艾灸及艾煙對載脂蛋白E基因敲除小鼠肺組織病理及血清IL-4、IFN-γ的影響*

劉津藝 和 蕊 趙百孝

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488）

動脈粥樣硬化是指呈黃色粥樣的脂質(zhì)沉積在血管壁，形成斑塊，導(dǎo)致動脈壁增厚變硬、管腔狹窄甚至閉塞，使重要器官缺血缺氧、功能障礙以至機(jī)體死亡，是心肌梗死、腦梗死、下肢缺血的主要病因［1］。經(jīng)過數(shù)十年的探索和研究，因其在病變發(fā)生發(fā)展過程中始終有各種炎癥細(xì)胞和大量炎癥介質(zhì)參與，目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)已普遍認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病。大量研究發(fā)現(xiàn)，艾灸療法通過其溫?zé)嵝?yīng)在動脈粥樣硬化過程中可抑制炎癥反應(yīng)，保護(hù)血管內(nèi)皮功能［2-5］。盡管諸多研究已經(jīng)證明了艾灸的有效性，但對于在艾灸過程中產(chǎn)生的艾煙的安全性仍存在一定爭議。載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠是近年來動脈粥樣硬化研究的經(jīng)典動物模型，能夠在自然膳食下形成嚴(yán)重的高脂血癥，并自發(fā)形成纖維斑塊和復(fù)合斑塊，病理學(xué)改變與人類極為相似，因此廣泛應(yīng)用于動脈粥樣硬化的研究中［6］。本實驗通過觀察艾灸及艾煙對ApoE-/-小鼠的一般情況和肺組織病理及血清白細(xì)胞介素-4（IL-4）、干擾素-γ（IFN-γ）的影響，評價艾灸及艾煙的安全性，并探討艾灸在動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)過程中的起效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 30只8周齡采用高脂飼料喂養(yǎng)［北京科澳協(xié)力飼料有限公司，飼料配方為78.85%基礎(chǔ)飼料+21%豬油+0.15%膽固醇，許可證號：京飼證（2018）06073］雄性ApoE-/-小鼠作為動脈粥樣硬化模型，10只同周齡相同遺傳背景的雄性非轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL/6作為空白對照。兩種小鼠均購自維通利華（北京）生物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量（22±2）g，許可證號：SCXK（京）2016-0006。所有小鼠均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心動物房單籠飼養(yǎng)，均可自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（22±2）℃，濕度為50%～60%左右。采用人工控制室內(nèi)照明，保持12 h光照（8∶00～20∶00）和黑暗（20∶00～次日8∶00）交替循環(huán)。

1.2 試劑儀器 小鼠IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒（Abbkine公司 KET7007 Lot：ATSJN0601）；小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒（Abbkine公司 KET7003 Lot：ATSJN0401）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司）；PBS緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；蘇木素染色液（武漢谷歌生物科技有限公司）；伊紅染色液（武漢谷歌生物科技有限公司）；特制細(xì)艾條（湖北蘄春李時珍醫(yī)學(xué)集團(tuán)，規(guī)格φ0.8 cm×15 cm）；小鼠固定器（北京冀諾泰有限公司）；光散射式數(shù)字粉塵測試儀（北京賓達(dá)綠創(chuàng)科技有限公司）；Thermo Multiskan MK3酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher公司）；石蠟切片機(jī)（LEICA RM 2235）；石蠟包埋機(jī)（LEICA EG 1160）；光學(xué)顯微鏡（Nikon E200）。

1.3 分組及處理 30只以高脂飼料喂養(yǎng)的雄性ApoE-/-小鼠［8周齡，體質(zhì)量（22±2）g］隨機(jī)分為模型組、艾灸組、艾煙組（每組10只）。10只以普通飼料喂養(yǎng)的雄性C57BL/6非轉(zhuǎn)基因小鼠［8周齡，體質(zhì)量（22±2）g］作為空白對照?？瞻捉M及模型組：采用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，每日抓取固定20 min，每周6 d，不予其他處理。

