乳源β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠的抗衰老作用研究

王珊珊，鞠曉云，范乃兵，卞勇，閆靜杰

（1.南京中醫(yī)藥大學，南京 210023；2.南京郵電大學，南京 210095）

0 引 言

自然衰老是所有生物體自發(fā)的、必經(jīng)的復雜過程，自然衰老導致的人口老齡化問題已成為全球性問題，世界上絕大多數(shù)國家的老齡化問題越來越明顯[1-2]。老齡化導致慢性疾病發(fā)病率增加的問題使得衰老研究成為生命科學領域的重大問題。目前，國內(nèi)外學者提出多種關于機體衰老學說，但是最具代表性的是Harman在1956年提出的自由基學說[3-4]。該學說認為，機體內(nèi)抗氧化酶類活性會隨著年齡的增長而下降，導致機體清除自由基的能力下降，從而導致機體內(nèi)自由基堆積；過量的自由基引起細胞代謝紊亂以致機體多器官、多系統(tǒng)功能減退，進而導致疾病和衰老[5-6]。因此，提高體內(nèi)抗氧化酶類活性，清除過量的自由基已成為抗衰老研究的核心，而天然抗氧化劑以其安全、高效、無副作用等特點，正引起廣大學者的關注。

β-酪啡肽-7(β-casomorphin-7，β-CM-7)是1979年Brantl等[7]在牛乳的酪蛋白水解物中發(fā)現(xiàn)的小分子肽，其結構為Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile。β-酪啡肽-7能以完整肽段的形式被吸收，且不會引起機體的免疫排斥反應，加之其食物源的安全性，已越來越多地引起人們的重視[8]?，F(xiàn)有的研究表明β-酪啡肽-7不僅可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、降血糖、保護腎損傷等功能，還可以提高動物機體的抗氧化功能[9-10]。但是β-酪啡肽-7對自然衰老個體抗氧化應激是否有效果，特別是對自然衰老個體器官是否產(chǎn)生影響，目前相關研究甚少。本實驗以自然衰老小鼠作為研究對象，通過測定自然衰老小鼠臟器指數(shù)、血清以及心臟、肝臟、腎臟和腦中的 SOD、MDA、MAO及GSH-Px含量，觀察β-酪啡肽-7對老年小鼠的影響，以期為β-酪啡肽-7的開發(fā)利用奠定基礎。

1 材 料

1.1 試劑

β-酪啡肽-7購自Sigma公司(配制成濃度為10μmol/L溶液，-20℃保存)；超氧化物歧化酶（SOD）、單胺氧化酶（MAO）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、蛋白定量測試試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器

Polytron PT 1200CL手持式電動勻漿機，瑞士；Miklro-22R高速低溫離心機，德國Andreas Hettich GMBh8 CO.KG；Thermo FI-01620全波長酶標儀，美國；漩渦振蕩器，天津泰普公司；恒溫水浴鍋，上海榮華儀器公司；BS210S電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級雌雄各半C57小鼠60只，其中2月齡10只，16～18月齡40只，（北京維通利華提供，實驗動物生產(chǎn)許可證[號碼：SCXK（蘇）2001-0005]），實驗動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心屏障設施（實驗動物使用許可證[號碼：SYXK（蘇）2018-0001]）。

2 方 法

2.1 動物分組及處理

適應性飼養(yǎng)1個星期后，將10只2月齡C57小鼠作為青年對照組；40只16～18月齡C57小鼠隨機分為：老年模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只；連續(xù)喂養(yǎng)60 d，每星期稱量體重，并注意觀察動物毛色、精神狀態(tài)、飲食、飲水、糞便等情況，具體處理方法如表1所示。

表1 動物分組及處理

2.2 樣品采集

小鼠禁食24 h，眼眶采血，血液靜止30 min后，2 000 rpm離心20 min，吸取上清，-20℃保存?zhèn)溆?；采血后頸椎脫臼處死，取大腦、心臟、肝臟、腎臟等組織用生理鹽水漂洗并用濾紙吸干后稱其重量，液氮速凍后轉到-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 臟器系數(shù)測定

按文獻[11]方法計算小鼠的臟器系數(shù)，臟器指數(shù)計算公式如下：

臟器系數(shù)（%）=小鼠臟器濕重(g)/體重(g)×100

2.4 組織勻漿液的制備

稱取100 mg各組織放入1 mL裂解液中，冰上勻漿，12 000 rpm 4℃離心15 min，吸取上清液，棄去沉淀，二喹啉甲酸（Bicinchonininc Acid，BCA）法測定蛋白濃度，上清液-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 指標的測定

