超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定癲癇患者血清4種氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的應(yīng)用研究

漆明，王宇，李春，黃翔

(1.廣西腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 柳州 545005；2. 廣西腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣西 柳州 545005)

小分子氨基酸：谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)和γ-氨基丁酸(GABA)是人體內(nèi)重要的氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)，在人體內(nèi)屬低水平游離氨基酸，參與維系腦部的血液循環(huán)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的功能起著重要的介導(dǎo)作用[1]。其中Glu、Asp是興奮性氨基酸，Gly、GABA是抑制性氨基酸。目前檢測(cè)此類(lèi)氨基酸的方法主要有柱后/柱前衍生反相高效液相色譜法(HPLC)、高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法(HPAEC-IPAD)及高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)[2]及高效毛細(xì)管電泳法[3]等方法。傳統(tǒng)的高效液相色譜法檢測(cè)血清低水平游離氨基酸需經(jīng)過(guò)衍生化處理及熒光檢測(cè)器才能完成測(cè)定，分離時(shí)間較長(zhǎng)、檢測(cè)限偏高、操作繁瑣。本研究采用島津臨床用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS)，在參考文獻(xiàn)[4]的基礎(chǔ)上，建立了人血清中這4種氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的快速測(cè)定方法，檢測(cè)了80例癲癇患者及30例健康正常人血清Glu、Asp、Gly和GABA含量，報(bào)道如下：

1 對(duì)象和方法

1.1 入組樣本選擇 選取2018年8月—2019年11月本院神經(jīng)內(nèi)科門(mén)診或住院病人中符合2010年國(guó)際癲癇聯(lián)盟診斷標(biāo)準(zhǔn)及分類(lèi)方案的癲癇病患者80例為研究組，男37例，女43例，年齡18～74歲，平均年齡(37.80±12.60)歲。排除嚴(yán)重心、肝、腎等器質(zhì)性疾病、腦血管疾病、急性腦外傷、失語(yǔ)、癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重器質(zhì)性病變和精神障礙患者。另選取同期健康體檢者30例作為對(duì)照組，男16例，女14例，平均年齡(37.80±9.10)歲。研究組與對(duì)照組性別構(gòu)成比及年齡相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有研究對(duì)象及對(duì)照組均志愿加入研究并簽署知情同意書(shū)，本研究獲本單位醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清樣品采集及前處理 采集研究及對(duì)照組空腹靜脈血5～6 ml，離心10 min(3000 r/min)，吸取血清于2 ml凍存管中，低溫(-70℃)保存；檢測(cè)時(shí)將血清樣品室溫解凍，離心10 min(3000 r/min)，吸取100 μl離心后的上清液到新的離心管中，加入300 μl甲醇乙腈去蛋白沉淀劑(乙腈∶甲醇=1∶1)，靜置3 min，渦旋2 min混勻，離心10 min(13000 r/min)，取120 μl上清液，按1.4～1.5色譜及質(zhì)譜條件分析，進(jìn)樣體積1 μl。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)貯備液制備 本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為質(zhì)譜純。Glu、Asp、Gly和GABA購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為德國(guó)默克(Merck)公司生產(chǎn)。準(zhǔn)確稱(chēng)取4種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品各20 mg，分別置于50 ml容量瓶中，用0.1 mol/L乙酸定容至刻度，配制成400 μg/ml的氨基酸儲(chǔ)備溶液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 UHPLC-MS色譜條件 島津LabSolutions Ver.5.91色譜工作站；LC-20ADXR CL×2(輸液泵)；DGU-20A5R CL(在線脫氣機(jī))；SIL-20ACXR CL(自動(dòng)進(jìn)樣器)；CTO-20ACXR CL(柱溫箱)；CBM-20A CL 系統(tǒng)控制器。色譜柱采用氨基酸專(zhuān)用色譜柱(島津)；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈；流速：0.35 ml/min；柱溫：40℃；洗脫方式：采用等度洗脫，B相濃度為10%；進(jìn)樣體積1 μl。

