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    茯磚茶金花發(fā)酵劑的制備工藝優(yōu)化

    2021-05-12 10:45:18劉永翔黃永會任錫毅譚玉梅
    貴州農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年2期
    關(guān)鍵詞:孢量磚茶發(fā)酵劑

    曹 霞, 劉永翔, 黃永會, 任錫毅, 鄒 曉, 譚玉梅*

    (1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院, 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室, 山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室, 貴州 貴陽 550006)

    0 引言

    【研究意義】茯磚茶(Fuzhuan Brick Tea)屬于一種后發(fā)酵黑茶,具有獨特的品質(zhì)和風(fēng)味,至今已有超過600年的悠久歷史,產(chǎn)銷量在黑茶市場中占據(jù)著重要的地位[1]。茯磚茶具有健胃消食、降脂減肥、降血壓等多種保健功效[2-4]。肖文軍等[5-7]研究表明,茯磚茶具有降脂減肥的作用。黃群等[8]研究表明,茯磚茶對人體胃腸消化功能具有調(diào)理作用。茯磚茶因具有較多的保健功效和投資價值,越來越受商業(yè)人士的青睞[9]。茯磚茶制作流程包括黑毛茶制備、渥堆、氣蒸、二次渥堆、發(fā)花干燥和成品包裝等[10]。形成茯磚茶品質(zhì)的最關(guān)鍵工藝是發(fā)花,該工藝是金花菌—冠突曲霉在茶葉中繁殖代謝的過程,該過程不僅能夠改善茶葉的外觀、色澤、香氣及口感等,還能夠產(chǎn)生對人體有益的活性代謝產(chǎn)物[11]。因此,金花菌的數(shù)量和顆粒的飽滿度是決定發(fā)花品質(zhì)的重要參數(shù)之一[12]。貴州的夏秋茶資源豐富,黑茶產(chǎn)業(yè)具有良好的發(fā)展前景,目前,貴州對黑茶的研究很少,且產(chǎn)品結(jié)構(gòu)單一,貴州黑茶企業(yè)普遍存在發(fā)花周期短,發(fā)花過程容易污染,發(fā)花工藝不成熟,沒有統(tǒng)一的制作標(biāo)準(zhǔn)等問題。有研究發(fā)現(xiàn),人工接種可以改善茯磚茶品質(zhì),而金花菌發(fā)酵劑的制備是人工接種的關(guān)鍵。對茯磚茶金花發(fā)酵劑的制備工藝進(jìn)行研究,對改善茯磚茶品質(zhì)具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前,針對發(fā)花技術(shù)的改進(jìn),大多數(shù)采用人工接種液體發(fā)酵劑、孢子液、孢子粉和添加誘發(fā)劑[13],這些制作方法都相對比較復(fù)雜,不適宜工廠化推廣?!狙芯壳腥朦c】目前,大多數(shù)利用固體培養(yǎng)方法,該方法具有操作方便,儲存時間長等優(yōu)點。為此,采用固體培養(yǎng)方法,對茯磚茶金花發(fā)酵劑的制備進(jìn)行研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過單因素試驗設(shè)計考察不同含水量、接種量與蔗糖含量對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量的影響,并利用響應(yīng)面法對發(fā)酵劑的配方進(jìn)一步優(yōu)化,以期縮短發(fā)花時間提高發(fā)花孢子濃度,為茯磚茶的工藝改良和品質(zhì)提升提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    菌種:金花菌—冠突曲霉(Aspergilluscristatus),由中國科學(xué)院菌種保藏中心和貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室共同保存,中國科學(xué)院菌株保藏號:CGMCC 7.193;黑毛茶由貴州過江龍生態(tài)黑茶(集團(tuán))有限公司提供。

    5%NaCl MYA培養(yǎng)基:稱取酵母5 g、麥芽糖20 g、蔗糖30 g、NaCl 50 g、攪拌混勻,然后加瓊脂1.5~1.7 g,蒸餾水定容至1 000 mL,混勻,121℃滅菌20 min,取出冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

    儀器設(shè)備:高壓滅菌鍋,日本TomyKogyo公司;超純水系統(tǒng),Purelab公司;超凈工作臺、搖床、BSS300-WEI電子天平,德國賽多利斯;各種規(guī)格的移液槍,Eppendorf;常溫冰箱,海爾集團(tuán);電熱恒溫培養(yǎng)箱、廣口瓶、燒杯等其他小型儀器均為國產(chǎn)儀器。

    1.2 方法

    1.2.1 金花菌孢子懸浮液的制備 將活化后的金花菌接種至5%NaCl MYA培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)7 d;在超凈工作臺上刮取冠突曲霉孢子,放入無菌三角瓶內(nèi),倒入一定量的無菌水,放入適量滅菌的玻璃珠,150 r/min,震蕩30 min;過濾菌液,利用血球計數(shù)板計數(shù),保存于4℃冰箱備用[14]。

    1.2.2 單因素試驗 稱取10 g黑毛茶,裝于滅菌三角瓶內(nèi),添加不同含水量(20%、24%、28%、32%、36%、40%),蔗糖含量(0、1%、2%、3%、4%、5%)及接種量(160 μL、200 μL、240 μL、280 μL、320 μL、360 μL);除考察因素外,其余條件均為含水量28%,蔗糖含量2%,接種量為240 μL,溫度28℃下培養(yǎng)10 d,取出,45℃烘干1 d,測量孢子量,確定各單因素最佳水平,3次重復(fù)。