1.4 干預(yù)方法 艾灸組采用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位，固定器底板處的小孔可暴露胸腹部膻中穴，點燃艾條放置在小鼠胸部膻中穴下方2～3 cm處，每日施灸20 min，每周6 d。艾煙組釆用固定器固定小鼠頭、尾、四肢部位后，將固定器放入內(nèi)置有調(diào)試好的粉塵測試儀的玻璃缸中。在玻璃缸側(cè)方圓孔中插入點燃的艾條，每隔3 min用粉塵測試儀測試其濃度，使玻璃缸中的艾煙濃度控制在5～15 mg/m3之間，每日艾煙干預(yù)20 min，每周6 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 連續(xù)干預(yù)14周，末次干預(yù)后，禁食不禁水12 h。麻醉小鼠后，每組隨機(jī)選取6只采用眼球摘除取血法采集血液約1～1.5 mL，離心后將血清保存于-20℃冰箱中備用。嚴(yán)格根據(jù)說明書標(biāo)準(zhǔn)程序操作，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清中IL-4、IFN-γ的含量。剩余4只使用PBS緩沖液和4%多聚甲醛進(jìn)行灌注后，取出肺臟置于4%多聚甲醛溶液中，用于制備石蠟切片，HE染色觀察肺臟的病理改變。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。所用數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，對符合正態(tài)性分布且方差齊的計量數(shù)據(jù)，以（）表示，并采用單因素方差分析法；組間數(shù)據(jù)有顯著性差異時，再用LSD法進(jìn)行組間多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況 實驗干預(yù)14周后，未見小鼠死亡，存活率為100%?？瞻捉M小鼠外觀體征、行為活動、精神狀態(tài)等一般情況正常；模型組小鼠毛色晦暗且有脫落現(xiàn)象，體型肥胖，食欲逐漸下降，精神淡漠、反應(yīng)遲鈍。艾灸組小鼠毛色暗淡且有脫落現(xiàn)象，食欲、糞便未見異常，行為活動及精神狀態(tài)尚可。艾煙組小鼠毛發(fā)有脫落現(xiàn)象且顏色暗淡，食欲、糞便未見異常，精神狀態(tài)較安靜。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量變化 見表1。實驗開始前，各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。實驗第4周，模型組小鼠體質(zhì)量顯著高于空白組（P＜0.05），艾灸組和艾煙組小鼠體質(zhì)量與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。第8周，空白組與模型組小鼠體質(zhì)量增長均較快，但模型組體質(zhì)量仍高于空白組（P＜0.05）。艾灸組和艾煙組小鼠體質(zhì)量均低于模型組（P＜0.05）。第10周，模型組體質(zhì)量高于空白組（P＜0.05），艾灸組和艾煙組體質(zhì)量均低于模型組（P＜0.05）。第12周，模型組體質(zhì)量仍大于空白組（P＜0.05），與模型組比較，艾灸組和艾煙組體質(zhì)量較低（P＜0.05）。干預(yù)14周后，模型組體重有所降低，但仍高于空白組（P＜0.05），艾灸組與艾煙組體質(zhì)量仍低于模型組（P＜0.05）。各組小鼠體質(zhì)量為模型組＞空白組＞艾煙組＞艾灸組，有顯著差異。

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量比較（g，±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別空白組模型組艾灸組艾煙組實驗前23.30±0.37 23.44±0.57 23.53±0.32 23.49±0.45第4周26.09±1.00 27.64±0.74**25.80±1.23△△26.28±0.94△△第8周29.17±1.14 30.90±2.01*26.91±1.84△△28.43±1.28△△第10周30.93±2.01 32.70±1.15*28.82±1.83△△30.42±1.80△△第12周31.41±1.57 34.44±1.23**28.99±1.91△△31.95±1.70△△第14周32.00±1.29 33.64±1.70*29.55±2.05△△31.73±1.83△

2.2 各組小鼠肺組織的病理變化 空白組、模型組、艾灸組和艾煙組肺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，可見細(xì)支氣管以及終末細(xì)支氣管，立方形上皮細(xì)胞和扁平上皮細(xì)胞覆蓋支氣管管腔。Ⅰ型和Ⅱ型肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，扁平狀的Ⅰ型肺泡細(xì)胞數(shù)量較多，立方形的Ⅱ型肺泡細(xì)胞數(shù)量較少。各組均可見肺泡管、肺泡囊和肺泡，部分細(xì)支氣管可見不完整開口，為與肺泡連接處，肺泡為囊泡狀，呈多面體，無結(jié)節(jié)狀膨大。艾灸組和艾煙組未見明顯異常。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織（HE染色，20倍）

