基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探討藥用昆蟲(chóng)琵琶甲的活性酚類成分與作用機(jī)制

羅建蓉 唐 策 李軒豪 張 藝

1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 67100；2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137

琵琶甲是云南民間常用的一種藥用昆蟲(chóng)，為鞘翅目擬步甲科昆蟲(chóng)喙尾琵琶甲(BlapsrynchopeteraFairmaire)的成蟲(chóng)，收載于《中國(guó)民族藥辭典》，具有清火解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、消腫止痛、熄風(fēng)定驚之功效[1]。云南民間常用于治療發(fā)燒、咳嗽、胃炎、疔瘡、腫瘤等疑難雜癥[2]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)琵琶甲具有抗癌、抗炎、抗氧化和抗菌等藥理作用[3]；琵琶甲含有酚類[4-5]、多巴胺衍生物[6]、生物堿[7]、環(huán)肽[8]、油脂等成分類型。本課題組前期從琵琶甲中分離得到多個(gè)酚類成分，并包括5個(gè)新酚類成分[5]。已報(bào)道的琵琶甲化學(xué)成分中，酚類數(shù)量最多，是琵琶甲的重要化學(xué)成分組成。從琵琶甲中發(fā)現(xiàn)的原兒茶酸、羥基酪醇和原兒茶醛，這些酚類也廣泛分布在果蔬、植物藥中，對(duì)其藥理作用研究較廣且深入，而對(duì)其他酚類，尤其從該昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的新酚類成分的藥理研究較為缺乏且不深入，大多局限在抗氧化、抗癌等體外活性初篩階段，其藥理作用機(jī)制尚不明確，限制了琵琶甲藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為研究中藥“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑”復(fù)雜體系治療復(fù)雜疾病提供很好的研究策略和方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在烏頭湯、六味地黃丸、清絡(luò)飲等中藥方劑的藥效物質(zhì)與作用機(jī)理的研究中得到有效運(yùn)用[9-10]。文章基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，以琵琶甲中酚類成分為研究對(duì)象，采用反向藥效團(tuán)匹配方法篩選潛在靶點(diǎn)蛋白和作用通路，通過(guò)構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)模型，探討琵琶甲可能發(fā)揮藥效的活性成分，預(yù)測(cè)其對(duì)多種疾病可能存在的藥理作用及作用機(jī)制，為琵琶甲酚類成分的研究提供參考和借鑒，并為昆蟲(chóng)琵琶甲藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)成分收集與類藥性分析 結(jié)合課題組前期研究及檢索CNKI、SciFinder、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)，提取琵琶甲的酚類成分，依據(jù)Lipinski 規(guī)則篩選其類藥性。Lipinski 規(guī)則是藥物分子設(shè)計(jì)和篩選中最常用的規(guī)則之一，如果化合物具有良好的吸收和滲透特性，應(yīng)滿足以下條件[11]：①氫鍵供體數(shù)目不大于5；②氫鍵受體數(shù)目不大于10；③脂水分配系數(shù)Clog P 不大于5；④相對(duì)分子質(zhì)量不大于500。

1.2 琵琶甲酚類成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 運(yùn)用反向分子對(duì)接服務(wù)器PharmMapper server，預(yù)測(cè)化合物或天然活性成分的潛在作用靶點(diǎn)[12]。將酚類結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PharmMapper服務(wù)器，獲取靶蛋白的PDB ID，靶點(diǎn)名稱(target name)和匹配值(Fit Score)。匹配值越高代表分子與靶點(diǎn)越匹配，故取匹配值前10位的蛋白作為該化合物的重要靶點(diǎn)蛋白。命名不規(guī)范的靶點(diǎn)需進(jìn)一步通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)獲得規(guī)范的蛋白編號(hào)，并獲得相應(yīng)的基因信息。

1.3 靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 將獲得的琵琶甲潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為Homo sapiens，獲得靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，通過(guò)Cytoscape 軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣鞣治?，篩選網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)，并將節(jié)點(diǎn)大小和顏色設(shè)置為反應(yīng)degree的大小，線條的粗細(xì)表示Combined score值的大小。

1.4 通路富集分析 將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入生物分子功能注釋系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)MAS 3.0，得到靶點(diǎn)的相關(guān)通路信息，并應(yīng)用KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路注釋分析和富集分析[13]。