1.5 UHPLC-MS質(zhì)譜條件 分析儀器：三重四極桿質(zhì)譜儀(LCMS-8040 CL)；離子源：離子噴霧離子化源正離子化模式(ESI+)；霧化氣流速：3.0 L/min；干燥氣流速：15.0 L/min；DL溫度：250℃；加熱模塊溫度：400℃；掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè) (MRM)；MRM 優(yōu)化參數(shù)：見(jiàn)表1。

表1 MRM參數(shù)

2 結(jié)果

2.1 出峰時(shí)間及MRM譜圖 標(biāo)準(zhǔn)品及血清4種氨基酸在1.5 min內(nèi)達(dá)到完全分離，峰形均呈良好對(duì)稱(chēng)性。各氨基酸的出峰時(shí)間依次為：Gly：0.985 min； Asp：1.020min； GABA：1.076 min；Glu：1.082 min；MS色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 4種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)分析MS色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、準(zhǔn)確度及定量下限分析將4種氨基酸貯備液用純水稀釋成濃度為10～4000 ng/ml若干梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2～1.3的條件及處理方法處理后上機(jī)進(jìn)樣分析。利用外標(biāo)法，以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，以氨基酸峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果顯示，4種氨基酸在線性濃度范圍內(nèi)線性相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)均在0.9970 以上；定量下限的確定：各取4種氨基酸3個(gè)濃度接近檢測(cè)限的樣本，每個(gè)濃度分為6份進(jìn)行處理，每份樣本重復(fù)測(cè)定3次，連續(xù)測(cè)定3個(gè)批次，分別評(píng)估每個(gè)濃度樣本的總精密度(CV)及其濃度測(cè)定均值與理論濃度的偏差，將CV≤20%，準(zhǔn)確度<15的最低濃度樣本的測(cè)定均值作為本方法的定量下限。4種氨基酸的檢測(cè)限分別為7.00～14.00 ng/ml ，其線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和準(zhǔn)確度，見(jiàn)表2。

表2 4種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)

2.3 回收率與精密度實(shí)驗(yàn) 在已知本底值的混合體檢血清樣品中加入濃度分別為40 ng/ml、400 ng/ml、4000 ng/ml的低、中、高各6份混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3血清樣品前處理方法處理并測(cè)定，以測(cè)得值與加入值的比值計(jì)算回收率；同時(shí)在1 d內(nèi)重復(fù)6次和2周內(nèi)重復(fù)6次測(cè)定濃度，計(jì)算日內(nèi)、日間誤差和回收率。4種氨基酸的加標(biāo)回收率在87.30%～122.40%之間，RSD<5%；日內(nèi)精密度(RSD)均≤7.94%，日間精密度精密度(RSD)均≤9.61%。表明各氨基酸在本檢測(cè)方法下準(zhǔn)確度高、檢測(cè)精密度良好，符合生物樣本檢測(cè)要求。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4種氨基酸的回收率及精密度結(jié)果 (n=6)

2.4 穩(wěn)定性分析 配制低、中、高濃度的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液若干份(濃度為40 ng/ml、400 ng/ml、8000 ng/ml)，于室溫下放置0 h、4 h、8 h、12 h及24 h后進(jìn)樣分析；同時(shí)將低、中、高濃度的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液反復(fù)凍融及低溫(-70℃)凍存1個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月后，分別進(jìn)樣分析，觀察幾種狀態(tài)下檢測(cè)值的相對(duì)誤差(RE)及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)，4種氨基酸(RSD)均<8%，結(jié)果樣品在-70℃條件下冷凍放置1年內(nèi)穩(wěn)定，長(zhǎng)期穩(wěn)定性好，可以滿足科研標(biāo)本長(zhǎng)期保存及檢測(cè)要求。見(jiàn)表4。

表4 4種氨基酸的穩(wěn)定性結(jié)果

2.5 兩組樣本血清氨基酸含量分析 按前述條件處理研究及對(duì)照組血清樣本，利用前述建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，癲癇組血漿Glu，Asp水平高于正常對(duì)照組(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Gly，GABA水平低于正常對(duì)照組(P<0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表5。