2.3 各組小鼠血清IL-4含量比較 見表2。干預(yù)14周后，各組小鼠血清中IL-4含量從少到多依次為模型組＜艾灸組＜空白組＜艾煙組。模型組小鼠血清中IL-4含量最低，與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；艾灸組和艾煙組小鼠血清中IL-4水平與模型組相比，含量均顯著升高（P＜0.01）。

表2 各組小鼠血清IL-4、IFN-γ含量比較（pg/mL，±s）

表2 各組小鼠血清IL-4、IFN-γ含量比較（pg/mL，±s）

組別空白組模型組艾灸組艾煙組n 6 6 6 6 IL-4 7.67±0.16 4.59±0.27**6.04±0.27△△8.26±0.75△△IFN-γ 6.95±0.93 13.14±1.32**4.53±0.76△△9.79±1.02△△

2.4 各組小鼠血清IFN-γ含量比較 見表2。干預(yù)14周后，各組小鼠血清中IFN-γ的含量從多到少的順序依次為模型組＞艾煙組＞空白組＞艾灸組。模型組小鼠血清中IFN-γ含量最高，與空白組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；艾灸組和艾煙組小鼠血清中IFN-γ水平與模型組相比，含量均顯著降低（P＜0.01）。

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，動脈粥樣硬化與“痰濕、氣滯、瘀濁”密切相關(guān)，在各種致病因素的綜合影響下，導(dǎo)致痰瘀互結(jié)、脈道不利、瘀血內(nèi)阻，臟腑氣機(jī)失調(diào)，使得病理產(chǎn)物在脈道內(nèi)不斷堆積，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊的形成。艾灸作為傳統(tǒng)中醫(yī)中十分重要的一部分，具有溫陽散寒、活血通脈的作用?！毒霸廊珪吩啤胺泊蠼Y(jié)大滯者最不易散，必欲散之，非藉火力不能速也，所以極宜用灸”，說明艾灸通過其溫?zé)嵝?yīng)可以溫通經(jīng)脈、行氣活血，進(jìn)而祛除痰濕瘀濁等病理因素，促進(jìn)病理產(chǎn)物的排出，減緩動脈粥樣硬化的病理演變。但長期以來，艾煙的安全性仍存在爭議，也因此限制了傳統(tǒng)艾灸的推廣和發(fā)展。實驗以ApoE-/-小鼠為動物模型，以同周齡相同遺傳背景的非轉(zhuǎn)基因小鼠C57BL/6作為空白對照，通過觀察各組小鼠的一般情況以及肺組織的病理變化來評價艾灸及艾煙的安全性。小鼠的一般情況主要指生存率、體質(zhì)量以及行為狀態(tài)描述，可直接反映艾灸及艾煙的安全性。通過實驗結(jié)果可知，各組小鼠在干預(yù)前均無異常，一般情況無差異，但ApoE-/-小鼠在實驗14周后，出現(xiàn)毛色晦暗且有脫落現(xiàn)象，體型肥胖，精神淡漠、食欲下降，反應(yīng)遲鈍等情況。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，動脈粥樣硬化的主要病機(jī)在于痰濁壅盛、氣血瘀阻。痰濁壅盛則多見毛發(fā)脫落、體型肥胖、精神淡漠，反應(yīng)遲鈍。氣血瘀阻則見毛色晦暗、食欲下降運化失司等表現(xiàn)。實驗過程中未出現(xiàn)小鼠死亡情況，生存率為100%，說明實驗操作對小鼠的應(yīng)激作用較小，不影響小鼠的正常生存。實驗前各組小鼠體質(zhì)量無差異，在前8周各組小鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)顯著增長趨勢，實驗第8～14周體質(zhì)量增長趨勢較緩。模型組ApoE-/-小鼠體質(zhì)量明顯大于空白組C57BL/6小鼠，這一現(xiàn)象與小鼠的基因型和喂養(yǎng)飼料不同有密切關(guān)系。ApoE-/-小鼠由于被敲除載脂蛋白E基因，隨自身生長逐漸出現(xiàn)脂代謝紊亂異常，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)積聚，加以采用高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)，加速了動脈粥樣硬化的進(jìn)程，引起模型組小鼠體質(zhì)量增量與空白組C57BL/6小鼠相比顯著增加。艾灸組小鼠體質(zhì)量平均值低于空白組，艾煙組小鼠體質(zhì)量在某些實驗時間節(jié)點也低于空白組，這可能是艾灸和艾煙改善脂質(zhì)積聚，減緩動脈粥樣硬化進(jìn)程的良性結(jié)果。

