間活菌數(shù)變化Fig.2 Changes of viable bacterial counts of different S.thermophilus during fermented and storage period

微流變儀通過檢測(cè)激光信號(hào)變化計(jì)算出顆粒運(yùn)動(dòng)速度及均方根位移，基于均方根位移大小變化可得出樣品的彈性因子指數(shù) （Elasticity index，EI）、宏觀黏度指數(shù)（Macroscopic viscosity index，MVI）及固液平衡值（Solid-liquid balance value，SLB），可以反映發(fā)酵乳的黏彈性等特征[19]。

彈性因子可以快速、簡(jiǎn)單描述樣品的彈性特征，還可以檢測(cè)彈性隨時(shí)間變化過程，EI 值與凝膠彈性變化呈正比，EI 值越大，凝膠彈性越強(qiáng)，表明樣品中顆粒在懸浮液中可以很好“固定”，樣品的穩(wěn)定性好。發(fā)酵乳發(fā)酵過程中及后熟期間彈性因子變化過程如圖4所示。3 組樣品0～5 h 差異不明顯，表明此時(shí)酪蛋白沒有形成凝膠結(jié)構(gòu)；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，3 組樣品EI 值明顯升高；GW21-4 組上升速度高于XJ57-3 組和ND03 組；GW21-4 組在發(fā)酵6 h 左右EI 曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)，表明發(fā)酵乳形成凝膠結(jié)構(gòu)彈性達(dá)到最大值，即達(dá)到凝膠點(diǎn)，而其余2 組樣品約在8 h 左右達(dá)到凝膠點(diǎn)；達(dá)到凝膠點(diǎn)后，3 組樣品的EI 值增加達(dá)到最大值，GW21-4組EI 值高于其余2 組樣品。后熟期間，3 組樣品的EI 值有一定升高，表明形成了更結(jié)實(shí)的發(fā)酵乳。

圖3 發(fā)酵過程及貯藏期間黏度變化Fig.3 Changes of viscosity of different S.thermophilus during fermented and storage period

圖4 發(fā)酵過程及后熟期間彈性因子（EI）變化Fig.4 Changes of elastic index （EI） during fermentation and post-ripening

3 組樣品的黏度因子變化由圖5可知，在發(fā)酵初期，由于酪蛋白沒有形成凝膠結(jié)構(gòu)，3 組樣品的MVI 值處于波動(dòng)狀態(tài)；pH 值持續(xù)降低使酪蛋白膠束所帶凈負(fù)電荷含量減少，膠束間靜電斥力下降，影響了膠束的穩(wěn)定性，酪蛋白膠束開始解離，進(jìn)而使溶解度下降[20-21]；GW21-4 組樣品MVI值上升速度高于XJ57-3 組和ND03 組；樣品到達(dá)凝膠點(diǎn)，解離后的酪蛋白重新聚集開始形成一定的凝膠結(jié)構(gòu)，3 組樣品的MVI 值達(dá)到最大；由于嗜熱鏈球菌不斷產(chǎn)酸，使pH 值逐漸接近酪蛋白等電點(diǎn)，酪蛋白膠束排斥力減小，疏水作用增強(qiáng)，酪蛋白粒子快速聚集和重新排列形成蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)，到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，GW21-4 組的MVI 值最大[21]。后熟結(jié)束后，GW21-4 組樣品的MVI 值高于其它2 組，與上文研究黏度測(cè)定結(jié)果相同。

固液平衡值是指發(fā)酵乳在發(fā)酵過程中，每個(gè)時(shí)間所具有固態(tài)和液體特征的比值。樣品具有固體性質(zhì)時(shí)，SLB 值為0；樣品具有彈性或固體特性時(shí)，SLB 值為0～0.5；樣品具有黏性或液體特性時(shí)，SLB 值為0.5～1；樣品具有液體狀態(tài)時(shí)，SLB 值為1[23]。如圖6所示，所有樣品的SLB 值處于波動(dòng)狀態(tài)，NDO3 組樣品的SLB 值最大狀態(tài)偏向于液體特性；由于酸度持續(xù)降低，SLB 值出現(xiàn)拐點(diǎn)，表明此時(shí)單體酪蛋白重新聚集形成膠粒，使溶解度降低，黏度增大；到達(dá)樣品凝膠點(diǎn)，凝膠結(jié)構(gòu)使樣品狀態(tài)傾向于固體特性，表明體系中膠體微粒的遷移受到酪蛋白聚集的影響。有研究表明當(dāng)pH 值不斷接近發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，SLB 值逐漸上升后趨于平緩，酪蛋白膠束最終凝結(jié)成三維空間網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)[22]。發(fā)酵結(jié)束后，GW21-4 組和ND03 組樣品的SLB值低于XJ57-3 組，說明GW21-4 組和ND03 組樣品狀態(tài)更接近于固體特性；經(jīng)過4 ℃后熟，GW21-4 和ND03 組的SLB 值較低，表明其狀態(tài)更多表現(xiàn)為固體特性。

3 組樣品在發(fā)酵過程中和后熟期間，3 株嗜熱鏈球菌對(duì)發(fā)酵乳凝膠結(jié)構(gòu)的影響存在差異性。GW21-4 組對(duì)比其它組，發(fā)酵乳具有較高黏度，發(fā)酵乳的結(jié)構(gòu)變得緊密，SLB 值較低驗(yàn)證了發(fā)酵乳具有固體結(jié)構(gòu)特性。有研究表明不同發(fā)酵劑菌株發(fā)酵乳的凝膠硬度存在差異，產(chǎn)EPS 菌株可以提高攪拌型發(fā)酵乳的表觀黏度，然而未發(fā)現(xiàn)EPS 產(chǎn)量與黏度之間的相關(guān)性[18]。

圖5 發(fā)酵過程及后熟期間黏度因子（MVI）變化Fig.5 Changes of macro viscosity index （MVI）during fermentation and post-ripening

圖6 發(fā)酵過程及后熟期間固液平衡值（SLB）變化Fig.6 Changes of solid-liquid equilibrium （SLB）during fermentation and post-ripening

4 結(jié)論

本研究利用3 株嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌復(fù)配發(fā)酵，研究發(fā)酵乳的發(fā)酵特性、貯藏特性和流變學(xué)特性，以篩選出優(yōu)良的發(fā)酵劑菌株。結(jié)果表明，嗜熱鏈球菌（S.thermophilus）GW21-4 具有良好的發(fā)酵特性和貯藏穩(wěn)定性，在發(fā)酵過程中可以維持較高的黏彈性，可以使酪蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加堅(jiān)固。綜上，嗜熱鏈球菌GW21-4 在乳制品開發(fā)利用中具有良好的應(yīng)用潛力。