棘皮動(dòng)物精子超低溫冷凍保存技術(shù)研究進(jìn)展*

許 帥 孫景春 劉石林 林承剛張立斌 孫麗娜 楊紅生,3①

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心 中國(guó)科學(xué)院海洋牧場(chǎng)工程實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué) 北京 100049；3. 中國(guó)科學(xué)院種子創(chuàng)新研究院 武漢 430072)

棘皮動(dòng)物(Echinodermata)是一類(lèi)古老、特殊的海洋生物，在5 億多年以前的古生代寒武紀(jì)即已出現(xiàn)，是無(wú)脊椎動(dòng)物中進(jìn)化地位最高等的類(lèi)群。世界范圍內(nèi)現(xiàn)存棘皮動(dòng)物7000 余種，化石種類(lèi)接近13000 種，幾乎全營(yíng)底棲生活，分布范圍廣泛，從熱帶海域到寒帶海域，從潮間帶到數(shù)千米的深海都有分布(廖玉麟等,2011; Pawson, 2007)?，F(xiàn)存的棘皮動(dòng)物普遍認(rèn)為可分為5 個(gè)綱，包括海百合綱(Crinoidea)、海星綱(Asteroidea)、蛇尾綱(Ophiuroidea)、海膽綱(Echinoidea)和海參綱(Holothurioidea)。棘皮動(dòng)物門(mén)為海洋生境所特有，其幼蟲(chóng)兩側(cè)對(duì)稱而成體多五輻射對(duì)稱，體壁中有CaCO3為主要成分的內(nèi)骨骼向外突出成棘刺，有特殊的水管系統(tǒng)輔助攝食、運(yùn)動(dòng)和其他功能，在海洋生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要作用(廖玉麟等, 2011)。棘皮動(dòng)物中，海參綱和海膽綱的一些種類(lèi)具有很高的經(jīng)濟(jì)、營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，逐漸被人們采捕和養(yǎng)殖。但由于近幾年來(lái)采捕過(guò)度、養(yǎng)殖規(guī)模急劇擴(kuò)大和近親交配嚴(yán)重等原因，一些棘皮動(dòng)物種質(zhì)退化問(wèn)題非常明顯，良種缺乏、病害發(fā)生日趨嚴(yán)重、對(duì)病害和環(huán)境脅迫的抵抗能力顯著降低。以刺參(Apostichopus j aponicus)為例，在20 世紀(jì)80 年代，人們突破了刺參苗種規(guī)?；庇夹g(shù)。21 世紀(jì)以來(lái)，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展，刺參成為引領(lǐng)我國(guó)第5 次海水養(yǎng)殖浪潮的主要品種。然而，從2004 年開(kāi)始，養(yǎng)殖刺參陸續(xù)出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，并出現(xiàn)種質(zhì)退化現(xiàn)象，在近幾年尤為明顯，主要表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度慢、病害頻發(fā)、存活率低等問(wèn)題，導(dǎo)致每年數(shù)10 億的經(jīng)濟(jì)損失(王印庚等, 2014)。野生刺參的資源量和種質(zhì)質(zhì)量亦急劇下降，已被世界自然保護(hù)聯(lián)盟納入瀕危物種紅色名錄(IUCN Red List of Threatened Species, IUCN 紅色名錄)。群體選育往往被用來(lái)解決經(jīng)濟(jì)品種種質(zhì)退化及良種缺乏等問(wèn)題，但此方法周期較長(zhǎng)，且容易存在雌、雄性腺成熟不同步、親本運(yùn)輸不方便以及配子利用率低等問(wèn)題。而超低溫冷凍保存技術(shù)是生物材料進(jìn)行長(zhǎng)期保存的一種有效手段，能有效解決群體選育中的上述問(wèn)題。對(duì)種質(zhì)資源(包括精子、卵子和胚胎)進(jìn)行超低溫冷凍保存，能夠提供不受季節(jié)限制的種質(zhì)資源、提高配子的利用率；擴(kuò)大雜交育種范圍，克服長(zhǎng)期近親交配造成的種質(zhì)資源衰退；使種質(zhì)資源運(yùn)輸更加便利，節(jié)約遺傳育種的資金；拯救珍稀、瀕臨滅絕的具有優(yōu)良性狀的物種，并可長(zhǎng)期不間斷的為遺傳育種和現(xiàn)代生物技術(shù)的研究提供生物材料，為種質(zhì)資源的保存和生物多樣性的保護(hù)開(kāi)辟了新途徑。本文對(duì)海膽、海參和海星3 種主要棘皮動(dòng)物的精子超低溫冷凍保存研究進(jìn)行了系統(tǒng)歸納和整理，并展開(kāi)描述了精子冷凍保存過(guò)程的各個(gè)步驟，以期為棘皮動(dòng)物種質(zhì)資源保存的進(jìn)一步研究及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供參考。

1 精子超低溫冷凍保存

1.1 超低溫冷凍保存技術(shù)原理

超低溫冷凍保存技術(shù)能夠長(zhǎng)期、有效保存生物材料，它是指通過(guò)向細(xì)胞、胚胎和組織器官等添加適當(dāng)?shù)目箖鲆?，使其在冷凍過(guò)程中免受或降低一系列低溫?fù)p傷(冰晶損傷、滲透損傷和溶質(zhì)損傷等)的影響，并通過(guò)一定的降溫速率，使之快速越過(guò)危險(xiǎn)區(qū)(-15℃～-60℃)，最后，投入液氮中(-196℃)進(jìn)行長(zhǎng)期保存的過(guò)程(劉清華, 2005)。理論上認(rèn)為，在液氮中保存的生物樣品細(xì)胞內(nèi)的一切生化反應(yīng)處于“暫停”狀態(tài)，甚至完全停止，可以長(zhǎng)時(shí)間保存。在需要的時(shí)候，以適當(dāng)?shù)姆椒芍匦陆鈨?、激活液氮中的生物樣品，恢?fù)其內(nèi)部正常的生化反應(yīng)，使其具有正常的生物學(xué)功能(齊文山等, 2014; Liu et al, 2015)。

