益生菌干酪乳桿菌Zhang和乳雙歧桿菌V9發(fā)酵乳胞外多糖含量對流變學特性、質(zhì)構(gòu)和穩(wěn)定性的影響

白 梅，黃 天，郭 帥，王月嬌，韓之皓，李 敏，王記成，孟和畢力格

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點實驗室 呼和浩特010018）

幾千年來，世界眾多國家已生產(chǎn)許多不同種類的發(fā)酵乳制品，各地消費者對其具有的健康促進作用越來越感興趣，人們也越來越意識到食品與健康之間存在重要聯(lián)系。在功能性發(fā)酵乳中，含有益生菌的產(chǎn)品在世界范圍內(nèi)呈迅猛上升的趨勢[1]。益生菌，如乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬是人體腸道菌群中有益菌的重要成員，其通過產(chǎn)生短鏈脂肪酸等，對人體健康產(chǎn)生多種有益影響，起到改善腸道微生物平衡，抑制腸道致病菌，減少結(jié)腸癌風險，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和降低血清膽固醇水平等的功效[2]。

干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 是我國自主開發(fā)具有良好益生特性的益生菌菌株，已廣泛應用于食品。干酪乳桿菌Zhang 分離自內(nèi)蒙古正藍旗傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶，對酸和膽鹽脅迫具有較高的耐受性，有降低血脂，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，抗氧化和抑制腸道病原菌生長等益生菌功效[3-5]。Hor 等[6]將137 名志愿者分為成人組和老年組，通過口服干酪乳桿菌Zhang 的隨機雙盲試驗，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌Zhang 能夠降低血漿炎性細胞因子（IL-1）水平，增加抗炎細胞因子（IL-4 和IL-10）水平，并上調(diào)表面抗原分化簇CD4、CD8、CD44、CD27 和CX-C 基因表達水平。另外，老年組每周排便次數(shù)增加，紅細胞異常減輕，對成年人上呼吸道感染癥狀有改善，并且顯著縮短了癥狀持續(xù)時間，這些發(fā)現(xiàn)揭示了干酪乳桿菌Zhang 在減輕上呼吸道感染癥狀和維持腸道健康方面的潛力。乳雙歧桿菌V9 是1 株分離自健康蒙古族兒童腸道的益生菌，對便秘、急性腹瀉和慢性腹瀉有很好的治療效果，可以調(diào)節(jié)便秘和腹瀉患者的腸道菌群，使之更加趨向于健康人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)[7]。乳雙歧桿菌V9 應用于發(fā)酵豆乳，促使無活性的異黃酮可轉(zhuǎn)化為功能性活性異黃酮[8]。Zhang 等[9]研究了乳雙歧桿菌V9 對14 例多囊卵巢綜合征患者的腸道菌群、腸腦介質(zhì)和性激素水平的影響，其觀察到9 名患者的促黃體激素及促黃體激素/促卵泡素比值顯著降低，而性激素及腸道短鏈脂肪酸顯著增加，患者體內(nèi)活性乳雙歧桿菌V9 的數(shù)量與臨床指標改善及短鏈脂肪酸水平升高一致，證實乳雙歧桿菌V9可有效定植宿主腸道，對其發(fā)揮益生功效至關重要，并進一步探討益生菌如何通過調(diào)節(jié)多囊卵巢綜合癥患者的腸道菌群來調(diào)節(jié)性激素水平的潛在機制。

消費者會被益生菌產(chǎn)品的健康功效所吸引，然而值得注意的是，產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)特性才是消費者喜好的首要因素。此前研究發(fā)現(xiàn)，益生菌干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 在發(fā)酵乳中具有非常好的穩(wěn)定性，同時其與嗜熱鏈球菌復配發(fā)酵可賦予產(chǎn)品較好的風味，然而，目前研究只局限于pH值、滴定酸度（TA）、黏度和持水性等發(fā)酵和貯藏的宏觀特性，未進行深入分析[10-13]。本研究以益生菌干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 為研究對象，研究分別添加和復配時對發(fā)酵乳流變學特性、質(zhì)構(gòu)特性和貯藏穩(wěn)定性的影響。由于EPS 含量變化對發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)有直接影響，因此測定發(fā)酵乳中菌株代謝產(chǎn)生的胞外多糖 （Extracellular polysaccharide，EPS）含量，以期綜合評價益生菌干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 對發(fā)酵乳品質(zhì)的影響，為實際生產(chǎn)、推廣應用提供技術(shù)依據(jù)，同時為益生菌發(fā)酵乳的發(fā)酵及貯藏特性評價提供新思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