表5 研究組與對(duì)照組氨基酸測(cè)定結(jié)果比較 單位：ng/ml

3 討論

由于氨基酸的小分子特性，常用的柱后/柱前衍生反相高效液相色譜法測(cè)定血液中游離小分子氨基酸大多需經(jīng)過(guò)衍生化處理及配備熒光檢測(cè)器才能完成。此類(lèi)方法由于衍生化反應(yīng)產(chǎn)物不穩(wěn)定，易受反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間以及光線等因素影響，需精確控制反應(yīng)條件，且梯度洗脫操作繁瑣費(fèi)時(shí)，平衡時(shí)間長(zhǎng)，基線容易漂移，重現(xiàn)性差，這為臨床測(cè)定和科研帶來(lái)極大的不便。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法整合了高效液相色譜儀對(duì)復(fù)雜樣本的高分離性能與質(zhì)譜儀的高靈敏性、高選擇性等優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于科研及臨床檢驗(yàn)各領(lǐng)域中，如藥物濃度監(jiān)測(cè)、新生兒遺傳代謝病篩查等醫(yī)學(xué)項(xiàng)目檢測(cè)，尤其在生物小分子物質(zhì)的定量檢測(cè)上應(yīng)用越來(lái)越廣泛[4]。本研究采用島津臨床用UHPLC-MS系統(tǒng)，檢測(cè)癲癇患者血清中小分子氨基酸：Glu、Asp、Gly和GABA含量，對(duì)臨床血清標(biāo)本的前處理方法、色譜流動(dòng)相及質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，取得了比較滿意的檢測(cè)效果。與童天穎等[5]采用的以水-甲醇分為A、B流動(dòng)相、梯度洗脫方法不同，本方法是以0.1%甲酸水溶液(A相)和0.1%甲酸乙腈溶液(B相)為流動(dòng)相、等度洗脫檢測(cè)血清中氨基酸，4種氨基酸在1.5 min內(nèi)達(dá)到完全分離。氨基酸的完全分離時(shí)間優(yōu)于黃曉[6]及吳強(qiáng)恩等[7]采用的反相高效液相色譜熒光法檢測(cè)的35 min及18 min。本實(shí)驗(yàn)A相中加入0.1%甲酸，能改善峰形、促進(jìn)氨基酸在色譜柱上的保留。0.1%甲酸作用是提供質(zhì)子，降低定量限，增強(qiáng)正離子化信號(hào)，提高氨基酸色譜峰信噪比，使樣本達(dá)到最佳定量分析效果；但甲酸加入的濃度過(guò)高會(huì)對(duì)質(zhì)譜的負(fù)離子掃描有影響，抑制質(zhì)譜信號(hào)，因此甲酸用量一定要合適。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察：若采用乙腈-水作為流動(dòng)相，氨基酸的峰形會(huì)產(chǎn)生寬峰及拖尾等現(xiàn)象。當(dāng)A流動(dòng)相比例為90%，B流動(dòng)相比例為10%時(shí)，各氨基酸檢測(cè)靈敏度能達(dá)到最強(qiáng)，各氨基酸峰形態(tài)呈良好對(duì)稱(chēng)性，各峰無(wú)拖尾、交叉等現(xiàn)象。本方法線性關(guān)系良好：在10～4000 ng/ml范圍內(nèi)4種氨基酸濃度的相關(guān)系數(shù)均在0.997以上，4種氨基酸的檢測(cè)下限可達(dá)到10ng/ml左右，高于宣柳等[3]采用的高效毛細(xì)管電泳法及黃曉[6]采用的改良柱前衍生高效液相色譜法。本方法準(zhǔn)確度為90.50%～107.40%，平均回收率為87.30%～122.40%，日內(nèi)和日間精密度分別為3.68%～7.94%和4.71%～9.61%，進(jìn)樣精密度好，長(zhǎng)期穩(wěn)定性好。本法專(zhuān)屬性強(qiáng)，前處理簡(jiǎn)便，無(wú)需衍生化處理，分析速度快，能在1.5 min之內(nèi)測(cè)出4種氨基酸濃度，適合臨床大樣本研究神經(jīng)、精神類(lèi)疾病患者血漿氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量變化。

