環(huán)狀RNA在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的研究新進展

郭鵬威，尤燕舞

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種好發(fā)于育齡期婦女，可累及腎臟、血液、神經(jīng)、皮膚等多器官及系統(tǒng)的自身免疫疾病。最近研究表明，環(huán)狀RNA(circRNA)廣泛參與了自身免疫疾病如SLE、類風濕性關節(jié)炎等自身免疫疾病的發(fā)病過程，在成人SLE患者的血漿、全血、外周血單個核細胞(PBMCs)或腎臟等組織中circRNA 表達異常[1]，另外在兒童SLE患者中circRNA表達也異常[2]。本文將circRNA在SLE患者中表達的研究新進展進行綜述。

1 circRNA的功能及分類

circRNA是廣泛并穩(wěn)定存在于真核細胞中的一類不具有5′末端帽子和3′末端 poly(A)尾巴，并以共價鍵形成封閉環(huán)狀結構的新型內(nèi)源性非編碼 RNA 分子[3-4]。這些特性賦予circRNA對核糖核酸酶(RNase)具有抗性，其半衰期超過48 h，故其較為穩(wěn)定[5]。circRNA主要存在于細胞質(zhì)中，circRNA的轉錄主要來自外顯子、內(nèi)含子、未翻譯區(qū)或基因間區(qū)[6-7]。其通常由2～4個外顯子組成，保留或不保留內(nèi)含子。根據(jù)circRNA所包含的序列，circRNA可分為4類:①僅由外顯子組成的外顯子RNA(ecircRNAs)[5]；②內(nèi)含子環(huán)狀RNA(intronic circRNA)[7]；③同時包含外顯子和內(nèi)含子序列的環(huán)狀RNA(EIciRNAs)[8]； ④來源于tRNA的環(huán)狀RNA(TriRNA)[9]。circRNA 在自身免疫疾病中發(fā)揮著微小RNA(miRNA)分子海綿或競爭性內(nèi)源 RNA(ceRNA)、與 RNA 結合蛋白(RBP)相互作用、翻譯蛋白等生物學功能，影響著免疫細胞的生物學行為，從而促進或抑制自身免疫疾病的發(fā)生、發(fā)展，有望成為SLE治療靶點。

2 circRNA在SLE患者外周血單個核細胞(PBMCs)中的表達

Luo Q等[10]研究表明，對50例新發(fā)SLE患者、24例新發(fā)類風濕關節(jié)炎(RA)患者、24例新發(fā)強直性脊柱炎(AS)患者和45例年齡性別相匹配的健康對照組(HC)的PBMCs的研究結果證實，SLE患者PBMCs的hsa_circ_0000479、hsa_circ_0082688、hsa_circ_0082689升高，而hsa_circ_0000175明顯低于RA患者、AS患者和HC。這些已證實的差異表達circRNA的相關分析顯示，hsa_circ_0000479與C3水平及處理相關，hsa_circ_0082688與抗dsDNA水平相關，hsa_circ_0082689與抗dsDNA水平、抗核小體頻率及處理相關。通過對受試者工作特征曲線分析，hsa_circ_0000479在鑒別SLE與AS、RA、HC有顯著價值。hsa_circ_0000479-抗dsDNA組合模型能有效區(qū)分SLE組和對照組(RA+AS+HC)，敏感性為86.00%(43/50)，特異性為100.00%(93/93)，準確性為95.10%(136/143)，研究結果提示，PBMCs中的hsa_circ_0000479和hsa_circ_0000479-抗dsDNA組合模型可能作為SLE診斷和療效評估的潛在生物標志物。

Miao Q等[11]研究提示，circPTPN22的親本基因為蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22 (protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22，PTPN22)，SLE患者circPTPN22的下調(diào)與SLE疾病活動指數(shù)(SLEDAI)評分呈強負相關，circPTPN22與誘發(fā)SLE的免疫調(diào)節(jié)相關的miRNAs和mRNA存在相關性；SLEDAI評分較高的患者circPTPN22表達水平較低，長期激素治療可顯著提高circPTPN22水平，ROC分析提示circPTPN22對SLE具有良好的診斷價值，該研究提示SLE患者的環(huán)狀RNA表達與健康對照組相比存在異常，circPTPN22可作為SLE的診斷和評估病情嚴重程度指標。