純牛乳（蛋白質(zhì)：3.0 g/100 g，脂肪：3.7 g/100 g），蒙牛?；蔗糖，廣西鳳糖生化股份有限公司；干酪乳桿菌Zhang、乳雙歧桿菌V9、酸奶發(fā)酵劑YCM950【含嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和德氏乳桿菌保加利亞亞種 （Lactobacillus delbrueckii ssp.Bulgaricus），低黏度型】直投式發(fā)酵劑，金華銀河生物科技有限公司。

MRS 固體培養(yǎng)基、M17 固體培養(yǎng)基，Oxoid 公司；萬古霉素，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；氯化鋰，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

粘度計（DV2T），美國Brookfield 公司；質(zhì)構(gòu)儀（TA-XT plus），英國Stable Micro System 公司；微流變分析儀（Rheolaser Master 型），法國Formulaction 儀器公司；全波長酶標儀（SpectraMax M2），美國Molecular Devices 公司；超凈工作臺（SJ-CJ-2FDQ），蘇州蘇潔凈化設備有限公司；高壓均質(zhì)機 （SRH60-70），上海申鹿均質(zhì)機有限公司；雷磁pH 計（pHSJ-3F），上海精密科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 攪拌型發(fā)酵乳樣品的制備 發(fā)酵乳以純牛乳和蔗糖（質(zhì)量分數(shù)6%）為基料，分為4 組，均接種酸奶基礎發(fā)酵劑，以37-1 為對照組，具體接種量見表1。發(fā)酵乳樣品制作過程：將蔗糖按比例完全溶解于牛乳中，加熱至60 ℃，均質(zhì)（20 MPa），95℃殺菌5 min，水浴冷卻至37 ℃，接種發(fā)酵，至pH 4.6 為終止，立即攪拌并水浴冷卻，直到溫度降到20 ℃后無菌分裝，于4 ℃條件下貯存21 d。每個試驗組3 個平行樣。

表1 各試驗組發(fā)酵乳接種量Table 1 Inoculation volume of each experimental yogurt

1.3.2 發(fā)酵乳中活菌數(shù)測定 采用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)。各菌種在發(fā)酵期間每2 h 和發(fā)酵終點以及貯藏期第1，7，14，21 天計數(shù)。準確稱取25.0 g 樣品至裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，加入225 mL 的無菌NaCl 生理鹽水0.85%（質(zhì)量分數(shù)），振蕩混勻15 min 后，取1 mL 稀釋液至9 mL 生理鹽水中，并依此進行倍比稀釋，取合適梯度傾注培養(yǎng)。嗜熱鏈球菌采用M17 固體培養(yǎng)基加1.0%（質(zhì)量分數(shù)）乳糖，42 ℃培養(yǎng)48 h。保加利亞乳桿菌采用MRS 固體培養(yǎng)基 （冰乙酸調(diào)整pH 5.2），37 ℃培養(yǎng)48 h，對于添加干酪乳桿菌Zhang 的樣品，要減去相應干酪乳桿菌數(shù)量。干酪乳桿菌Zhang 采用添加0.01‰（質(zhì)量分數(shù)） 萬古霉素的MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h。乳雙歧桿菌V9 采用含半胱氨酸和莫匹羅星鋰鹽的改良MRS 固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)72 h。均在厭氧條件下培養(yǎng)[14]。

1.3.3 發(fā)酵過程中流變學特性分析 采用光學微流變儀檢測發(fā)酵期間發(fā)酵乳的流變學特性。將接種后的基料各20 mL 小心轉(zhuǎn)移至滅菌的配套樣品瓶中，注意保持玻璃瓶壁的清潔，以免造成光學信號偏差。放入測定槽，于37 ℃觀測發(fā)酵過程中的黏度因子（Viscosity index，VI）、彈性因子（Elastic index，EI）以及固液平衡值（Solid liquid balance，SLB）隨時間的變化情況。每隔5 min 采集1 次數(shù)據(jù)，測定至發(fā)酵終點[15]。將玻璃瓶取出放入冷藏箱4 ℃條件下冷藏24 h，然后再將樣品放入測定槽中待樣品恢復室溫后繼續(xù)采集數(shù)據(jù)，并根據(jù)儀器自帶分析軟件獲取相關流變學參數(shù)，包括彈性因子、黏性因子和固液平衡值，以評價發(fā)酵流變學特性。