按試劑盒說明操作測定血清和心臟、肝臟、腎臟、大腦組織勻漿液的超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、單胺氧化酶（MAO）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）指標。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著性檢驗采用單因子方差分析（One way ANOVA，LSD）。所有數(shù)值以平均值±標準誤（Mean±SE）表示。

3 結 果

3.1 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠臟器指數(shù)的影響

如表2所示，與青年對照組相比，老年模型組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腦指數(shù)均呈下降趨勢，其中心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腦指數(shù)顯著下降(P＜0.05)；低劑量組、中劑量組和高劑量組的各臟器指數(shù)均高于老年模型組，其中隨著β-酪啡肽-7灌胃劑量的提高，各臟器指數(shù)越接近青年對照組的臟器指數(shù)，心臟指數(shù)、腦指數(shù)顯著高于模型老年組(P＜0.05)，肝臟指數(shù)極顯著高于老年模型組(P＜0.01)，提示灌胃β-酪啡肽-7組可能對改善自然衰老小鼠臟器指數(shù)有促進作用，并且隨著灌胃劑量的增加，改善效果越明顯。

表2 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠臟器指數(shù)的影響（n=10）

3.2 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠多種器官組織SOD的影響

由圖1看出，β-酪啡肽處理組能夠上調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的SOD活性。與青年對照組相比，低劑量β-酪啡肽-7能夠升高自然衰老小鼠血清和各臟器的SOD活性，但差異不顯著（P＞0.05）；中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著上調(diào)自然衰老小鼠肝臟中SOD活性（P＜0.05），高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著上調(diào)自然衰老小鼠血清和腦組織中的SOD活性（P＜0.05），極顯著上調(diào)肝臟組織中的SOD活性（P＜0.01）；提示灌胃β-酪啡肽-7對SOD活性的提高有一定促進作用，并且隨著灌胃劑量的增加，促進作用越顯著。

圖1 不同組別小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦中SOD活性比較（n=10）

3.3 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠多種器官組織MDA的影響

由圖2看出，老年模型組小鼠的血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MDA含量與青年對照組相比，均呈升高趨勢，其中血清、心臟、腎臟顯著升高（P＜0.05），肝臟和腦組織中MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。β-酪啡肽處理組能夠下調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MDA含量，低劑量β-酪啡肽-7能夠降低自然衰老小鼠血清和各臟器的MDA活性，但差異不顯著（P＞0.05）；中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠腦組織中MDA活性（P＜0.05），高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠血清、心臟、腎臟中的MDA活性（P＜0.05），極顯著降低肝臟和腦組織中的MDA活性（P＜0.01）；提示灌胃β-酪啡肽-7可降低自然衰老小鼠血清和各臟器中MDA的含量，并且隨著灌胃劑量的增加，降低作用越顯著。

圖2 不同組別小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦中MDA活性比較（n=10）

3.4 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠多種器官組織GSH-PX的影響

由圖3可看出，與青年小鼠相比，自然衰老小鼠的血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的GSH-Px活性降低。β-酪啡肽處理組能夠上調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的GSH-Px活性，其中中劑量和高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著上調(diào)血清和心臟組織中GSH-Px的活性（P＜0.05）；提示灌胃β-酪啡肽-7對GSH-Px活性的提高有一定促進作用，并且隨著灌胃劑量的增加，促進作用越顯著。

圖3 不同組別小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦中GSH-Px活性比較（n=10）

3.5 β-酪啡肽-7對自然衰老小鼠多種器官組織MAO的影響

圖4 不同組別小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦中MAO活性比較（n=10）

由圖4看出，老年模型組小鼠的血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MAO含量與青年對照組相比，均呈升高趨勢，其中心臟、腎臟和腦組織中MAO顯著升高（P＜0.05）；血清和肝臟中MAO含量極顯著升高（P＜0.01）。β-酪啡肽處理組能夠下調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MAO含量，低劑量β-酪啡肽-7能夠降低自然衰老小鼠血清和各臟器的MAO活性，但差異不顯著（P＞0.05）；中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠腦組織中MAO活性（P＜0.05），高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠血清、心臟、腎臟中的MAO活性（P＜0.05），極顯著降低肝臟和腦組織中的MDA活性（P＜0.01）；提示灌胃β-酪啡肽-7可降低自然衰老小鼠血清和各臟器中MAO的含量，并且隨著灌胃劑量的增加，降低作用越顯著。