Wang X等[12]發(fā)現(xiàn)circIBTK表達在SLE患者中下調(diào)，并與SLE患者疾病活動指數(shù)(SLEDAI)評分、抗雙鏈DNA 和補體C3水平相關。然后miR-29b在SLE患者中表達上調(diào)，并與SLE患者SLEDAI評分、anti-dsDNA和補體C3水平相關。該研究表明，miR-29b可以誘導DNA去甲基化并激活AKT信號通路，而circIBTK可能通過與miR-29b結合逆轉SLE患者中miR-29b誘導的DNA去甲基化和AKT信號通路的激活。SLE患者中circIBTK下調(diào)，可能通過與miR-29b結合調(diào)節(jié)DNA去甲基化和AKT信號通路。circIBTK和miR-29也可以作為SLE的生物標志物和治療靶點。

Zhang CZ等[13]檢測18例診斷為SLE患者和10例健康對照者PBMCs中hsa_circ_0049224、has_circ_0049220和DNMT1的表達。該研究結果發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0049224和has_circ_0049220在健康對照組的表達均顯著高于未活動和活躍SLE患者。DNMT1的表達量與hsa_circ_0049224、has_circ_0049220的表達量呈正相關。此外，SLEDAI與hsa_circ_0049224和has_circ_0049220的表達呈負相關。該研究結果還發(fā)現(xiàn)這兩種環(huán)狀RNA與SLE的一些臨床特征有關。該研究結論為hsa_circ_0049224和has_circ_0049220可能參與SLE的發(fā)病過程，在診斷SLE中具有潛在的臨床價值。

3 circRNA在SLE患者血漿中的表達

Li HX等[14]研究提示，在SLE組及對照組血漿中，有207個circRNAs存在差異表達，其中有113個表達上調(diào)，94個表達下調(diào)。通過驗證實驗確定了4個circRNA，分別是:hsa:circ_102584、hsa:circ_400011、hsa:circ_101471和hsa:circ_100226，它們在SLE血漿中明確存在著異常調(diào)控，為SLE患者提供了潛在的生物標志物。

Zhang MY等[15]研究提示，與健康對照組相比，112個circRNAs在SLE血漿中被鑒定為表達異常；qRT-PCR結果顯示，與健康對照組相比，SLE患者血漿和PBMCs中hsa_circRNA_407176和hsa_circRNA_001308的表達均下降。hsa_circRNA_407176和hsa_circRNA_001308在血漿中的受試者工作特性(ROC)曲線下面積分別為0.599和0.662。hsa_circRNA_407176、hsa_circRNA_406567和hsa_circRNA_001308在PBMCs的ROC曲線下面積分別為0.806、0.744和0.722。該研究表明，血漿和PBMCs中的hsa_circRNA_407176和hsa_circRNA_001308可能是SLE的潛在生物標志物。

Ouyang QQ等[16]研究59例SLE患者(30例LN患者和29例無LN患者)、26例類風濕性關節(jié)炎(RA)患者和27例年齡和性別匹配的對照者中所選circRNA的變化。這項研究結果表明，LN患者的血漿circRNA_002453與無LN的SLE患者、RA患者和健康對照組相比顯著升高。與RA患者和健康對照組相比，SLE患者血漿circRNA_002453也被發(fā)現(xiàn)上調(diào)。在LN患者中，我們檢測到血漿circRNA_002453與疾病活性(包括C3、C4)和SLE疾病活性指數(shù)2000(SLEDAI-2k)評分之間無顯著相關性。而其表達水平與24 h蛋白尿和腎SLEDAI評分正相關。ROC分析顯示circRNA_002453血漿曲線下面積為0.906(95%CI0.838～0.974，P<0.001)，鑒別LN患者與對照組(無LN的SLE患者、RA患者和健康對照組)的敏感性為0.900，特異性為0.841。約登指數(shù)最高為0.741，最佳截斷值為0.001。該研究提示，LN患者血漿circRNA_002453水平升高與腎臟受累的嚴重程度相關，也可作為LN患者診斷的潛在生物標志物。