1.3.4 質(zhì)構(gòu)特性分析 使用TA.XT plus 質(zhì)構(gòu)儀檢測發(fā)酵乳在后熟后的硬度 （Firmness）、稠度（Consistency）、內(nèi)聚性（Cohesiveness）和黏度指數(shù)（Viscosity index）的變化情況。使用5 kg 稱重傳感器進行單次壓縮循環(huán)試驗來測量益生菌酸奶樣品[16]。探頭選用A/BE。試驗前和試驗中速度固定為1 mm/s，穿透深度為30 mm。樣品從在4 ℃取出后立即檢測，每組3 個平行。

1.3.5 貯藏期穩(wěn)定性分析

1.3.5.1 酸度 采用國標《食品安全國家標準 食品酸度的測定滴定酸度》（GB 5009.239-2016）中“酚酞指示劑法”測定，以評價發(fā)酵乳后酸。

1.3.5.2 黏度 發(fā)酵乳樣品放至室溫后進行測定，采用4# 轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速為100 r/min，扭矩為10%～100%，測定時間為30 s。所測定的黏度值為發(fā)酵乳的有效黏度值，每組3 個平行。

1.3.5.3 持水性 準確稱取發(fā)酵乳樣品20.0 g 于50 mL 離心管中，5 000×g 離心10 min 后收集濾液并稱重，按式（1）計算。

1.3.6 胞外多糖提取和含量測定 采用Kearney等[17]的方法進行發(fā)酵乳樣品中胞外多糖的提取和含量檢測。提取具體步驟：取發(fā)酵乳100 mL→沸水浴15 min→冷卻后離心（10 000 r/min，20 min，4℃）→取上清液加入80%（質(zhì)量分數(shù)） 的三氯乙酸至終質(zhì)量分數(shù)4%→4 ℃冷藏靜置過夜→離心（10 000 r/min，20 min，4 ℃）→取上清液，加入無水乙醇至終體積分數(shù)75%→4 ℃冷藏靜置22 h→離心（10 000 r/min，20 min，4 ℃）→棄上清→沉淀物溶于超純水→即得胞外多糖溶液。含量采用苯酚-硫酸法測定，使用10 mg/mL 葡萄糖標準溶液配制不同質(zhì)量濃度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL）葡萄糖溶液，通過標準曲線，計算得出總糖含量。

1.3.7 統(tǒng)計分析 微流變數(shù)據(jù)采用Rheolaser Master 型光學法微流變分析儀自帶的Smart 軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有圖表采用Orgin 9.1 繪制。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）統(tǒng)計學分析，顯著性水平設定為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳中活菌數(shù)變化

各組發(fā)酵乳在發(fā)酵及貯藏過程中保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 的活菌數(shù)含量以及pH 值變化情況如圖1所示。各組中作為基礎發(fā)酵劑的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長趨勢基本一致，都是在發(fā)酵期間迅速增加，到后熟后含量達到最高，貯藏期數(shù)量逐漸減少。與對照組37-1 相比，在添加單一或復配益生菌時能夠促進發(fā)酵過程中保加利亞乳桿菌的生長，在貯藏期沒有影響。37-2 組發(fā)酵乳中乳雙歧桿菌V9 活菌數(shù)在21 d 貯藏期末的活菌數(shù)為（2.04±0.12）×108CFU/mL；37-3 組發(fā)酵乳中干酪乳桿菌Zhang 在貯藏末期的活菌數(shù)為 （3.16±0.02）×108CFU/mL；37-4 組發(fā)酵乳中干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 到貯藏期末的活菌數(shù)分別為 （3.35±0.15）×108，（1.27±0.08）×108CFU/mL。這與郭壯[11]、其木格蘇都等[13]的研究結(jié)果一致，干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 在發(fā)酵乳中具有非常好的穩(wěn)定性[10，12-13]。