癲癇是神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)病，流行病學(xué)顯示[8]：目前我國(guó)約有900萬(wàn)人患癲癇，患病率為 0.90‰～4.80‰；與此同時(shí)，有30%～40%癲癇患者伴有認(rèn)知功能障礙[9]，因此，對(duì)癲癇及其認(rèn)知功能障礙的早期診斷和及時(shí)治療對(duì)改善患者預(yù)后有重要意義。 癲癇發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，興奮性和抑制性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的不平衡是導(dǎo)致癲癇發(fā)作的原因之一。張赟等[10]認(rèn)為：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，與癲癇的發(fā)作密切相關(guān)的 Glu 與 GABA，分別是最重要的興奮性與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。藺建文等[11]研究發(fā)現(xiàn)：Glu 是誘發(fā)癲癇發(fā)作的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，而 GABA有阻抑中樞神經(jīng)元異常放電的作用，可以減緩癲癇的發(fā)作。李姊瑤等[12]在對(duì)癲癇患兒使用丙戊酸鈉(VPA)治療前后血液中氨基酸變化情況，發(fā)現(xiàn)其血液氨基酸Glu、Gly和Lys等明顯高于對(duì)照組，定期檢查患兒血液氨基酸的變化情況，對(duì)臨床治療癲癇具有一定的意義。研究表明[13]：癲癇的發(fā)生及局腦缺血再灌注后大量神經(jīng)元死亡等，都與中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性及抑制性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)失衡相關(guān)。凌衛(wèi)明[14]發(fā)現(xiàn)癲癇患者血漿 Glu、Asp 高于健康人群，Gly 低于健康人群。劉偉等[15]發(fā)現(xiàn)特發(fā)性癲癇患者腦脊液中GABA 含量低于正常對(duì)照者，Glu 高于正常對(duì)照者。血清及腦組織中氨基酸絕對(duì)水平之間存在一定差異，血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)能將血漿氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)至大腦，同時(shí)又能將腦中氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)(GABA、Asp 和 Gly 等)逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)至血液，使靜脈血與腦脊液內(nèi)氨基酸水平保持一定的相關(guān)性。導(dǎo)致癲癇患者血清Gly、GABA濃度降低的原因比較復(fù)雜，可能由以下幾個(gè)方面因素單獨(dú)或疊加影響所致：①外周氨基酸合成功能降低；②中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平降低而導(dǎo)致向外周轉(zhuǎn)運(yùn)減少；③BBB轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的改變導(dǎo)致向外轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸水平降低；而血清興奮性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)Glu、Asp水平增高的原因則與之相反。秦晉等[16]認(rèn)為：神經(jīng)遞質(zhì)是影響癲癇患者的認(rèn)知功能障礙的重要因素。癲癇發(fā)作時(shí)干擾神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，引起興奮性與抑制性遞質(zhì)失衡，其中，谷氨酸是重要的興奮性中樞神經(jīng)遞質(zhì)，過(guò)量的谷氨酸可通過(guò)結(jié)合谷氨酸受體激活神經(jīng)毒性導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。Glu、Asp 和GABA、Gly作為神經(jīng)調(diào)控的重要介質(zhì)，參與了大腦神經(jīng)調(diào)節(jié)活動(dòng)，與癲癇的發(fā)展發(fā)生及智力改變有密切關(guān)系[1]。興奮性谷氨酸和GABA 能抑制神經(jīng)傳遞的失調(diào)，會(huì)導(dǎo)致癲癇的發(fā)作，其潛在的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[17]。本研究依托島津臨床用UHPLC-MS檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)了80例癲癇患者及30例健康正常人血清Glu、Asp、Gly和GABA含量，發(fā)現(xiàn)癲癇組血清Glu、Asp高于對(duì)照組，Gly、GABA低于對(duì)照組，與前述凌衛(wèi)明等[14]的研究結(jié)論相似，說(shuō)明氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)參與癲癇的發(fā)病機(jī)制，血清氨基酸水平可成為反映腦內(nèi)氨基酸水平而成為癲癇發(fā)病的生物標(biāo)志物之一。本研究從血清學(xué)角度，檢測(cè)癲癇患者血清中Glu、Asp、Gly和GABA濃度，為癲癇的臨床診治提供快速的血清學(xué)參考依據(jù)。