4 circRNA在SLE患者T細胞中的表達

Zhang CZ等[17]分離CD4+T細胞，利用circRNA芯片分析篩選CD4+T細胞中的候選circRNA；轉染hsa_circ_0012919靶向siRNA后，檢測DNMT1、CD11a和CD70的表達及CD11a和CD70的甲基化水平；hsa_circ_0012919的網(wǎng)絡分析采用生物信息學方法；采用熒光素酶報告基因檢測和FISH熒光原位雜交，檢測篩選哪些miRNA可以與hsa_circ_0012919結合。結果提示，SLE患者組有12個circRNA表達上調(diào)，2個circRNA表達下調(diào)，證實hsa_circ_0012919在健康對照人群與SLE患者之間存在顯著差異，并與SLE特征相關。下調(diào)hsa_circ_0012919，可以提高DNMT1的表達；降低CD70、CD11a的表達，可以逆轉SLE患者 CD4+T細胞中CD11a和CD70的DNA低甲基化，但下調(diào)DNMT1可以逆轉。該研究認為hsa_circ_0012919可以被認為是SLE的生物標志物，hsa_circ_0012919是miR-125a-3p的競爭性內(nèi)源性RNA (ceRNA)。

Li LJ等[18]通過人類circRNA芯片檢測了SLE患者和健康對照者T細胞中的circRNA表達譜，并在SLE患者中鑒定出127個差異表達的circRNA。通過定量PCR驗證hsa_circ_0045272在SLE 患者T細胞中下調(diào)。使用特定的慢病毒短發(fā)夾RNA生成hsa_circ_0045272敲除穩(wěn)定的Jurkat細胞，用于功能研究。流式細胞術分析顯示，hsa_circ_0045272基因表達下調(diào)顯著上調(diào)了Jurkat細胞的早期凋亡。同時，ELISA檢測結果顯示hsa_circ_0045272基因沉默顯著提高了活化Jurkat細胞產(chǎn)生白細胞介素2。然后，對hsa_circ_0045272進行了ceRNAs的預測，并驗證了兩個預測為ceRNAs的mRNAs的顯著下調(diào)，即NM_003466(PAX8)和NM_015177(DTX4)，但未驗證其對應蛋白。此外，雙熒光素酶報告基因檢測顯示hsa_circ_0045272與hsa_miR-6127結合。hsa_circ_0045272等異常circRNA在SLE中的意義值得進一步研究。

5 circRNA在SLE患者腎組織中的表達

Luan JJ等[19]研究提示在狼瘡腎炎(LN)患者中，miR-150與腎臟慢性指數(shù)呈正相關。采用6例未接受治療的女性Ⅳ型LN患者的腎組織和5例泌尿外科患者的正常腎組織進行circRNA測序。與正常對照組相比，LN組中鑒定出171個有2倍差異表達的circRNA。10個選定的circRNA通過real-time qPCR進行驗證，其中7個circRNAs與測序結果一樣顯著增加。circHLA-C與蛋白尿、腎病理活動性指數(shù)、新月體腎小球數(shù)量呈正相關。LN組的腎臟circHLA-C較正常對照組升高2.72倍，miR-150下降66% 。生物信息學分析預測miR-150受到circHLA-C的調(diào)控，顯示出circHLA-C和miR-150完全匹配的位點，LN患者腎臟miR-150與circHLA-C呈負相關趨勢。提示circHLA-C可能通過浸潤miR-150在LN發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

崔思婉[20]的研究提示，通過高通量測序，在LN腎組織中篩選到159個差異表達的circRNA，包括73個表達上調(diào)和86個表達下調(diào)的circRNA。其中hsa_circ_0007379、NR4A1 mRNA顯著下調(diào)，而miR-7977顯著上調(diào)。通過KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0007379/miR-7977/NR4A1調(diào)控網(wǎng)絡可能在與LN相關的PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway途徑上發(fā)揮作用。推測低表達的hsa_circ_0007379減弱與miR-7977的競爭性結合，下調(diào)NR4A1的表達，通過 PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway途徑影響LN的發(fā)病。通過qRT-PCR驗證hsa_circ_0007379、miR-7977、NR4A1 mRNA在結果顯示在腎組織中，與對照組相比hsa_circ_0007379表達水平下調(diào)、 NR4A1 mRNA表達水平下調(diào)、miR-7977表達水平上調(diào)；在全血中，與對照組相比NR4A1 mRNA表達水平下調(diào)、miR-7977表達水平上調(diào)，與腎組織中驗證的結果一致。hsa_circ_0007379、miR-7977、NR4A1 mRNA的表達水平與24 h尿總蛋白量、血肌酐、腎小球濾過率、AI、CI、SLEDAI評分、ESR無明顯相關性。NR4A1 mRNA的表達水平與血白細胞、C3呈正相關。