為確保益生菌有益作用的發(fā)揮，歐盟和澳洲標準要求益生菌產(chǎn)品中的活菌數(shù)量應不低于106CFU/g。在日本，規(guī)定每克或毫升益生菌產(chǎn)品中最低含有107CFU 的活性益生菌，遠高于能夠發(fā)揮作用的最低劑量（105CFU/mL 或CFU/g）。使用最為廣泛的益生菌濃度是106CFU/mL 或CFU/g，產(chǎn)品一般也執(zhí)行這個標準[18-19]。在國際上很多國家銷售并得到消費者認可的活菌型產(chǎn)品養(yǎng)樂多，是使用干酪乳桿菌代田株（Lactobacillus casei Shirota，L.casei Shirota） 發(fā)酵，其產(chǎn)品活菌數(shù)在1×108CFU/g 以上，主打功能為調(diào)節(jié)人體腸道微生態(tài)平衡，促進新陳代謝等。在本研究中，添加益生菌干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 在貯藏期較為穩(wěn)定，且活菌數(shù)在108CFU/mL 以上，可以充分保證其益生功效的發(fā)揮。

此外，發(fā)現(xiàn)37-2、37-3、37-4 組到達發(fā)酵終點pH 4.5 所需的時間分別為9.2，9.0，8.8 h，對照組37-1 為9.4 h，即添干酪乳桿菌Zhang 和/或乳雙歧桿菌V9 均縮短了發(fā)酵時間。Akalin 等[20]基于益生菌乳雙歧桿菌Bb12 發(fā)酵乳的研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，發(fā)現(xiàn)菌株活力與其α-半乳糖苷酶的活性直接相關。Mohammadi 等[21]應用乳雙歧桿菌B94 蛋白水解酶具有的高活性，增加了蛋白水解率，從而提高了保加利亞乳桿菌的存活率。在本試驗中益生菌自身生長代謝產(chǎn)酸加速了發(fā)酵，同時益生菌與基礎發(fā)酵劑菌種存在互作共生關系，研究發(fā)現(xiàn)益生菌干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 在發(fā)酵過程中均促進了保加利亞乳桿菌的增殖，進而提高了產(chǎn)酸速率，縮短了發(fā)酵時間，提高了在工業(yè)化生產(chǎn)中的經(jīng)濟效益。

圖1 酸奶發(fā)酵及貯藏過程中活菌數(shù)變化Fig.1 Changes of viable bacteria in yoghurt during fermentation and storage

2.2 胞外多糖產(chǎn)量

菌株代謝產(chǎn)生的EPS 可以極大改善發(fā)酵乳的流變特性和感官品質(zhì)。本研究對各組發(fā)酵乳樣品在貯藏期間的EPS 含量進行測定，如圖2所示，37-2、37-3、37-4 的EPS 含量顯著高于37-1（P＜0.05），表明添加益生菌干酪乳桿菌Zhang 和/或乳雙歧桿菌V9 可以顯著增加發(fā)酵乳中EPS 含量，且各組EPS 總含量在貯藏期間逐漸增加。其中，對照組37-1 的EPS 含量從發(fā)酵1 d 的 （64.4±5.4）mg/L 到21 d 的（351.6±5.4）mg/L，約增加5.4 倍；37-2、37-3、37-4 組分別從（361.1±20.1），（546.3±31.5），（515.2±17.5）mg/L 增加到（903.6±33.9），（1 165.4±37.8），（1 103.8±45.6）mg/L，分別增加了2.5，2.1，2.2 倍，說明添加益生菌組在發(fā)酵期間可以代謝產(chǎn)生大量的EPS，然而在4 ℃貯藏期間EPS 增量較對照組少。

值得注意的是，37-3 組中EPS 含量始終顯著高于37-2 組（P＜0.05），說明干酪乳桿菌Zhang 較乳雙歧桿菌V9 具有更強的產(chǎn)EPS 能力。張文弈[22]對干酪乳桿菌Zhang 的全基因組序列進行測序，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌Zhang 染色體上有2 個不同區(qū)域編碼與細胞表面胞外多糖合成相關基因簇，預示干酪乳桿菌Zhang 具有潛在的產(chǎn)胞外多糖的能力，表明該菌株有合成胞外多糖的遺傳基礎，本研究也為這一代謝通路的存在提供有力證據(jù)。此前研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌Zhang 在發(fā)酵乳中對胃腸液的耐受性提高[23]，具有更高的存活率，這可能就是由于發(fā)酵乳中EPS 對菌體的保護作用導致。