1.2 精子進(jìn)行超低溫冷凍保存的優(yōu)點(diǎn)

相對(duì)于卵子和胚胎等種質(zhì)資源，精子的超低溫冷凍保存具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。精子體積小，具有單層膜等相對(duì)簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)，表面積與體積比相對(duì)較大，有利于水分和抗凍劑的滲透；而卵子和胚胎體積較大，表面積與體積比減小，并且具有豐富的卵黃、脂肪滴和多隔室生物系統(tǒng)，導(dǎo)致膜通透效率降低，雙層半透性膜系統(tǒng)和高的低溫敏感性又進(jìn)一步限制了水分和抗凍劑在膜兩邊的滲透性(Tsai et al, 2012)。

1.3 精子超低溫冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用

到目前為止，精子的超低溫冷凍保存技術(shù)已在人類(lèi)輔助生殖和牲畜育種中得到廣泛應(yīng)用(Anger et al ,2003; Mocé et al, 2009; Sharma et al, 2015; Rozati et al,2017)。例如，冷凍保存已常規(guī)應(yīng)用于協(xié)助馬(Janett et al,2003)和牛(Bhakat et al, 2011)的育種計(jì)劃。在水生物種中，為突破地理隔離，擴(kuò)大雜交組合范圍，提供不受季節(jié)限制的精子庫(kù)，達(dá)到提高遺傳育種效率和瀕危物種保護(hù)的目的，人們亦對(duì)一些水生經(jīng)濟(jì)物種開(kāi)展了精子超低溫冷凍保存研究。據(jù)統(tǒng)計(jì)，已有約200 種魚(yú)類(lèi)的精子被冷凍保存(田永勝等, 2009; 齊文山等,2014; Liu et al, 2015)，針對(duì)軟體動(dòng)物(牡蠣和鮑魚(yú))、甲殼類(lèi)(蝦和蟹)和棘皮動(dòng)物(海膽)等水生經(jīng)濟(jì)物種的精子也有相應(yīng)的冷凍保存研究(Dunn et al , 1973;Bhavanishankar et al, 1997; Dong et al, 2007)。但棘皮動(dòng)物精子冷凍保存研究開(kāi)展得較晚，且研究?jī)?nèi)容不夠系統(tǒng)全面，沒(méi)有形成產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的發(fā)展模式(田永勝等, 2019)。棘皮動(dòng)物中，海參綱和海膽綱的一些種類(lèi)自古以來(lái)即被作為滋補(bǔ)佳品，常被用來(lái)預(yù)防和治療一些疾病，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值(廖玉麟等,2011; Bordbar et al, 2011)。因此，棘皮動(dòng)物主要的精子冷凍保存研究也集中于這2 個(gè)綱的物種。

2 棘皮動(dòng)物精子超低溫冷凍保存基本步驟

通常精子超低溫冷凍保存過(guò)程主要包括精子的收集與質(zhì)量評(píng)估、稀釋劑制備、冷凍保護(hù)劑制備、精子與冷凍保護(hù)劑混合、冷卻、儲(chǔ)存、解凍和解凍后精子質(zhì)量評(píng)價(jià)(圖1)。其中，抗凍劑的種類(lèi)和濃度、稀釋液種類(lèi)、精子與冷凍保護(hù)劑混合比例、降溫程序和解凍程序等因素均會(huì)對(duì)解凍后的精子質(zhì)量產(chǎn)生極大的影響。解凍后評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的指標(biāo)包括運(yùn)動(dòng)活力、形態(tài)變化、受精率、孵化率、細(xì)胞器完整性和代謝機(jī)能(Liu et al, 2015)。

圖1 精子超低溫冷凍保存技術(shù)流程Fig.1 Basic process for sperm cryopreservation technology

2.1 精子收集與活力檢測(cè)

海膽和海參等棘皮動(dòng)物不能根據(jù)體型和外表分辨性別，因此，精子和卵子通常是一起收集。一般采用自然排精和獲取性腺2種方法收集棘皮動(dòng)物的精子。自然排精是指通過(guò)升高海水溫度、陰干或注射KCl溶液等方式誘導(dǎo)棘皮動(dòng)物排出成熟的精子，但此方法收集精子的質(zhì)量容易受到粘液、海水或糞便的污染，而且收集的精子難于濃縮(Gwo et al, 2002)。獲取性腺是收集棘皮動(dòng)物精子最常使用的方式，廣泛應(yīng)用于海參、海星和海膽等動(dòng)物的精子收集過(guò)程中。Shao等(2006)獲取新鮮刺參精液的操作為：當(dāng)發(fā)現(xiàn)白色精液從位于刺參背部的生殖孔中釋放出來(lái)時(shí)，立即挑出雄性刺參，解剖獲得成熟雄性性腺并剪碎，用0.5 mm的篩網(wǎng)濾掉性腺管壁碎片，濾出新鮮精液，于4℃保存至使用。用此方法，每只雄性海參可收集約5 ml新鮮精子。