1.5 琵琶甲主要酚類成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以篩選的25個(gè)酚類成分、潛在靶點(diǎn)和通路為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)(node)，導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建琵琶甲酚類成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 琵琶甲中酚類成分的收集與類藥性分析結(jié)果 共收集到25個(gè)類藥性符合Lipinski規(guī)則的活性酚類成分，化合物相關(guān)信息見(jiàn)表1。它們大多具有鄰二酚羥基的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其中化合物1～7、10～13是從昆蟲(chóng)琵琶甲中發(fā)現(xiàn)的新化合物；原兒茶酸、羥基酪醇和原兒茶醛則在天然產(chǎn)物中廣泛分布，且藥理活性多樣。

表1 琵琶甲中25個(gè)酚類化學(xué)成分基本信息

續(xù)表1

2.2 琵琶甲中酚類成分潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 經(jīng)反向藥效團(tuán)匹配實(shí)驗(yàn)預(yù)測(cè)得25個(gè)酚類成分的潛在作用靶點(diǎn)，各取匹配值前10的靶點(diǎn)，去掉重復(fù)靶點(diǎn)共得121個(gè)不同靶點(diǎn)。結(jié)果顯示琵琶甲中不同酚類成分既可作用于相同靶點(diǎn)，也可作用于不同靶點(diǎn)，其中CRABP2、GCK、FKBP1A、PCK1、NR3C1、MME、SULT2B1、FGG、MTAP、GSTT2B、SRC、HRAS、IL2、PNMT、IMPA1等靶點(diǎn)出現(xiàn)的頻率較高，是主要的潛在靶點(diǎn)蛋白群，它們?cè)诩?xì)胞生長(zhǎng)、死亡、細(xì)胞周期等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖1 靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 琵琶甲中酚類成分靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)分析 剔除獨(dú)立于網(wǎng)絡(luò)之外的靶標(biāo)蛋白，得酚類成分的靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，包含121個(gè)節(jié)點(diǎn)、437 條邊，平均度值為7.2，靶點(diǎn)的degree值越大，節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深，表示靶點(diǎn)重要性越大。SRC、HRAS、IL2、GART、AR、F2、KDR、RXRA、JAK2等靶點(diǎn)的度值較高，為連通網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的橋梁，在網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，靶點(diǎn)間相互作用、協(xié)同起效。

2.4 琵琶甲中酚類成分潛在靶點(diǎn)的通路注釋分析 121個(gè)潛在靶點(diǎn)投入MAS 3.0生物分子功能注釋系統(tǒng)，獲得72條P小于0.05的重要通路，并經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋分析，主要涉及疾病、免疫與炎癥、內(nèi)分泌、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝等相關(guān)信號(hào)通路，表2列舉出顯著性和頻率較高的42條相關(guān)通路信息。與人類疾病直接相關(guān)通路有12條，為前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌、急性髓系白血病、甲狀腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、原發(fā)性免疫缺陷、阿爾茨海默病和二型糖尿病，可見(jiàn)涉及腫瘤類疾病相關(guān)信號(hào)通路最多。涉及免疫與炎癥相關(guān)的重要通路主要有黏著斑、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、黏著連接、過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、花生四烯酸代謝、細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶、FcεRI、Jak-STAT信號(hào)通路等。與內(nèi)分泌相關(guān)的主要通路有胰島素信號(hào)通路、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、PPAR、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路、促性腺激素釋放激素信號(hào)通路等。與代謝相關(guān)通路中，嘌呤代謝、細(xì)胞色素P450介導(dǎo)的外源性物質(zhì)代謝、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解和糖異生、嘧啶代謝和谷胱甘肽代謝顯著性和頻數(shù)居前列。與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)主要通路為VEGF、表皮生長(zhǎng)因子受體、緊密連接、Jak-STAT等。

表2 琵琶甲主要酚類成分潛在作用通路

續(xù)表2

2.5 GO富集分析 琵琶甲中酚類成分潛在的121個(gè)靶點(diǎn)經(jīng) MAS 3.0系統(tǒng)進(jìn)行GO富集分析，獲取生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能的富集條目，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的功能分布。GO富集結(jié)果顯示，以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，靶點(diǎn)基因主要富集于364個(gè)生物學(xué)過(guò)程、243 種分子功能和68類細(xì)胞組成。其中，在生物學(xué)過(guò)程中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)水解、碳水化合物代謝、氧化應(yīng)激、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA依賴性所占比例較大；細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、胞質(zhì)溶膠、質(zhì)膜、膜、胞外區(qū)和線粒體在細(xì)胞組成中較重要；在分子功能中，轉(zhuǎn)移酶活性、蛋白結(jié)合、核苷酸結(jié)合、離子結(jié)合、ATP結(jié)合、鋅離子結(jié)合、水解酶活性和肽酶活性作用較突出。圖2分別列出了顯著性較高和比例較大的26種生物過(guò)程、20種細(xì)胞組成和23種分子功能。