在整個貯藏期，37-2 組中EPS 的含量較為穩(wěn)定，37-3 組在前7 d 增加較快后趨于恒定，37-4組在持續(xù)增加，之后增速漸緩。對比活菌數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌Zhang 在貯藏期間仍有增殖，可以繼續(xù)代謝產(chǎn)生EPS，這可能是含該菌株的發(fā)酵乳EPS 持續(xù)增加的原因。在將干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 復配時發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳中的EPS 含量并沒重疊增加，多菌株協(xié)同作用下EPS 的代謝情況還有待進一步分析研究。最新研究表明，不同菌種產(chǎn)生的EPS 或同一菌種的不同株在乳發(fā)酵過程中產(chǎn)生EPS 的摩爾質(zhì)量、重復單元結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量可能不同[24]，而且特定類型的EPS 可能才是造成酸奶質(zhì)地差異的原因，而不是EPS 的濃度或摩爾質(zhì)量[25]。EPS 對發(fā)酵乳的影響取決于許多因素，在本研究中，干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 代謝產(chǎn)生的EPS 類型、多糖連接方式、分叉程度、分子質(zhì)量和化學性質(zhì)等還需進一步研究。

圖2 各發(fā)酵乳樣品在貯藏期間的胞外多糖含量變化Fig.2 Determination of EPS concentration of yogurt during storage

2.3 流變學特性

酪蛋白凝膠是發(fā)酵乳結(jié)構(gòu)形成的主要結(jié)構(gòu)組成部分，呈動態(tài)變化，在發(fā)酵時凝膠化之前及形成凝膠網(wǎng)絡過程中存在顆粒重排[15]。本研究采用多頻擴散波譜法，通過參數(shù)彈性因子、黏性因子和固液平衡值的演變，對各益生菌組與對照組發(fā)酵乳的凝膠化過程進行監(jiān)測（圖3）。彈性因子和黏性因子分別與彈性模量（G′）和黏度模量（G″）成正比，并隨時間變化。固液平衡值與產(chǎn)品的黏彈性成正比，表示以時間為坐標的產(chǎn)品的類固態(tài)和類液態(tài)之間的比值。固液平衡值從0～0.5 表示發(fā)酵乳是彈性的或固體狀，0.5～1 表示發(fā)酵乳是黏性的或液體狀[26]。

本研究中，各組發(fā)酵乳的黏性因子、彈性因子表現(xiàn)出相同的變化模式。最初，各組發(fā)酵乳的彈性因子保持穩(wěn)定，到5 h 時37-4 組最先形成凝膠結(jié)構(gòu)，這與37-4 組所需發(fā)酵時間最短的結(jié)果一致。同時，所有發(fā)酵乳的黏性因子保持在同一水平的小波動，在凝膠點出現(xiàn)驟增后緩慢增加峰值。所有發(fā)酵乳在發(fā)酵終點時均表現(xiàn)出弱黏彈性凝膠特征，這與報道一致[27-29]。所有發(fā)酵乳的固液平衡值從起始點波動到開始出現(xiàn)凝膠的最低點，隨后逐漸增加到穩(wěn)定，表現(xiàn)出更多的固體特征。特別是4組發(fā)酵乳中37-4 組的黏性因子略高除外。37-4組和37-3 組的彈性因子大于其它2 組，說明彈性模量較高，然而固液平衡值低于其它樣品，表明37-4 組和37-3 組具有較高強度的凝膠結(jié)構(gòu)。這與2 組中含有較高含量的EPS 相吻合。EPS 在凝膠形成時和蛋白質(zhì)網(wǎng)絡之間具有相互作用，菌體代謝產(chǎn)生的原位EPS 在與蛋白質(zhì)相互作用時，可以充當活性填料并增加黏彈性模量。凝膠形成之前，在乳中存在EPS 會產(chǎn)生大孔隙，導致黏彈性模量降低。凝膠化后，EPS 的產(chǎn)生似乎不影響網(wǎng)絡的孔隙率，然而可能導致固液平衡值降低，并最終賦予發(fā)酵乳均勻穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。然而，不同菌株代謝產(chǎn)生的EPS 結(jié)構(gòu) （如類型和分支程度）不同，對發(fā)酵乳黏度的影響也不同[29]。本研究中，添加乳雙歧桿菌V9 的37-2 組EPS 含量雖明顯高于對照組，但并沒有表現(xiàn)出流變參數(shù)值差異，這可能與其EPS 類型有關，具體作用機理還有待進一步研究。

