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    青海酸奶中乳酸菌的分離鑒定及抑菌譜研究

    2021-05-12 14:07:36
    中國乳品工業(yè) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:原子力革蘭氏菌液

    (武警工程大學(xué) 裝備管理與保障學(xué)院,西安 710086)

    0 引 言

    青海高原酸奶中含有多種天然抑菌物質(zhì),具有維持腸道菌群平衡,提高機(jī)體免疫力,促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收等功能[1-6]。產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌來源非常廣泛[7-8]。本試驗(yàn)以我國部分地區(qū)高原自然發(fā)酵酸奶為試驗(yàn)材料,通過高效的定向篩選方法篩選乳酸菌素的產(chǎn)生菌株,對其發(fā)酵液生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究,并對篩選得到的菌株進(jìn)行了個(gè)體形態(tài)、常規(guī)生理生化鑒定[9-12]及16SrDNA測序等系統(tǒng)的鑒定試驗(yàn),以獲得抑菌活性高、遺傳特性穩(wěn)定的乳酸菌素產(chǎn)生菌,為實(shí)現(xiàn)食品防腐劑的廣譜、無毒化提供新的菌株資源。

    1 實(shí) 驗(yàn)

    1.1 材料與試劑

    材料:高原自然發(fā)酵酸奶,采自青海牧區(qū)牧民家中。

    菌種:金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、保加利亞乳桿菌、溶血鏈球菌、單增李斯特菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、番茄灰霉病菌、香蕉炭疽病、水稻紋枯病、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌、藤黃微球菌、酒精酵母、啤酒酵母、黑曲霉、黃曲霉菌,均由陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

    試劑:酵母膏、牛肉膏、瓊脂、蛋白胨等,均為生物試劑;硫酸鎂、葡萄糖、磷酸氫二鉀等,均為分析純;MRS培養(yǎng)基、M 17瓊脂培養(yǎng)基、改良的M 17G培養(yǎng)基,按文獻(xiàn)[5,17]進(jìn)行配制。PCR反應(yīng)所需藥品、PCR引物、PCR基因測序等委托上海生工生物工程有限公司完成。

    1.2 儀器設(shè)備

    高壓蒸汽滅菌鍋,北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司;生物潔凈工作臺,蘇州蘇凈集團(tuán)安泰公司;水浴恒溫振蕩器,太倉市儀器設(shè)備廠;DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,上海琪特分析儀器有限公司;紫外分光光度計(jì),上海分析儀器總廠;CENTRIFUGE 5804R離心機(jī),EPPENDORF公司;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,江蘇國華電器有限公司;電泳儀,北京六一儀器廠;PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀,加拿大BBI公司;電子天平,北京賽多利斯天平有限公司;OLYMPUS BH 2顯微鏡,日本OLYMPUS公司;WET-SPM-9500J3原子力顯微鏡,日本島津公司;移液器,加拿大BBI公司;VITEK全自動(dòng)微生物檢測系統(tǒng),法國生物梅里埃公司;數(shù)碼相機(jī),日本佳能公司;革蘭氏陽性菌鑒定卡試驗(yàn)(GPI),法國生物梅里埃公司。

    1.3 方法

    1.3.1 菌株的定向分離[9]

    (1)乳酸鏈球菌素母液的配置。稱取100 mg乳酸鏈球菌素(原始效價(jià)為1 000 IU/mg),溶于20 mL 0.02 mol/L鹽酸溶液中,此時(shí)效價(jià)為5 000 IU/mg,使用前需經(jīng)孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾除菌。

    (2)菌株的分離。本研究51個(gè)菌株分離自青海高原自然發(fā)酵酸奶,分別取從不同采樣地采集的高原酸奶樣品,按1%接種量加入到含乳酸鏈球菌素和溴甲酚紫的M 17G液體培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)24 h,把M 17G液體培養(yǎng)物制成10-4、10-5、10-6稀釋度的菌懸液,分別吸取0.1 mL放入M 17固體分離培養(yǎng)基上,涂布,28℃培養(yǎng)24 h,挑選單菌落,在分離培養(yǎng)基上劃線,反復(fù)3次。