在獲取新鮮精液后，立即檢測(cè)精子活力，以判斷是否能用于后續(xù)的超低溫冷凍。精子的活力可通過(guò)光學(xué)顯微鏡統(tǒng)計(jì)樣本中運(yùn)動(dòng)精子的百分比來(lái)直接測(cè)量(Lyons et al, 2005; Vitiello et al, 2011; Mizuno et al,2019)。Mizuno 等(2019)采用含0.5%胎牛血清的人工海水激活稀釋500 倍的刺參精子，認(rèn)為只有活力高于70%的精子才適用于超低溫冷凍保存。此外，還可通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)(Computer-aided sperm analysis, CASA)來(lái)測(cè)量精子的運(yùn)動(dòng)能力，該系統(tǒng)能客觀評(píng)估精子的多種運(yùn)動(dòng)參數(shù)，比主觀觀察具有更高的準(zhǔn)確性和測(cè)量效率(Acosta-Salmón et al , 2007)。Adams 等(2003)研究表明，同種海膽不同個(gè)體的新鮮精子雖然起初的運(yùn)動(dòng)活力無(wú)顯著差異，但經(jīng)過(guò)超低溫冷凍保存，解凍的精子質(zhì)量卻存在顯著差異。因此，在進(jìn)行超低溫冷凍實(shí)驗(yàn)時(shí)，將3 個(gè)雄性個(gè)體的精子合并在一起以減少雄性個(gè)體精子之間的差異，此方法還解決了從棘皮動(dòng)物(海膽)單只個(gè)體中只能收集到少量精子的問(wèn)題， 這一現(xiàn)象在牡蠣中也有報(bào)道(Paniagua-Chavez et al, 2001; Dong et al, 2007)。新鮮精子的質(zhì)量是影響精子超低溫冷凍保存成功與否的重要因素，冷凍后精子的質(zhì)量與新鮮精子的質(zhì)量有著密切的關(guān)系(Coloma et al, 2011; Orgal et al, 2012)。如何選取性腺質(zhì)量好、精子活力高、精子抗凍能力強(qiáng)的親本對(duì)棘皮動(dòng)物精子超低溫冷凍保存非常重要，如何評(píng)價(jià)和獲取高質(zhì)量的棘皮動(dòng)物新鮮精子仍需進(jìn)一步深入研究。

2.2 稀釋劑的選擇

普遍認(rèn)為，精液超低溫保存所需稀釋液必須具備的性質(zhì)是抑制精子的活力、維持細(xì)胞電解質(zhì)和滲透壓的平衡(Graham et al, 1990; 劉清華, 2005)。在海洋魚(yú)類(lèi)和軟體動(dòng)物精子冷凍保存中，常使用無(wú)Ca2+的Hank's平衡鹽溶液作為稀釋劑，其具有抑制精子活化和優(yōu)化精子滲透壓的能力，有利于在冷凍前節(jié)省精子中的能量從而保持精子的質(zhì)量(Dong et al , 2005a)。Ca2+被認(rèn)為能夠誘導(dǎo)精子的頂體反應(yīng)，并能導(dǎo)致精子凝集(Paniagua-Chavez et al, 1998)，但在棘皮動(dòng)物精子冷凍保存研究中，人工海水或過(guò)濾自然海水作為稀釋劑已被廣泛應(yīng)用(表1)，而其他成分的稀釋劑研究鮮有發(fā)表。棘皮動(dòng)物的精子是能被自然海水激活的，這顯然違反了稀釋液需滿足抑制精子活力的性質(zhì)。Gallego等(2014)分析了2種游泳者(河豚和歐洲鰻魚(yú))和2種無(wú)柄者(海膽和海鞘)海洋物種的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)和形態(tài)特征。結(jié)果顯示，海膽等無(wú)柄者海洋物種的精子被激活后，精子活力能保持更長(zhǎng)的時(shí)間(約45 min)；Fabbrocini等(2017)研究表明，海膽精子在激活后可保持1 h的高活力，并保持相對(duì)運(yùn)動(dòng)活力達(dá)24 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)，海水用量較少和精子激活后能維持較長(zhǎng)時(shí)間的活力，可能是過(guò)濾自然海水或人工海水能夠作為棘皮動(dòng)物精子冷凍保存稀釋劑的原因。但隨著棘皮動(dòng)物精子在稀釋液中時(shí)間的延長(zhǎng)，其質(zhì)量會(huì)下降，在今后研究中，應(yīng)繼續(xù)了解棘皮動(dòng)物精子的激活機(jī)制，發(fā)掘具有更好冷凍保存效果的稀釋劑，從而延長(zhǎng)精子的運(yùn)動(dòng)能力，提高冷凍保存后的精子質(zhì)量。

2.3 抗凍劑的選擇

抗凍劑在精子超低溫冷凍保存中非常重要，如果精子在冷凍保存中沒(méi)有抗凍劑的保護(hù)，解凍后的精子質(zhì)量極差，并可能呈粘稠狀，無(wú)應(yīng)用價(jià)值?？箖鰟┌雌浯┩讣?xì)胞膜的能力可分為滲透性抗凍劑(CPA)和非滲透性抗凍劑(co-CPA)(Dong et al, 2005b)。

2.3.1 滲透性抗凍劑 滲透性抗凍劑能夠快速穿透細(xì)胞膜，滲入細(xì)胞內(nèi)部并與水和電解質(zhì)結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一定的摩爾濃度，能夠降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰電解質(zhì)溶液的濃度、降低冰點(diǎn)、減少冰晶的形成，同時(shí)，能避免細(xì)胞內(nèi)水分過(guò)分滲出造成細(xì)胞皺縮，從而導(dǎo)致容積損傷(劉清華, 2005; 楊培民等, 2008)。常用的滲透性抗凍劑包括二甲基亞砜(DMSO)、甲醇(METH)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、二甲基乙酰胺(DMA)和甘油(GLY)等，其中，DMSO 被極廣泛應(yīng)用于海洋魚(yú)類(lèi)和無(wú)脊椎動(dòng)物精液超低溫冷凍保存，這與DMSO 對(duì)精子的冷凍保護(hù)效果好且適用于大多數(shù)物種的精子有關(guān)(Liu et al, 2015; Shao et al, 2006)。同時(shí)，DMSO 也在棘皮動(dòng)物精子冷凍保存中提供了良好的冷凍保護(hù)作用。DMSO 作用的最適濃度范圍一般是5%～20%，但Dunn 等(1973)研究發(fā)現(xiàn)，DMSO 在海星精子冷凍保存中的有效濃度范圍是20%～30%，這可能是由于海星新鮮精液中精子濃度比較低，需要更多DMSO 來(lái)起作用(表1)。不同濃度的EG、PG、METH、DMA 和二甲基甲酰胺(DMF)被用于棘皮動(dòng)物精子冷凍保存研究，但其冷凍保護(hù)效果均不如DMSO (Shao