圖3 發(fā)酵乳在發(fā)酵過程中彈性因子（a）、黏度因子（b）及固液平衡值（c）的變化Fig.3 The elastic index （a），macroscopic viscosity index （b） and solid liquid balance （c） of yogurt during the fermentation

2.4 質(zhì)構(gòu)特性

本研究對所有益生菌組和對照組的攪拌型發(fā)酵乳樣品在后熟后的質(zhì)構(gòu)進行測定，以評價添加益生菌菌種對發(fā)酵乳質(zhì)地的影響（表2）。測定參數(shù)包括硬度、稠度、內(nèi)聚性和黏度指數(shù)，硬度定義為達到最大深度所需的力，黏度指數(shù)由單循環(huán)復位時所受的力產(chǎn)生面積計算而得，指將壓縮活塞從樣品中拉出所需的功。硬度是決定酸奶質(zhì)量的關鍵參數(shù)[30]。在本研究中，37-3 和37-4 具有最大硬度，其次為37-2，再次是37-1，差異顯著（P＜0.05）。在貯藏期間，由于后酸和酪蛋白水合作用等因素會影響發(fā)酵乳硬度、脫水收縮等質(zhì)地特性，因此本試驗各質(zhì)構(gòu)參數(shù)均在發(fā)酵乳后熟后測定，只考慮發(fā)酵期間菌種的直接作用。事實上，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的EPS 也可以改善質(zhì)構(gòu)，本研究中硬度和黏度指數(shù)高低順序與各組EPS 含量高低結(jié)果基本一致，添加益生菌組較對照組硬度高。樣本37-3、37-4 的內(nèi)聚性顯著高于37-1、37-2 （P＜0.05），有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)聚性與凝膠組成強弱有關，反應了發(fā)酵乳的持水特性[31]。發(fā)酵乳的高稠度是指高密度的黏性產(chǎn)品。本研究中，37-3、37-4 稠度顯著高于37-1 （P＜0.05）?？梢钥闯?，添加干酪乳桿菌Zhang 和乳雙歧桿菌V9 均可改善發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)，尤其是前者，這一現(xiàn)象與發(fā)酵過程中流變學特性結(jié)果一致。

表2 發(fā)酵乳后熟后質(zhì)構(gòu)參數(shù)分析Table 2 Analysis of texture index of yogurts after post-fermentation

2.5 貯藏穩(wěn)定性

本研究跟蹤監(jiān)測了各組發(fā)酵乳樣品在貯藏期間的滴定酸度、持水性和黏度變化情況，以綜合評價接種干酪乳桿菌Zhang 和/或乳雙歧桿菌V9 的發(fā)酵乳后酸及穩(wěn)定性情況，具體結(jié)果如表3所示。

表3 發(fā)酵乳貯藏期間酸度、持水性及黏度分析Table 3 Changes of titratable acidity，water holding capacity and viscosity of yogurt samples during storage

2.5.1 酸度 發(fā)酵乳后酸是影響酸奶風味和組織狀態(tài)的重要因素。各組發(fā)酵乳在后熟1 d 時滴定酸度沒有顯著差異（P＞0.05），在貯藏期間均呈增加趨勢。在14 d 時37-3 和37-4 的滴定酸度高于其它2 組（P＜0.05），在21 d 時37-4 的滴定酸度高于37-1 和37-2 組（P＜0.05）。然而，從總體貯藏期間滴定酸度的增量ΔTA 角度分析，添加益生菌組37-2、37-3、37-4 與對照組37-1 比較并無差異。表明添加益生菌總體上不會影響發(fā)酵乳在貯藏期間滴定酸度的增加量，反應出添加干酪乳桿菌Zhang 和/或乳雙歧桿菌V9 對發(fā)酵乳貯藏時的后酸化程度沒有影響。Purwandari 等[32]在研究酸奶發(fā)酵過程中的產(chǎn)EPS（包括黏液多糖和莢膜多糖）時也獲得了類似的結(jié)果。