Tian SY等[21]研究應用環(huán)狀RNA (circRNA)芯片檢測兩組同年齡NZB/W F1雌性重癥和輕度LN小鼠的腎小球中表達差異的circRNA，并通RT-qPCR檢測證實。研究提示在重度LN中獲得116個差異表達的circRNAs，其中41個上調(diào)，75個下調(diào)，其中12個經(jīng)RT-qPCR證實。重度和輕度腎小球LN小鼠的mmu_circRNA_34428表達差異最大。結果表明，mmu_circRNA_34428在LN的發(fā)生過程中起重要作用。

6 circRNA在SLE兒童患者中的表達

Li SP等[2]比較SLE患兒和健康兒童，發(fā)現(xiàn)有348個circRNA和1162個mRNA表達差異。通過使用基因co-expression網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)307對匹配的circRNA-mRNA中有124對存在差異表達(74個circRNA上調(diào)，50個circRNA下調(diào))和142個差異表達mRNA(83個 mRNA上調(diào)，59個 mRNA表達下調(diào))。內(nèi)源性RNA(ceRNA)競爭網(wǎng)絡包括42個差異表達的circRNA、41個差異表達的mRNA和71個預測miRNA。SLE患兒中hsa_circ_0021372和hsa_circ_0075699的水平與SLE患兒中C3和C4水平相關。hsa_circ_0057762水平與SLEDAI-2k評分呈正相關。circRNAs的ROC曲線顯示，hsa_circ_0057762水平和hsa_circ_0003090水平可以區(qū)分SLE患者與健康對照人群。

7 circRNA在SLE患者全血中的表達

羅清等[22]研究表明，在對比SLE與健康對照組和其他自身免疫疾病患者中，結果發(fā)現(xiàn)SLE患者全血環(huán)狀 RNA hsa_circ_0002715 表達水平均高于健康對照者和非SLE患者，SLE患者全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達水平與補體3、補體4、白細胞數(shù)量、血紅蛋白、血小板數(shù)量呈負相關，與抗雙鏈 DNA抗體呈正相關，抗核小體陽性的SLE患者其全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715表達水平高于陰性者。SLE 患者和所有對照者(非SLE患者和健康對照者)全血環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715 AUC為0.701，敏感性為51.32%，特異性為80.17%。circRNA hsa _ circ _0002715對SLE的診斷敏感性高于 anti-dsDNA，且聯(lián)合環(huán)狀RNA hsa_circ_0002715-anti-dsDNA對SLE的診斷效能升高。SLE患者全血circRNA hsa_circ_0002715的表達明顯上調(diào)，且與SLE患者的疾病活動性和血液系統(tǒng)受累嚴重程度密切相關，聯(lián)合hsa_circ_0002715-anti-dsDNA可作為SLE的潛在診斷及鑒別診斷標志物。

8 小結

在SLE患者血漿、PBMCs或腎臟等組織中的circRNA表達異常，另外在兒童SLE患者中表達也存在異常，而且某些circRNA與SLE臨床指標相關。因此隨著研究的不斷深入，相信SLE患者體內(nèi)circRNA測定將有可能成為早期診斷及評估狼瘡的病情進展及預后的一個新手段，同時為研究新的靶向治療藥物提供依據(jù)。但是SLE患者體液如尿液、腹水或胸水等是否有合適的診斷相關的circRNA，尚需要進一步研究，且當前已有的成果仍需深入研究，早日應用于臨床，為SLE的診斷及治療提供幫助。