et al, 2006; 表1)。不同物種的精子具有特定的最適抗凍劑種類(lèi)和濃度范圍，這與其物種特異性有關(guān)。例如，Behlmer 等(1984)研究發(fā)現(xiàn)，GLY 比DMSO 對(duì)鱟(Limulus polyphermus L.)的精液的保護(hù)效果更好；濃度為 10%的 GLY 也為羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)精子提供了更成功的冷凍保存結(jié)果(Akarasanon et al, 2004)。GLY 已更成功地應(yīng)用于蝦、蟹精子的冷凍保存，可能是由于GLY 是蝦、蟹動(dòng)物脂代謝中的天然中間產(chǎn)物(Jeyalectumie et al, 1989)。但是，GLY 卻對(duì)海星、海膽、鮑魚(yú)、牡蠣的精子具有毒害作用，濃度為5%～40%的GLY 能夠?qū)е律鲜鑫锓N的精子活力在冷凍前急劇降低(Dunn et al, 1973)。PG 能有效保護(hù)牡蠣和海膽精子，但其效果不及DMSO(Asahina et al, 1978)。

2.3.2 非滲透性抗凍劑(co-CPA) 葡萄糖(GLU)、海藻糖(TRE)、蔗糖(SUC)、蛋黃(Yolk)、甘氨酸(Gly)、聚乙二醇(PEG)和胎牛血清(FBS)等co-CPA 在精液超低溫冷凍保存中也發(fā)揮著重要的作用。co-CPA 的添加被發(fā)現(xiàn)可顯著改善精子冷凍保存后的存活率，如胎牛血清的添加能夠促進(jìn)日本珍珠貝(Pincetada f ucata martensii)精子解凍后的運(yùn)動(dòng)活力，可能與胎牛血清能減少冷凍過(guò)程中精子所受的滲透效應(yīng)和離子效應(yīng)以及增強(qiáng)精子抵抗冷凍損傷的能力有關(guān)(Kawamoto et al ,2007)。Acosta-Salmón 等(2007)研究表明，單獨(dú)使用海藻糖可達(dá)到與DMSO 組合使用時(shí)相似的解凍后的精子活力。添加1%或2%的葡萄糖顯著改善了解凍后澳洲綠邊鮑魚(yú)(Haliotis l aevigata)精子的受精率(Liu et al, 2014b)。此外，Liu 等(2014a、2014b)研究表明，甘氨酸在海洋軟體動(dòng)物的精子冷凍保存中起著積極的作用，已被優(yōu)先選擇作為冷凍保護(hù)介質(zhì)。Dong 等(2006)認(rèn)為，co-CPA 具有冷凍保護(hù)效果，與其能在冷凍保存過(guò)程中控制溶質(zhì)的流入和流出來(lái)穩(wěn)定精子膜有關(guān)，雞蛋黃的作用主要是與精子膜相互作用，在冷凍過(guò)程中可以防止膜上脂類(lèi)相態(tài)的變化以保護(hù)精子免受冷休克損傷；單糖的作用主要是與膜上磷脂相互作用，可維持膜的穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞脫水，還能為精子的運(yùn)動(dòng)提供能量。

2.3.3 抗凍劑之間的組合 為達(dá)到更好的精子冷凍保存效果，通常會(huì)將CPA 與co-CPA 組合搭配使用。Jeyalectumie 等(1989)研究表明，海藻糖單獨(dú)用于鋸緣青蟹(Scylla serrata)精子冷凍保存時(shí)效果較差，而海藻糖與DMSO 組合使用時(shí)，解凍后精子的活力顯著增加。在虹鱒(Oncorhynchus m ykiss)、細(xì)須石首魚(yú)(Icropogonias undul atus)精液的低溫保存中發(fā)現(xiàn)，DMSO 與蔗糖或葡萄糖組合使用時(shí)，具有正協(xié)同保護(hù)效應(yīng)(Gwo et al, 1991)。在棘皮動(dòng)物精子超低溫冷凍保存中，關(guān)于co-CPA 以及CPA 與co-CPA 結(jié)合使用的研究相對(duì)較少(表1)。不同物種有其最適種類(lèi)或濃度的CPA 和co-CPA，這一差別可能因?yàn)橛H本來(lái)源的地理位置不同，從而產(chǎn)生了精子相關(guān)特征的遺傳變異(Thurston et al, 2002; Dong et al, 2005b)。

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2.4 精液稀釋比例和平衡時(shí)間

適宜的稀釋比例和平衡時(shí)間對(duì)精子冷凍保存至關(guān)重要，在精子冷凍保存操作過(guò)程中，通常將冷凍保護(hù)液和精子按一定比例稀釋混合并平衡一段時(shí)間，以達(dá)到用最適數(shù)量的冷凍精子實(shí)現(xiàn)最優(yōu)冷凍保存結(jié)果的目的(Liu et al, 2015)。