2.5.2 持水性 乳清析出是發(fā)酵乳制品中一種普遍存在的質(zhì)量缺陷，持水性用于衡量發(fā)酵乳的乳清存在于蛋白質(zhì)網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。本研究中，樣本37-3 和37-4 在貯藏期間持水性顯著高于37-1 和37-2（P＜0.05），這與在發(fā)酵過程中表現(xiàn)出的高內(nèi)聚性一致。表明添加單一干酪乳桿菌Zhang和復配時均能夠提高發(fā)酵乳的持水性，這一結(jié)果和陳世賢等[12]報道持水性沒有變化不同，原因可能在于：一是測定方法不同，本研究采用了離心法測定，對發(fā)酵乳樣品的破壞力較大，導致結(jié)果不同；二是采用的基礎劑菌種不同，本研究所用的是低黏菌株，摒除了發(fā)酵劑菌種產(chǎn)生的EPS 對質(zhì)構(gòu)的作用，進而掩蓋所添加益生菌的作用。添加乳雙歧桿菌V9 的37-2 組持水性與對照組無差異，這可能與EPS 的含量及類型有關。

2.5.3 黏度 在本研究中，益生菌組37-2、37-3、37-4 在貯藏期間各個時間點的黏度均顯著高于對照組37-1（P＜0.05），而37-3、37-4 的黏度顯著高于37-2，說明添加益生菌可提高發(fā)酵乳黏度，并且含有干酪乳桿菌Zhang （包括單一和復配）的發(fā)酵乳黏度都大于只添加乳雙歧桿菌V9 組。EPS含量高的益生菌組表現(xiàn)出的黏度較高，這一現(xiàn)象與先前報道一致[17，33-34]。有研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵乳加工時添加外源EPS 可增強蛋白網(wǎng)絡之間相互作用，有利于發(fā)酵乳凝膠的形成，酸奶的物理特性類似于假塑性流體，酸奶黏度增加有助于防止因加工過程中的機械剪切而導致的質(zhì)構(gòu)缺陷，在酸奶生產(chǎn)和貯藏過程中EPS 對質(zhì)構(gòu)和品質(zhì)有很大改善，是食品添加劑（如黃原膠）的潛在替代品[35]?？偟膩碚f，發(fā)酵乳含EPS 的乳清相具有類似聚合物的物性特征，可增加發(fā)酵乳的稠度和黏性。

3 結(jié)論

本研究首次對添加益生菌干酪乳桿菌Zhang和/或乳雙歧桿菌V9 發(fā)酵乳中EPS 含量進行測定，并對發(fā)酵過程流變學特性、發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)參數(shù)和貯藏期間穩(wěn)定性的影響進行分析，發(fā)現(xiàn)在添加益生菌干酪乳桿菌Zhang 和/或乳雙歧桿菌V9 能夠顯著增加發(fā)酵乳中的EPS 含量，EPS 有利于在發(fā)酵過程中形成緊密的凝膠網(wǎng)絡，尤其是添加干酪乳桿菌Zhang 組表現(xiàn)出較高的彈性因子和較低的固液平衡值，具有高強度的凝膠結(jié)構(gòu)。發(fā)酵乳硬度和黏度指數(shù)高低順序與各組EPS 含量高低順序基本一致，益生菌組高于對照組。在貯藏期間，添加益生菌對發(fā)酵乳后酸化程度沒有影響，可增加發(fā)酵乳黏度，添加干酪乳桿菌Zhang（單一和復配）能提高發(fā)酵乳的持水性。同時，益生菌活菌數(shù)在貯藏期末仍在108CFU/mL 以上，可有效保證益生菌發(fā)揮其促進健康的作用。

綜上，在發(fā)酵乳中添加益生菌干酪乳桿菌Zhang 和/或乳雙歧桿菌V9 不僅能夠賦予發(fā)酵乳益生功效，而且能夠改善質(zhì)構(gòu)特性和貯藏穩(wěn)定性，為實際生產(chǎn)、推廣應用提供數(shù)據(jù)支持和技術(shù)依據(jù)，同時本研究為益生菌發(fā)酵乳的發(fā)酵及貯藏特性評價提供研究思路和方法。然而，干酪乳桿菌Zhang和/或乳雙歧桿菌V9 在乳中產(chǎn)生EPS 的代謝通路以及分子結(jié)構(gòu)和組成還尚不明確，具體的作用機理有待進一步研究。