肺組織HE染色病理切片顯示艾灸及艾煙對肺組織無明顯影響。黃劍等［7］通過不同濃度艾煙干預(yù)12周對大鼠肺和骨骼肌的結(jié)果顯示，亞急性毒理實驗低、中、高濃度艾煙（艾煙濃度分別為2.5～3.5、8.0～10.0、27.0～29.0 mg/m3）對大鼠肺組織未見明顯損傷，與本實驗結(jié)果一致。其中高濃度艾煙組濃度為27.0～29.0 mg/m3，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于艾灸診室的艾煙濃度3.54 mg/m3［8-9］。本實驗艾煙組濃度為5～15 mg/m3，艾煙的濃度遠(yuǎn)低于可吸入顆粒物的風(fēng)險濃度。因此艾灸及艾煙對小鼠肺組織無影響，證明艾灸及艾煙具有一定的安全性。

在整個動脈粥樣硬化的進(jìn)程中，炎癥反應(yīng)貫穿始末。在這一炎性進(jìn)展中，首先產(chǎn)生的是內(nèi)皮功能損傷以及功能障礙，進(jìn)而激發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量的炎性因子浸潤血管壁，參與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生及發(fā)展［10］。這些炎性因子又分為促炎性因子和抑炎性因子，在動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過程中起著十分重要的作用。IL-4主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，是典型的抑炎性因子，其抑制炎癥反應(yīng)的主要機(jī)制是通過抑制單核-巨噬細(xì)胞以及IFN-γ、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等Th1細(xì)胞因子，進(jìn)而抑制動脈粥樣硬化進(jìn)程中的炎癥反應(yīng)［11-13］。因此IL-4被認(rèn)為是一種抗炎細(xì)胞因子。IFN-γ即Ⅱ型干擾素，主要由平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和Th1細(xì)胞分泌，又被稱為“巨噬細(xì)胞活化因子”，具有激活巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、NK細(xì)胞并促進(jìn)其功能的作用［14-15］。與此同時可產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子、氧自由基和金屬蛋白酶，進(jìn)而激發(fā)炎癥反應(yīng)。大量的研究表明，IFN-γ在動脈粥樣硬化中高水平表達(dá)［16］。IFN-γ的促炎作用主要是通過旁分泌和自分泌途徑引起局部炎癥反應(yīng)，從而減少平滑肌細(xì)胞的浸入和再生、大量的減少膠原合成、增加細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白的過度表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致動脈粥樣硬化斑塊纖維帽變薄并且抑制纖維帽的形成，最終加速了易損性斑塊的形成進(jìn)程［17］。有研究者發(fā)現(xiàn)，被試小鼠施行基因敲除術(shù)造模成缺乏內(nèi)源性IFN-γ的小鼠病變斑塊中巨噬細(xì)胞含量減少，斑塊纖維化程度升高，因此其動脈粥樣硬化病癥的進(jìn)展速度和普通小鼠相比有所減緩，病變程度明顯減輕［18-19］。本實驗運用艾灸及艾煙作為干預(yù)手段，觀察艾灸及艾煙在動脈粥樣硬化過程中的抗炎作用。結(jié)果顯示模型組IL-4水平降低、IFN-γ水平上升，反映出模型組小鼠動脈粥樣硬化過程中的炎性反應(yīng)，艾灸及艾煙組IL-4較模型組水平上升、IFN-γ水平下降，說明艾灸可抑制促炎性因子IFN-γ的產(chǎn)生、促進(jìn)抑炎因子IL-4的釋放，能明顯降低動脈粥樣硬化過程中的炎性反應(yīng)，起到了抗炎作用。綜上，艾灸及艾煙具有一定的安全性，在防治動脈粥樣硬化的過程中有確切的作用，其機(jī)制可能與降低動脈粥樣硬化中的炎性反應(yīng)有關(guān)。