2.4.1 稀釋比例 稀釋比例是指精子和冷凍保護(hù)液在冷凍容器中的混合比例。稀釋對(duì)精子冷凍保存非常重要，精子稀釋程度低可能會(huì)導(dǎo)致解凍后精子發(fā)生有害凝集，而精子稀釋程度高可能會(huì)導(dǎo)致精子能量的快速消耗、生理學(xué)改變以及精液中保護(hù)性成分減少，稀釋程度的不當(dāng)均可導(dǎo)致精子凍存后生存能力的下降(Paniagua-Chavez et al, 1998; Dong et al, 2005a)。Liu等(2015)研究指出，通過(guò)自然排精收集的精子濃度較小，其在超低溫冷凍保存過(guò)程中的稀釋倍數(shù)也較小，最大稀釋倍數(shù)為1∶10。棘皮動(dòng)物精子獲取方式多為解剖收取性腺，獲取精液的精子密度高，在超低溫冷凍保存過(guò)程中的稀釋倍數(shù)也較高。研究表明，棘皮動(dòng)物精子冷凍保存最適的稀釋比例范圍是1∶3～1∶20 (Dunn et al, 1973; Asahina et al, 1978; Adams et al, 2004; Fabbrocini et al, 2014; Shao et al, 2006;Mizuno et al, 2019)。從不同個(gè)體性腺中取出新鮮精液的精子密度不同，若按照統(tǒng)一的稀釋比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)存在一定弊端，將精子稀釋至特定濃度更能優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案。Dong等(2006、2007)將太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)精子稀釋至1×109個(gè)/ml，Liu等(2014b)將綠邊鮑魚(yú)精子濃度稀釋至1.6×108個(gè)/ml，更有效地開(kāi)展、比較并優(yōu)化了精子冷凍保存的相關(guān)實(shí)驗(yàn)方案。

2.4.2 平衡時(shí)間 平衡時(shí)間是指精子與冷凍保護(hù)液接觸混合至開(kāi)始降溫的時(shí)間段，平衡時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致抗凍劑不能充分的進(jìn)入精子細(xì)胞膜或與細(xì)胞膜結(jié)合，不能發(fā)揮其抗凍保護(hù)的作用；平衡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，抗凍劑的毒害作用會(huì)對(duì)細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷。在以往棘皮動(dòng)物精子冷凍保存研究中，并沒(méi)有考慮平衡時(shí)間這一因素對(duì)冷凍后保存效果的影響，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，只設(shè)立了單一的平衡時(shí)間，沒(méi)有設(shè)置對(duì)比，Mizuno等(2019)研究表明，平衡時(shí)間必須少于3 min，有的研究設(shè)置平衡時(shí)間為6～10 min(Shao et al, 2006; Fabbrocini et al, 2014)，甚至為30 min (Dunn et al, 1973)。Zheng等(2018)選取珠母貝(Pinctada f ucata m artensii)為研究對(duì)象，研究了新鮮珠母貝精子在5種不同抗凍劑、5種濃度經(jīng)歷不同平衡時(shí)間作用后精子存活率的變化，并利用模型模擬提出了不同種類(lèi)抗凍劑和不同抗凍劑濃度條件下應(yīng)有的最大平衡時(shí)間，從而判定不同抗凍劑的毒性大小，并初步篩選排除出毒性大且不適用于精子冷凍保存的抗凍劑。

2.5 降溫速率和解凍速率

降溫速率和解凍速率亦對(duì)精子冷凍保存至關(guān)重要。降溫速率太慢、冷凍效率低，抗凍劑對(duì)細(xì)胞的毒性作用會(huì)加劇，細(xì)胞膜上的脂質(zhì)分子在高濃度電解質(zhì)溶液中時(shí)間太長(zhǎng)也會(huì)遭受損傷；降溫速率太快，細(xì)胞膜外的結(jié)冰速率會(huì)高于細(xì)胞內(nèi)的結(jié)冰速率，造成細(xì)胞膜外的溶質(zhì)濃度和滲透壓比膜內(nèi)越來(lái)越高，可能造成滲透休克和冰晶損傷、并對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆影響。解凍速率太慢，重結(jié)晶現(xiàn)象會(huì)加劇冰晶對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞器的機(jī)械損傷；解凍速率太快，對(duì)解凍操作要求高，需要在很短的時(shí)間內(nèi)結(jié)束解凍，并且高溫可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生熱應(yīng)激，造成不可逆影響(Liu et al, 2015)。因此，適宜的降溫速率和解凍速率可以最低限度的降低冷凍保存過(guò)程對(duì)細(xì)胞造成的損傷。

2.5.1 降溫速率 在精子超低溫冷凍保存研究中，控制降溫速率的方法可分為非程序兩步降溫法和程序降溫法。非程序兩步降溫法通常使用帶架子的泡沫聚苯乙烯盒子等工具。首先將樣品快速降到距液氮面某一高度處，停留一段時(shí)間，使細(xì)胞充分脫水以減少胞內(nèi)冰晶的形成，然后，投入到液氮中長(zhǎng)期保存。該方法通過(guò)調(diào)節(jié)樣品距液氮面的高度來(lái)控制冷凍速率，并通過(guò)熱電偶測(cè)其冷凍速率，具有設(shè)備成本低且易于現(xiàn)場(chǎng)操作的優(yōu)點(diǎn)。目前，棘皮動(dòng)物精子超低溫冷凍保存相關(guān)研究均采用非程序兩步降溫法。例如，在對(duì)刺參精液的超低溫冷凍保存研究中，Shao 等(2006)通過(guò)控制樣品距液氮液面的高度(2、4、6 和8 cm)來(lái)調(diào)整降溫速率為-77、-52、-35 和-19℃/min，放置15 min后，立即投入液氮保存，發(fā)現(xiàn)當(dāng)降溫速率為-35℃/min時(shí)，精子解凍后的受精率最高(70%)。同樣，Mizuno 等(2019)控制樣品距液氮液面的高度為(5～17.5 cm)來(lái)調(diào)整降溫速率為-5.2～-65℃/min，將樣品冷卻至-50℃后，立即投入液氮保存，發(fā)現(xiàn)當(dāng)降溫速率為-10.4℃/min (距液氮液面高度15 cm)時(shí)，精子解凍后獲得最高的受精率為(89.8±1.7)%，與新鮮精子的受精率[(92.7±1.8)%]無(wú)顯著差異。對(duì)比不同的棘皮動(dòng)物精子冷凍保存的研究發(fā)現(xiàn)，同樣運(yùn)用非程序兩步降溫法，不同研究得出的最適降溫速率差異較大，如-5、-20 和-50℃/min。Dunn等(1973)和Asahina 等(1978)的研究均表明，適合海膽精子的降溫速率約為-5℃/min，而Adams 等(2004)通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比卻發(fā)現(xiàn)，降溫速率-50℃/min 對(duì)海膽精子的冷凍效果明顯比-5℃/min 效果好，其中的原因有物種及其生存環(huán)境的差異，也有研究所使用的降溫裝置及冷凍容器的不同。