4 討 論

機體受到代謝機能和神經(jīng)系統(tǒng)的共同調(diào)節(jié)，心臟、肝臟、腎臟是重要的代謝器官；腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要部分，因此，臟器指數(shù)可反映實驗動物的健康狀況，可通過心臟、肝臟、腎臟和腦指數(shù)來判斷實驗動物的機能變化和衰老狀況[12-13]。本實驗研究表明，與青年對照組相比，老年模型組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腦指數(shù)均呈下降趨勢，其中心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)和腦指數(shù)顯著下降(P＜0.05)，表明老年模型組動物處于自然衰老狀態(tài)；低劑量組、中劑量組和高劑量組的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和腦指數(shù)均高于老年模型組，其中隨著β-酪啡肽-7灌胃劑量的提高，各臟器指數(shù)越接近青年對照組的臟器指數(shù)，心臟指數(shù)、腦指數(shù)顯著高于模型老年組(P＜0.05)，肝臟指數(shù)極顯著高于老年模型組(P＜0.01)，提示灌胃β-酪啡肽-7組對改善自然衰老小鼠臟器指數(shù)有促進作用，并且隨著灌胃劑量的增加，改善效果越顯著。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是體內(nèi)清除自由基的關鍵酶，可以清除機體自由基，其活力可反映機體抗氧化的能力[14-15]；已有研究證實，SOD能清除超氧負離子自由基，從而保護機體細胞和組織不受自由基的損害，延緩機體衰老[16]。本實驗研究表明，β-酪啡肽處理組能夠上調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的SOD活性；中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著上調(diào)自然衰老小鼠肝臟中SOD活性（P＜0.05），高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著上調(diào)自然衰老小鼠血清和腦組織中的SOD活性（P＜0.05），極顯著上調(diào)肝臟組織中的SOD活性（P＜0.01），這與印虹等人[17]的研究結果一致；提示灌胃β-酪啡肽-7對SOD活性的提高有一定促進作用，并且隨著灌胃劑量的增加，β-酪啡肽-7抗氧化和抗衰老能力增強。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）是自由基攻擊生物體的降解產(chǎn)物，牛文民等人[18]研究表明MDA能夠影響細胞代謝、細胞結構的改變，并能促進細胞凋亡，抑制生物信息傳遞，因而測定MDA的量可反映組織和細胞損傷的程度。本研究表明，老年模型組小鼠的血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MDA含量與青年對照組相比，均呈升高趨勢，提示老年模型組小鼠的組織和細胞處于損傷和衰老狀態(tài)。灌胃β-酪啡肽-7能夠下調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的MDA含量；其中，中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠腦組織中MDA活性（P＜0.05），高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠血清、心臟、腎臟中的MDA活性（P＜0.05），極顯著降低肝臟和腦組織中的MDA活性（P＜0.01）；提示β-酪啡肽-7可減少自然衰老小鼠血清和各臟器中MDA的積累，降低MDA對機體的損傷作用。

谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathi-one Peroxidase，GSH-Px)是一種重要的廣泛存在于機體內(nèi)的過氧化物分解酶，可以清除細胞代謝過程中產(chǎn)生的羥自由基和過氧化物，減輕細胞膜的過氧化作用[19]。另有研究表明，GSH-Px還能促進H2O2分解，從而使過氧化物無法對細胞膜造成損害，因而可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)β-酪啡肽-7能夠上調(diào)自然衰老小鼠血清、心臟、肝臟、腎臟和腦組織中的GSH-Px活性，并且隨著灌胃劑量的增加，促進作用越顯著。

單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)是神經(jīng)遞質降解酶家族成員之一，主要存在于神經(jīng)膠質細胞內(nèi)，在神經(jīng)系統(tǒng)中主要調(diào)節(jié)單胺類遞質的含量，其低活性有利于保持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，對機體的抗氧化及抗衰老有促進作用[21-22]，本實驗通過對自然衰老小鼠灌胃β-酪啡肽-7發(fā)現(xiàn)，中劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠腦組織中MAO活性（P＜0.05），高劑量β-酪啡肽-7能夠顯著降低自然衰老小鼠血清、心臟、腎臟中的MAO活性（P＜0.05），極顯著降低肝臟和腦組織中的MAO活性（P＜0.01），說明β-酪啡肽-7能夠減少MAO的堆積，保護機體免受自由基損傷。

綜上，自然衰老可導致機體SOD、GSH-Px活性降低，MDA、MAO含量增高，自由基堆積，導致衰老進程加速，從而引發(fā)一系列疾病。本實驗通過灌胃β-酪啡肽-7，提高SOD、GSH-Px活性，降低了自然衰老小鼠MDA、MAO在體內(nèi)的堆積，可以有效緩解自然衰老引起的一系列疾病，延緩衰老。