圖2 琵琶甲酚類成分潛在靶點(diǎn)的GO富集分析

圖3 化合物-靶點(diǎn)-作用通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 琵琶甲酚類成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 25個(gè)酚類成分、121個(gè)靶點(diǎn)及72條信號(hào)通路共同組成網(wǎng)絡(luò)圖中的218個(gè)節(jié)點(diǎn)，成分、靶點(diǎn)、通路之間的相互作用組成了487條邊，具體網(wǎng)絡(luò)關(guān)系如圖3所示。分析結(jié)果表明，靶點(diǎn)GTP結(jié)合Harvey 大鼠肉瘤病毒癌基、糖原合成酶激酶3β、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、葡萄糖激酶、細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白、非受體型酪氨酸激酶、乙醇脫氫酶族3、3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1、及腦啡肽酶的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)聯(lián)接度排名前10位，為網(wǎng)絡(luò)的樞紐節(jié)點(diǎn)，表明它們可能是琵琶甲酚類成分的核心作用靶點(diǎn)。由圖3可見(jiàn)，琵琶甲中酚類成分、靶點(diǎn)、通路間存在復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，相同成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)連接多種成分，多條通路之間通過(guò)共有靶點(diǎn)連接存在協(xié)同作用，而非孤立的，體現(xiàn)出多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的網(wǎng)絡(luò)特征。

3 討論

藥用昆蟲(chóng)琵琶甲富含蛋白、多肽、油脂、多糖等大分子及氨基酸、核苷等營(yíng)養(yǎng)成分，而其豐富的小分子次生代謝產(chǎn)物所發(fā)揮的藥效不容忽視。盡管該昆蟲(chóng)的藥用價(jià)值獲得持續(xù)關(guān)注，但仍缺乏研究從整體上來(lái)闡釋其物質(zhì)基礎(chǔ)、藥效及其作用機(jī)制。目前對(duì)琵琶甲的藥理實(shí)驗(yàn)研究主要集中在對(duì)其總提物的抗腫瘤和抗炎活性方面[3]，且未深入研究相關(guān)作用機(jī)制。故本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和系統(tǒng)生物整體的角度探討琵琶甲主要酚類活性成分的藥理作用機(jī)制，并闡釋琵琶甲消炎、消包塊的傳統(tǒng)功效，預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)琵琶甲除對(duì)腫瘤、炎癥外，還對(duì)糖尿病、阿爾茨海默病等內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)方面疾病有治療作用，并預(yù)測(cè)得到相關(guān)重要靶點(diǎn)及通路，可為昆蟲(chóng)琵琶甲藥用價(jià)值的深入研究和開(kāi)發(fā)提供參考。

預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)琵琶甲酚類成分的121個(gè)主要作用靶點(diǎn)通過(guò)干預(yù)胰島素信號(hào)通路、嘌呤代謝、黏著斑、VEGF信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路等72條主要的相關(guān)疾病代謝通路發(fā)揮多種療效，反映琵琶甲酚類成分與靶點(diǎn)和通路間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。分析網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)有8條通路與人類疾病癌癥直接相關(guān)，分別為前列腺癌、小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌、急性髓系白血病、甲狀腺癌、膀胱癌和黑色素瘤，由此可見(jiàn)抗癌作用可能是琵琶甲主要酚類成分的最主要藥效作用之一。同時(shí)網(wǎng)絡(luò)還顯示在癌癥信號(hào)通路中靶點(diǎn)HRAS、PDPK1、RXRA、FGFR1、GSK3B、RARB、AR、GSTP1、NOS2、APAF1、PTK2、CTNNA1、PIM1、MMP、RARA、DAPK1等發(fā)揮重要作用，這對(duì)探討琵琶甲酚類成分的抗癌作用靶點(diǎn)及機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義。本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果琵琶甲中酚類成分的抗癌作用得到了實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，blapsins A、blapsins B、rynchopeterines B、rynchopeterines C、原兒茶酸、羥基酪醇、原兒茶醛等成分具有抗腫瘤活性。研究表明blapsins A和blapsins B具有抑制癌癥HIS14-3-3蛋白活性[14]，rynchopeterines B和rynchopeterines C能抑制癌細(xì)胞Caco-2 和A549 的生長(zhǎng)[5]。原兒茶酸能通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)，從而抑制A549、H3255和Calu-6三種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。原兒茶酸通過(guò)抑制Ras / Akt / NF-κB通路，進(jìn)而抑制黑色素瘤細(xì)胞在小鼠肝臟的轉(zhuǎn)移[16]。羥基酪醇通過(guò)抑制Akt / STAT3和NF-κB通路，抑制雄激素受體的應(yīng)答，從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖[17]。高劑量羥基酪醇可誘導(dǎo)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞系和濾泡甲狀腺癌細(xì)胞凋亡[18]。原兒茶醛能抑制人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。