程序降溫法指通過(guò)程序降溫儀等儀器預(yù)先設(shè)計(jì)的冷凍程序來(lái)控制樣品的冷凍速率，然后將樣品投入液氮中保存。此種方法操作簡(jiǎn)單、能精確控制并靈活改變降溫速率及平衡時(shí)間，有利于深入研究降溫速率對(duì)精子冷凍保存的影響，但儀器較為昂貴，方法不易普及。程序降溫法在海洋魚(yú)類(lèi)和軟體動(dòng)物精子冷凍保存研究中有使用，但在棘皮動(dòng)物中并未使用。作者認(rèn)為應(yīng)將程序降溫法和非程序兩步降溫法結(jié)合使用，通過(guò)程序降溫法找到合適的降溫速率及降溫終點(diǎn)溫度，并以此設(shè)計(jì)適合的裝置，通過(guò)非程序兩步降溫法在實(shí)驗(yàn)室或養(yǎng)殖場(chǎng)驗(yàn)證與應(yīng)用。

2.5.2 解凍速率 Liu 等(2015)在海洋軟體動(dòng)物精子冷凍保存的解凍溫度分為3 個(gè)范圍：低溫(＜29℃)、中溫(30℃～49℃)和高溫(＞50℃)。按照此標(biāo)準(zhǔn)，以往棘皮動(dòng)物精子冷凍保存研究的解凍溫度屬于中低溫度，解凍溫度從室溫、15℃～45℃水浴不等(Dunn et al,1973; Asahina et al, 1978; Adams et al, 2004; Fabbrocini

et al, 2014; Shao et al, 2006; Mizuno et al, 2019)。解凍操作的一般步驟為將樣品從液氮中取出，置于特定溫度水浴解凍，輕輕搖動(dòng)使溫度均勻，待只剩少量固體時(shí)立即取出，在空氣中繼續(xù)搖動(dòng)使其完全融化。作者認(rèn)為適合某一物種精子冷凍保存的解凍溫度應(yīng)模擬其自然排精、受精時(shí)的溫度，既保證了有合適的解凍速率，又能保證解凍溫度不會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生溫度應(yīng)激。本團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，解凍溫度為20℃、37℃和50℃對(duì)刺參冷凍保存精子解凍后的活力影響不顯著(P＞0.05，未發(fā)表數(shù)據(jù))，這與Anchordoguy 等(1988)研究中不同解凍溫度對(duì)海蝦(Sicyonia i ngentis)冷凍保存精子活力影響的結(jié)果相似。但利用受精溫度作為解凍溫度可能會(huì)影響解凍的速率，從而造成解凍時(shí)的反玻璃化和重結(jié)晶等冷凍損傷。目前，仍缺乏能夠?yàn)榧?dòng)物乃至整個(gè)水生物種精子的冷凍保存選擇合適解凍溫度的理論，解凍過(guò)程應(yīng)當(dāng)成為以后研究的重點(diǎn)。

2.6 精子質(zhì)量評(píng)價(jià)

冷凍精子經(jīng)解凍后應(yīng)對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的參數(shù)包括運(yùn)動(dòng)活力、形態(tài)變化、受精率、孵化率、細(xì)胞器完整性及代謝機(jī)能(圖1)。對(duì)冷凍精子進(jìn)行全面系統(tǒng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)，并對(duì)比新鮮精子的相關(guān)參數(shù)，有利于進(jìn)一步研究冷凍保存對(duì)精子的損傷機(jī)制。

2.6.1 運(yùn)動(dòng)活力和形態(tài)變化 冷凍精子運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試與前述新鮮精子的運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試相一致，一般有使用光學(xué)顯微鏡統(tǒng)計(jì)樣本中運(yùn)動(dòng)精子的百分比來(lái)直接測(cè)量和通過(guò)CASA 系統(tǒng)測(cè)量2 種方式，近幾年，CASA 系統(tǒng)由于其較高的準(zhǔn)確性和效率而被廣泛應(yīng)用(van der Horst et al, 2018)。眾多棘皮動(dòng)物精子冷凍保存研究中并未使用CASA 系統(tǒng)對(duì)冷凍保存后的精子進(jìn)行活力檢測(cè)，但Fabbrocini 等(2017)利用CASA系統(tǒng)的特定分析模型對(duì)海膽(Paracentrotus li vidus)的新鮮精子激活后不同時(shí)間的運(yùn)動(dòng)參數(shù)進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)估，評(píng)估的精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)包括精子存活率(TM，活動(dòng)精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比)、活力(RAP，快速前向運(yùn)動(dòng)精子占總精子數(shù)的百分比)、密度、存活時(shí)間、平均曲線運(yùn)動(dòng)速度(VCL, μm/s)、平均直線運(yùn)動(dòng)速度(VSL, μm/s)、平均路徑速度(VAP, μm/s)、鞭打頻率(BCF)、頭部的側(cè)擺幅度(ALH)等，并提出使用濃度為0.05%的胎牛血清(BSA)作為抗粘劑。該研究表明，海膽精子在激活后可保持1 h 的高活力，并保持相對(duì)運(yùn)動(dòng)活力達(dá)24 h，比大多數(shù)魚(yú)類(lèi)精液稀釋激活后保持高活力的時(shí)間更長(zhǎng)，不需要抑制活力的過(guò)程。Fabbrocini 等(2017)的研究為CASA 系統(tǒng)在棘皮動(dòng)物精子冷凍保存研究中的使用奠定基礎(chǔ)，為棘皮動(dòng)物激活后的精子在實(shí)驗(yàn)室研究中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

