藥品限度檢查中霉菌總數(shù)測(cè)定培養(yǎng)基的優(yōu)化

(1臨沂市蘭山區(qū)人民醫(yī)院，山東 臨沂 276000；2臨沂大學(xué)藥學(xué)院)

藥品微生物限度檢驗(yàn)是保證藥品使用安全的重要工作，也是控制藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，藥品染菌程度直接影響其內(nèi)在質(zhì)量。霉菌在自然界分布廣泛，藥品最易受其污染，輕者有效成分會(huì)被分解，重者還可能會(huì)產(chǎn)生某些毒素，造成患者的機(jī)體反應(yīng)，引發(fā)疾病甚至危及生命。目前，平板菌落計(jì)數(shù)法是國內(nèi)外藥品霉菌總數(shù)檢測(cè)常用方法之一，培養(yǎng)基的質(zhì)量直接影響檢測(cè)的結(jié)果。為此，本研究在國際常用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同濃度的葡萄糖、酵母膏和吐溫，對(duì)不同的樣品進(jìn)行霉菌總數(shù)檢測(cè)，優(yōu)選出適宜的改良培養(yǎng)基，使霉菌菌落更清晰易檢、提高檢出率。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料 試驗(yàn)菌種：黑曲霉、青霉由臨沂大學(xué)藥學(xué)院微生物教研室提供。試驗(yàn)藥品：維生素C片、急支糖漿、養(yǎng)胃丸、益母草顆粒、膚輕松軟膏、珍視明滴眼液從藥店購買。改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基的制備：稱取蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、酵母粉2 g、瓊脂14 g，量取蒸餾水或去離子水1000 mL，最終pH調(diào)至(6.4±0.2)，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，116℃高壓滅菌30 min，備用。玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(A0)的制備：稱取蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、玫瑰紅鈉0.0133 g、瓊脂14 g，量取蒸餾水或去離子水1000 mL，最終pH調(diào)至(6.0±0.2)，攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌20 min，備用。改良培養(yǎng)基的制備：在A0的基礎(chǔ)上，分別添加不同濃度的滅菌葡萄糖(A1)、酵母膏(A2)和吐溫(A3)制成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1樣品制備 (1)霉菌菌液的制備[1-2]：將含黑曲霉、青霉的新鮮培養(yǎng)物接種至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，設(shè)定條件下培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 ml 含0.05 % (mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌NaCl溶液洗脫孢子，然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05% (mL/mL)聚山梨酯80的0.9%無菌NaCl溶液制成含孢子數(shù)50～100 CFU/mL的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 h內(nèi)使用；若保存在2℃～8℃，可在24 h內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2℃～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。(2)藥品樣品液的制備。①維生素C片、益母草顆粒：樣品10 g+稀釋劑90 ml(pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液)為1∶10供試液，最低稀釋級(jí)作為驗(yàn)證供試溶液；②急支糖漿、珍視明滴眼液：樣品10 ml+稀釋劑90 ml為1∶10供試液；③養(yǎng)胃丸、膚輕松軟膏：樣品10 g+20 ml無菌十四烷酸異丙酯充分振蕩溶解+45℃稀釋劑90 ml為1∶10供試液。

1.2.2霉菌總數(shù)的檢測(cè) 每個(gè)培養(yǎng)皿中加入樣品適宜稀釋液1 ml，并分別和不同試驗(yàn)培養(yǎng)基混勻靜置后，在25℃～28℃的溫度下置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后觀察計(jì)數(shù)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3培養(yǎng)基的優(yōu)選 (1)添加葡萄糖的試驗(yàn)：在A0基礎(chǔ)上分別加入0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的滅菌葡萄糖，制備改良培養(yǎng)基，對(duì)純種黑曲霉和青霉的混合菌液進(jìn)行霉菌總數(shù)的檢測(cè)。(2)添加酵母膏的試驗(yàn)：加入的滅菌酵母膏的濃度分別為0.2%、0.4%、0.6%和0.8%，方法同(1)。(3)添加吐溫的試驗(yàn)：添加的滅菌分散劑吐溫80的濃度分別0.1%、0.15%、0.2%和0.25%，方法同(1)。

2 結(jié)果與分析

2.1A1培養(yǎng)基檢測(cè)霉菌 添加1.0%葡萄糖的A1培養(yǎng)基對(duì)霉菌的檢出率提升最明顯，葡萄糖含量太高或太低都會(huì)降低檢出率。見表1。

2.2A2培養(yǎng)基檢測(cè)霉菌 添加不同濃度酵母膏的A2培養(yǎng)基，其霉菌檢出率均降低。見表2。

2.3A3培養(yǎng)基檢測(cè)霉菌 加入不同濃度吐溫80的A3培養(yǎng)基對(duì)霉菌總數(shù)的檢出率均高于A0培養(yǎng)基，添加0.15%吐溫80培養(yǎng)基的檢出率最高。見表3。

2.4優(yōu)選的培養(yǎng)基對(duì)不同藥品中霉菌的檢測(cè) 采用添加1.0%葡萄糖與0.15%吐溫80的A0培養(yǎng)基(A4)對(duì)6種藥品進(jìn)行霉菌總數(shù)檢測(cè)，每個(gè)稀釋度作3個(gè)平皿，培養(yǎng)3 d后觀察。結(jié)果表明，A4培養(yǎng)基對(duì)不同藥品中的霉菌的檢出率均有提高，平均高出25.08%。見表4。

表1 A1培養(yǎng)基對(duì)霉菌的檢出結(jié)果

表2 A2培養(yǎng)基檢測(cè)霉菌的結(jié)果

表3 A3培養(yǎng)基對(duì)霉菌總數(shù)的檢測(cè)結(jié)果

表4 A4與A0培養(yǎng)基檢測(cè)霉菌總數(shù)情況

3 討論

葡萄糖是最易被霉菌吸收利用的初始碳源，有利于霉菌的生長代謝。但含葡萄糖的培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后容易產(chǎn)生有害色素，導(dǎo)致培養(yǎng)基成分變化，所以要分別滅菌后再混合[3]。葡萄糖可以過濾除菌，也可以在115℃、15 min滅菌。本研究試驗(yàn)證實(shí)，添加1.0%葡萄糖的培養(yǎng)基其霉菌檢出率最高，而添加1.5%、2.0%葡萄糖的培養(yǎng)基其檢出率反而降低，說明只是在適當(dāng)增加C/N比時(shí)才有利于霉菌的生長。

自然界霉菌孢子常多個(gè)聚集在一起，要想得到更準(zhǔn)確結(jié)果，就必須使其充分分散。吐溫80是一種非離子型的表面活性劑，可有效加強(qiáng)液體的流動(dòng)性從而使培養(yǎng)基中的物質(zhì)分布均勻，降低兩相界面張力，使孢子在培養(yǎng)基中充分分散，減少菌落聚集，從而大大提高霉菌菌落檢出率。本研究結(jié)果證實(shí)，添加0.15%吐溫80的培養(yǎng)基上生長出的霉菌菌落小而且分布均勻，易計(jì)數(shù)，其檢出率最高。

總之，提高霉菌檢出率，一定要優(yōu)選出適宜的改良培養(yǎng)基，不但要合理搭配培養(yǎng)基的成分，還要嚴(yán)格按照藥品微生物限度檢查的操作規(guī)范進(jìn)行，才能使霉菌菌落更清晰易檢，從而提高檢出率。