    (3)抑菌活性及抑菌譜測定。采用改進(jìn)濾紙片法[13-15],該方法直觀,能準(zhǔn)確反映抑菌效果。將保藏的金黃色葡萄球菌或其他細(xì)菌轉(zhuǎn)接至活化培養(yǎng)基,于37℃培養(yǎng)18 h,使菌體恢復(fù)生理活性。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對活化好的金黃色葡萄球菌菌液進(jìn)行計(jì)數(shù),用無菌水將菌液濃度調(diào)至106mL-1。將無菌濾紙片(d=6mm)放入乳酸菌發(fā)酵液中,浸泡30 min后取出濾紙片,貼于已涂布有濃度為106mL-1的金黃色葡萄球菌菌液的檢測平板上,置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),在37℃下培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈大小,取3次實(shí)驗(yàn)平均值。

    1.3.2 菌株的鑒定

    (1)形態(tài)學(xué)觀察。觀察菌落形態(tài),革蘭氏染色后于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)[12]。

    (2)原子力顯微鏡分子形貌觀察。將制備好的菌液用生理鹽水稀釋后涂于AFM專用載玻片上,自然干燥,采用日本島津公司的SPM 9500J3型原子力顯微鏡,室溫下大氣環(huán)境中對菌液的分子形態(tài)進(jìn)行掃描觀測。圖像均在Tapping模式下獲得,探針為Si3N4(微懸臂長:200μm,彈性系數(shù)0.12 N/m),原子力顯微鏡圖像的形態(tài)學(xué)特征(如高度、寬度等)均采用原子力顯微鏡附帶的軟件進(jìn)行分析。

    (3)生理生化鑒定。主要采用檸橄酸鹽利用試實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅(M.R)實(shí)驗(yàn)、v-p實(shí)驗(yàn)、)明膠液化實(shí)驗(yàn)、接觸酶實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵、產(chǎn)氨試驗(yàn)及糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)等對菌株進(jìn)行生理生化鑒定,具體方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)[16]。

    (4)16Sr DNA序列分析[14-15]

    1)DNA的提取。本研究使用上海生工生物技術(shù)公司提供的細(xì)菌基因組抽提試劑盒來提取DNA。

    2)DNA檢測。用含有0.5μg/mL EB的0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)下拍照,記錄結(jié)果。

    3)16SrDNA基因的PCR擴(kuò)增

    ①16SrDNA擴(kuò)增的引物。用于反應(yīng)的引物采用16SrDNA的PCR反應(yīng)的通用引物,引物的合成由上海生工生物技術(shù)公司完成。正向引物(P1):5'-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物(P2):5'-CTA CGGCTACCTTGTTACGA-3'。

    ②PCR反應(yīng)體系

    ③PCR擴(kuò)增條件。94℃預(yù)變性4 min,94℃變性1.5 min,53℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,共完成35個(gè)循環(huán)以后,72℃繼續(xù)延伸10 min,4℃保存。

    ④PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測。用含有0.5μg/m L EB的0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,在凝膠成像系統(tǒng)下拍照,記錄結(jié)果。

    ⑤16S rDNA序列分析和同源性比較。將Z103菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定,得到的測序結(jié)果通過BLAST在Gen-Bank+EMBL+DDBJ基因庫中進(jìn)行同源性比較,從中得到菌株的序列信息。

    (5)抑菌譜的測定。將供試菌種接種培養(yǎng)(細(xì)菌在37℃培養(yǎng)24 h,酵母菌和霉菌在28℃培養(yǎng)48~72 h)后,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板對活化好的菌液進(jìn)行計(jì)數(shù),用無菌水將菌液濃度調(diào)至106CFU/mL。用改進(jìn)濾紙片法測量抑菌圈大小。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌株的分離與篩選

    從青海高原酸奶中,采用定向分離乳鏈菌肽產(chǎn)生菌的方法:即在蔗糖作碳源和添加適當(dāng)乳鏈菌肽的改良M 17培養(yǎng)基上,以溴甲酚紫作指示劑,如一個(gè)菌株對乳鏈菌肽具有抗性,又能利用蔗糖,使菌落周圍培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色,很容易用肉眼識別。然后檢測該菌株是否產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。分離到51株使培養(yǎng)基變黃的菌株,其中Z 103菌株的穩(wěn)定性、抑菌性好,因此選為實(shí)驗(yàn)菌株,如表1和表2所示。

    2.2 菌株的鑒定

    2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

    將Z103菌株接種于改良的M 17G培養(yǎng)基上,35℃培養(yǎng)1 d后觀察菌落。菌落呈乳白色,隆起,外形光滑,濕潤,小白色顆粒沉淀,無菌膜、氣泡(圖1(a))。細(xì)菌革蘭氏染色陽性,球狀,無莢膜和芽孢(圖1(b))