對(duì)冷凍精子進(jìn)行精子形態(tài)評(píng)估時(shí)，傳統(tǒng)上是通過(guò)掃描或透射電子顯微鏡觀察精子頭部、中段、尾巴、頂體、線粒體和細(xì)胞核的變化。觀察結(jié)果為了解冷凍保存對(duì)精子結(jié)構(gòu)上的損傷提供了有效信息(Espinoza et al, 2010)。此外，CASA 系統(tǒng)中的輔助形態(tài)分析模塊還可協(xié)助區(qū)分精子的形態(tài)測(cè)量特性，進(jìn)而提供有關(guān)精子冷凍保存后形態(tài)學(xué)變化及冷凍耐受能力的信息。目前，該技術(shù)已應(yīng)用于山羊(Gravance et al, 1995)，歐洲鰻魚(yú)(Asturiano et al, 2007)和鹿(Esteso et al, 2009)等物種，但不適用于海洋軟體動(dòng)物，其對(duì)棘皮動(dòng)物是否適用有待研究。

2.6.2 受精率和孵化率 受精率和孵化率的檢測(cè)，指測(cè)量精子與成熟卵子結(jié)合產(chǎn)生受精卵并正常發(fā)育的能力，是精子冷凍保存技術(shù)的關(guān)鍵步驟。冷凍精子的濃度以及精子與卵子的比率對(duì)于成功受精至關(guān)重要，較低或較高的濃度和精卵比都會(huì)影響受精率。冷凍保存后，大多數(shù)精子的頂體和質(zhì)膜已經(jīng)受損，受精能力顯著降低(Kurokura et al, 1990; Bury et al, 1993)。Kurokura 等(1989)研究表明，冷凍后的海膽精子只有5%～12%在形態(tài)上是正常的。Kurokura 等(1990)研究表明，經(jīng)冷凍后的牡蠣精子由于頂體被破壞，喪失了進(jìn)入卵子的能力，精子聚集，導(dǎo)致受精率下降。冷凍保存精子的受精能力低于新鮮精子的受精能力，因此，受精實(shí)驗(yàn)中需要增加冷凍精子的數(shù)量。Adams等(2004)對(duì)海膽新鮮精子和冷凍精子的研究表明，為獲得最大的受精率，所需新鮮精子濃度約為105/ml(卵子與精子的比例為1∶1000)，而冷凍精子則至少需要106/ml 的濃度(卵子與精子的比例為1∶10000)。Shao 等(2006)也得到了同樣的結(jié)果，其研究結(jié)果顯示，刺參卵子與冷凍精子的比例為1∶10000 時(shí)的受精率顯著高于二者比例為 1∶1000 時(shí)的受精率(P＜0.05)。

2.6.3 流式細(xì)胞術(shù)與細(xì)胞器完整性 電鏡觀察精子形態(tài)和受精率、檢查精子活力等評(píng)估步驟執(zhí)行較緩慢，相比較而言，流式細(xì)胞術(shù)具有在短時(shí)間內(nèi)評(píng)估多個(gè)精子參數(shù)的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡，可對(duì)冷凍前后精子的質(zhì)膜(SYB/PI 染色，PMI)、線粒體膜電位[羅丹明123/碘化丙錠(PI)染色，MMP]、頂體(DND/PI 染色，AI)和DNA(AO 染色)等的完整性或損傷比例進(jìn)行測(cè)定。如PI 不能通過(guò)活細(xì)胞膜，只可透過(guò)受損的細(xì)胞膜對(duì)細(xì)胞核染色(呈紅色)，羅丹明123 只可使線粒體功能完整的精子細(xì)胞著色(呈綠色)，因此，通過(guò)羅丹明123/PI 2 種染料進(jìn)行熒光雙染色及流式細(xì)胞儀觀察，可檢測(cè)冷凍解凍后精子膜和線粒體結(jié)構(gòu)及功能的損傷狀況(Adams et al, 2003)。Adams 等(2004)利用流式細(xì)胞術(shù)比較了海膽精子在凍前凍后的細(xì)胞膜完整性和線粒體功能的變化情況，研究表明，較高濃度的DMSO 在保留精子線粒體功能和膜完整性方面更為有效，但精子的線粒體功能和膜完整性對(duì)凍前凍后不同海膽個(gè)體精子間的受精能力基本無(wú)影響。