此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)得琵琶甲酚類成分作用于Focal adhesion、VEGF、PPAR、Adherens junction、MAPK、Jak-STAT、ErbB、Fc epsilon RI、mTOR、T cell receptor、B cell receptor、Arachidonic acid metabolism等多條炎癥相關(guān)的重要通路，推測(cè)抗炎可能是琵琶甲酚類的重要藥效作用。實(shí)驗(yàn)研究表明，rynchopeterines B 能通過(guò)降低TNF-α、IL-1β、PGE2、COX-2和TGF-β1炎癥因子表達(dá)，發(fā)揮出顯著的抗大鼠慢性前列腺炎作用[20]。Blapsols A～D能夠抑制COX-2活性[6]。原兒茶酸可抑制LPS刺激角質(zhì)細(xì)胞的炎性介質(zhì)產(chǎn)生[21]；還能對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用[22]。原兒茶酸明顯抑制高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞(MCs)增殖，保護(hù)MCs免受高糖損傷[23]。但目前對(duì)琵琶甲酚類成分抗炎作用的研究報(bào)道還較少，有必要加強(qiáng)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證工作。

研究預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)琵琶甲中酚類成分主要通過(guò)胰島素、二型糖尿病、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、PPAR、mTOR、脂肪細(xì)胞因子、GnRH、黑素生成等信號(hào)通路，對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，羥基酪醇對(duì)氧化損傷相關(guān)疾病具有良好的防治效果，它能緩解血管內(nèi)皮功能障礙，減緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[24]。羥基酪醇能改善胰島素信號(hào)通路，并通過(guò)抑制mTOR改善胰島素抵抗；能降低糖尿病模型大鼠的空腹血糖，提高肝糖原含量；還能提高M(jìn)etS模型大鼠的糖耐量及胰島素敏感性[25]。原兒茶醛在抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心肌、抗血栓形成，神經(jīng)保護(hù)，抗纖維化等方面具有較好的藥理活性[26]。

研究結(jié)果還顯示，琵琶甲中酚類成分在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面主要涉及GSK3B、NOS2、 HRAS、BACE1、PPP1CC等重要靶點(diǎn)，和阿爾茨海默病、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、FcεRI、ErbB、MAPK等通路發(fā)揮作用。其中，GSK-3β參與阿爾茨海默病、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、細(xì)胞周期、磷酸化途徑、胰島素、癌癥、ErbB等信號(hào)通路，GSK-3β是tau激酶，在AD病程發(fā)展中的記憶障礙、小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥、tau蛋白磷酸化、炎性因子的釋放以及突觸丟失和神經(jīng)元死亡等方面，從多途徑發(fā)揮抗AD的作用[27]。研究發(fā)現(xiàn)，羥基酪醇能夠保護(hù)神經(jīng)元抵御Aβ造成的損傷，顯著降低神經(jīng)元內(nèi)氧化應(yīng)激水平；能有效抑制多巴胺氧化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可以輔助單胺氧化酶抑制劑用于帕金森病的治療[24]；原兒茶酸有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，可改善Aβ1-42誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞毒性，對(duì)阿爾茨海默病(AD)細(xì)胞模型有保護(hù)作用，對(duì)AD具有潛在的治療作用[28]；還能明顯降低帕金森模型大鼠血清TNF-α、MDA及IL-1β水平，提高SOD活性，對(duì)帕金森病引起的氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用[29]。其他酚類成分的相關(guān)藥理作用，仍需進(jìn)一步細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

昆蟲(chóng)琵琶甲中的酚類成分繁多，目前對(duì)其藥理作用的研究主要集中在原兒茶酸、羥基酪醇和原兒茶醛上，而對(duì)從該昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的11個(gè)新酚類成分rynchopeterines A～E、Blapsols A～D、blapsins A和blapsins B的研究甚少，局限在DPPH自由基清除作用，腫瘤細(xì)胞毒作用，對(duì)COX抑制活性等方面的體外活性測(cè)試上，它們的藥理作用及機(jī)制仍有待深入探討。本研究預(yù)測(cè)得這些酚類的相關(guān)藥理作用、靶點(diǎn)蛋白與作用通路將為進(jìn)一步深入藥理作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究提供參考。