    表1 初篩分離的菌株

    表2 菌株發(fā)酵產(chǎn)物效價(jià)測定

    圖1 Z103菌株菌落圖和Z103革蘭氏染色

    2.2.2 原子力顯微鏡觀察Z103菌株的分子形貌

    由圖2可以看出,在20.00μm×20.00μm的觀測范圍內(nèi)Z103菌株的分子圖像清晰、穩(wěn)定,結(jié)構(gòu)呈規(guī)則球形,形態(tài)飽滿,表面有很多突起。

    2.2.3 菌株的生理生化特征

    Z 103菌株常規(guī)生理生化鑒定結(jié)果如表3所示。

    圖2 原子力顯微鏡觀察Z103菌株

    表3 常規(guī)生理生化鑒定結(jié)果

    綜合菌株培養(yǎng)特征、個(gè)體形狀及生理生化特性鑒定結(jié)果,參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(1994)[16]、根據(jù)東秀珠主編《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》(2001)[17]和凌代文、東秀珠主編《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》(1999)[18],將Z103菌株初步鑒定為乳球菌屬(Lactococcus)中的乳酸乳球菌乳酸亞種(L.lactis subsp.Lactis)。

    2.2.4 Z 103菌株的16SrDNA序列分析

    (1)基因組DNA的提取結(jié)果?;蚪MDNA的提取結(jié)果如圖3所示。

    圖3 基因組DNA的提取

    (2)Z103菌株的16SrDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果。以菌株Z103的基因組DNA為模板,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增16S rDNA片段,得到瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果如圖4所示。

    圖4 16Sr DNA PCR擴(kuò)增

    (3)Z 103菌株的16SrDNA序列分析。Z103菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測定,測出Z103菌株的16SrRNA基因序列總長為1 329 bp,得到的測序結(jié)果如圖5所示。

    (4)BLAST同源性搜索與系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制。將16S rDNA PCR擴(kuò)增測得的序列,在GenBank+EMBL+DDBJ基因庫進(jìn)行同源性搜索,發(fā)現(xiàn)菌株Z103和Il1403、IL1403菌株的16S rDNA基因序列相似性達(dá)98.6%,在所有比較的菌株中相似性最高。而且,Z 103菌株的生理生化特征和Il1403、IL1403菌株的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征基本吻合,因此確定Z103菌株為乳酸乳球菌乳酸亞種的一種。

    綜合同源性比對結(jié)果和Il1403、IL1403菌株在細(xì)菌發(fā)育系統(tǒng)中的位置,從GeneBank中選擇8個(gè)菌株的16Sr DNA基因序列,通過Bioedit7.0.1和MEGA4.0.2軟件進(jìn)行多重比較后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖6。

    圖5 菌株Z103的16SrRNA基因序列

    圖6 基于16SrRNA基因序列的Z103菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

    2.2.5 Z 103菌株抑菌譜測定

    Z 103菌株抑菌譜測定結(jié)果如表4所示。由表4可以看出,Z 103菌株具有較廣的抑菌譜,對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌作為檢測指示菌。從表4中還可以看出,它對食源性致病菌,如金黃色葡萄球菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和溶血鏈球菌等具有很好的抑制作用;對食品腐敗菌,如藤黃微球菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、熒光假單胞菌等抑制作用較好,顯示了在食品防腐作用中的應(yīng)用潛力。但對霉菌和酵母菌沒有作用。對很多植物的致病菌如香蕉炭疽病、番茄灰霉病菌、水稻紋枯病、油菜菌核病菌等有很好的抑制作用,說明它在植物疾病的防治方面也有很好的作用。

    表4 乳酸菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜

    3 結(jié) 論

    本研究從青海高原酸奶中定向分離得到的乳酸菌經(jīng)形態(tài)學(xué)、原子力顯微鏡觀察、生理生化及分子生物學(xué)鑒定,確定為乳酸乳球菌乳酸亞種。采用改進(jìn)濾紙片法研究Z103菌株對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌作為檢測指示菌的抑菌性,通過實(shí)驗(yàn)可以看出,它不但對革蘭氏陽性菌有效,而且對部分革蘭氏陰性菌都有較強(qiáng)抑制作用,顯示了它在食品保鮮防腐和植物疾病的防治方面的應(yīng)用潛力。也說明其具有較廣譜的抗菌活性。

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