2.6.4 代謝機(jī)能 精液經(jīng)超低溫保存后，由于膜的損傷會(huì)導(dǎo)致精子內(nèi)的酶滲漏到細(xì)胞外，而導(dǎo)致胞內(nèi)酶的活性降低，精漿中酶的活性卻大大提高。超低溫保存還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP 水平的變化。冷凍前后精液中酶活性及水平的分析測(cè)定，不僅是評(píng)價(jià)低溫保存成功與否的重要指標(biāo)，也是用來(lái)確定細(xì)胞損傷部位、研究損傷機(jī)理的有效途徑(Chauhan et al, 1994)。如果參與三羧酸循環(huán)的有關(guān)的酶活性降低并伴有水平的下降，則說(shuō)明為精子提供能量的場(chǎng)所——線粒體受到損傷。常檢測(cè)的酶主要有琥珀酸脫氫酶(SDH)、乳酸脫氧酶(LDH)、Na+/K+-ATP 酶、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氧酶(CAT)與谷胱甘肽還原酶(GR)等?，F(xiàn)有的棘皮動(dòng)物精子冷凍保存研究中尚未提及冷凍前后精子代謝機(jī)能的變化情況，下一步應(yīng)借鑒魚(yú)類(lèi)精子冷凍保存方面的類(lèi)似研究，將該指標(biāo)納入棘皮動(dòng)物精子冷凍前后質(zhì)量評(píng)價(jià)體系。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，精子超低溫冷凍保存技術(shù)已廣泛應(yīng)用于人類(lèi)輔助生殖、畜牧和水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物育種中。棘皮動(dòng)物精子冷凍保存的研究?jī)?nèi)容相對(duì)滯后，此類(lèi)研究中精子收集常用的方法是解剖獲取性腺法；常用的稀釋劑和抗凍劑分別為海水和DMSO；平衡時(shí)間、稀釋比例、降溫速率和解凍溫度等因素在篩選過(guò)程中因?qū)嶒?yàn)條件不同而呈現(xiàn)多種結(jié)果。應(yīng)繼續(xù)借鑒魚(yú)類(lèi)、軟體動(dòng)物精子的超低溫冷凍保存技術(shù)，不斷豐富人們對(duì)超低溫冷凍保存技術(shù)作用原理的認(rèn)識(shí)，同時(shí)，根據(jù)棘皮動(dòng)物精子自身的特點(diǎn)，重點(diǎn)研究稀釋劑的選擇、解凍過(guò)程和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用等內(nèi)容?；谏鲜黾?dòng)物精子冷凍保存研究進(jìn)展，提出以下待解決的問(wèn)題和建議。

3.1 獲取高質(zhì)量的新鮮精子

高質(zhì)量的新鮮精子是冷凍保存成功的先決條件，在進(jìn)行超低溫冷凍保存前，應(yīng)保證所用新鮮精子具有低溫冷凍價(jià)值。為解決這個(gè)問(wèn)題，應(yīng)建立一系列評(píng)價(jià)指標(biāo)，在精子冷凍保存前，統(tǒng)計(jì)不同親本個(gè)體的性腺指數(shù)、體重和年齡等參數(shù)，并檢測(cè)新鮮精子的各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)參數(shù)；用相同的冷凍保存技術(shù)流程對(duì)上述來(lái)自同物種不同個(gè)體的精子進(jìn)行冷凍保存，并對(duì)冷凍保存的精子進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)；將冷凍前親本的性狀參數(shù)及精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)與其相對(duì)應(yīng)的冷凍保存精子質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果相關(guān)聯(lián)，篩選影響精子冷凍后質(zhì)量的關(guān)鍵參數(shù)，做到從表型數(shù)據(jù)或新鮮精子的運(yùn)動(dòng)參數(shù)就能選擇出高質(zhì)量的精子。

3.2 開(kāi)發(fā)新型抗凍劑

抗凍劑在冷凍保存技術(shù)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，相對(duì)來(lái)說(shuō)，DMSO 是目前最符合“低毒、高效”標(biāo)準(zhǔn)的抗凍劑，即使在低濃度下也能提高膜對(duì)ATP的滲透能力(Gironi et al, 2020)。應(yīng)不斷深入研究各種抗凍劑的保護(hù)機(jī)制，根據(jù)抗凍劑的保護(hù)原理及抗凍劑具備的生化特性，開(kāi)發(fā)具備低毒、高效特點(diǎn)的新型抗凍劑，為規(guī)范化超低溫冷凍保存提供更多的選擇。

3.3 優(yōu)化超低溫冷凍保存技術(shù)流程

超低溫冷凍保存技術(shù)中每一種參數(shù)的篩選是相對(duì)繁瑣的工作，如果對(duì)每一物種都進(jìn)行重復(fù)的工作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。應(yīng)不斷加強(qiáng)相關(guān)的理論研究，如超低溫冷凍對(duì)精子的損傷機(jī)制、抗凍劑對(duì)精子的保護(hù)機(jī)制、稀釋劑抑制精子活力原理和精子激活機(jī)制等，在此基礎(chǔ)上針對(duì)每一物種精子的特性，直接選擇最適的稀釋劑、滲透性抗凍劑、非滲透性抗凍劑，并設(shè)計(jì)最適的降溫程序及解凍程序。

3.4 精子超低溫冷凍保存技術(shù)原理的拓展和應(yīng)用

種質(zhì)資源不僅只有精子，還包含卵子和胚胎等。應(yīng)將精子冷凍保存技術(shù)的原理和經(jīng)驗(yàn)與卵子和胚胎相關(guān)方面的原理和經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合，不斷豐富超低溫冷凍保存原理，并應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐，建立種質(zhì)資源庫(kù)。棘皮動(dòng)物的卵子和胚胎能否有效冷凍？冷凍精子和冷凍卵子受精后，受精率和孵化率如何？通過(guò)冷凍整個(gè)性腺得到冷凍的精(卵)母細(xì)胞解凍后能否培養(yǎng)為成熟精(卵)子并有效應(yīng)用？這一系列問(wèn)題均有待解決。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究方法和手段的不斷更新，超低溫冷凍保存技術(shù)會(huì)越來(lái)越成熟，棘皮動(dòng)物種質(zhì)資源會(huì)得到有效的保護(hù)，可持續(xù)地為全人類(lèi)提供更多優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和皂苷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。