    1.2.3 金花菌發(fā)酵劑孢子濃度的測定 取1 g發(fā)酵劑,加入9mL無菌生理鹽水,150 r/min下震蕩30 min,2層紗布過濾,40 mL無菌水多次沖洗,將孢子液稀釋100倍。用血球計數(shù)板計數(shù)。

    孢子數(shù)(個/g)=總孢子數(shù)/(5×25×104)×100,式中5×25×104為血球計數(shù)板的格子數(shù),100為稀釋倍數(shù)。

    1.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

    在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以含水量(A)、蔗糖含量(B)及接種量(C)為試驗因素,以孢子量為響應(yīng)面值,進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗,其因素水平見表1。

    表1 茯磚茶金花發(fā)酵劑制備的響應(yīng)面試驗因素及水平

    1.4 統(tǒng)計分析

    采用Excel和SPSS對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計與分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同因素對金花發(fā)酵菌產(chǎn)孢量的影響

    從圖1可知,不同含水量、蔗糖含量及接種量的金花發(fā)酵菌產(chǎn)孢量變化。

    2.1.1 含水量 水分含量是影響茯磚茶發(fā)花的重要條件之一[15]。隨著含水量的增加,產(chǎn)孢量呈先增后減趨勢。當(dāng)含水量達(dá)32%時,其產(chǎn)孢量最大,為21.52×107個/g,比含水量為20%時高近10倍。說明含水量對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量的影響較大。

    圖1 不同含水量、蔗糖含量和接種量的金花菌產(chǎn)孢量

    2.1.2 蔗糖含量 蔗糖能為微生物提供能量及營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)蔗糖添加量為2%時產(chǎn)孢量最大,為19.13×107個/g,比沒有添加蔗糖的孢子含量高1倍多;當(dāng)蔗糖添加量為3%時,產(chǎn)孢量緩慢下降,為17.21×107個/g,說明適宜的蔗糖含量有利于孢子產(chǎn)量的提高,但當(dāng)蔗糖含量過大時,高濃度的蔗糖可能會形成一定的滲透壓,抑制菌絲的生長,影響產(chǎn)孢量[19]。

    2.1.3 接種量 當(dāng)接種量為200 μL時,其產(chǎn)孢量為7.5×107個/g。接種量低時,孢子數(shù)較少,產(chǎn)孢量低。當(dāng)接種量為320 μL時,產(chǎn)孢量最大,為17.74×107個/g;當(dāng)接種量為400 μL時,發(fā)酵劑產(chǎn)孢量逐漸降低。這是由于當(dāng)接種量過大時,孢子數(shù)較多,培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足微生物的需要,抑制了菌體的生長,因此產(chǎn)孢量呈下降趨勢[14]。

    2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化茯磚茶金花發(fā)酵劑的制備工藝

    2.2.2 不同因素的交互作用 當(dāng)?shù)雀呔€圖形呈橢圓形時交互作用顯著,呈圓形時交互作用不顯著。通過模型回歸方差分析表明,一次項A對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響不顯著(P=0.318 3),而B(P=0.008 4)和C(P=0.005 7)對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響顯著;交互項AB(P=0.141 8)對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響不顯著,等高線接近圓形(圖2); AC(P<0.000 1)及BC(P<0.000 1)對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響極顯著,等高線接近橢圓形(圖2);二次項A2(P<0.000 1)、B2(P<0.000 1)及C2(P<0.000 1)對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響極顯著。由P值可知,各因素對發(fā)酵劑產(chǎn)孢量影響的順序依次為接種量(C)>蔗糖含量(B)>含水量(A)。

    表2 響應(yīng)面試驗各處理茯磚茶金花發(fā)酵劑的產(chǎn)孢量

    圖2 不同因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

    2.2.3 最佳條件的確定及驗證 在獲得非線性回歸模型后,為求得最大產(chǎn)孢量,所得回歸擬合方程各自變量求一階偏導(dǎo)數(shù),求得次方程得到最大產(chǎn)孢量最優(yōu)條件為A=0.005、B=0.025、C=0.046換算成實際值為含水量31.96%、蔗糖2.98%、接種量321.92 μL,預(yù)測的最大產(chǎn)孢量為27.36×107個/g。

    將響應(yīng)面優(yōu)化后的發(fā)酵條件進(jìn)行3次驗證試驗,其產(chǎn)孢量分別為2.63×108個/g、27.6×107個/g和26.9×107個/g,與預(yù)測結(jié)果27.36×107個/g基本一致,表明該模型準(zhǔn)確性且實用性高,能夠預(yù)測產(chǎn)孢量。

    3 討論

    茯磚茶的發(fā)花工藝對茯磚茶的品質(zhì)至關(guān)重要,與傳統(tǒng)的自然發(fā)花相比,添加金花菌發(fā)酵劑能縮短散茶發(fā)花時間、有效抑制雜菌的生長。1991年,黃建安[16]將2種誘發(fā)劑YFJ1和YFJ2添加到茯磚茶中;2007年,楊秀芳等[17]將天然助花劑添加到茯磚茶中;2009年,張睿[18]發(fā)明了一款直投式紅茶菌發(fā)酵劑;2012年,呂嘉櫪等[19]發(fā)明了一種茯磚茶孢子粉;結(jié)果都發(fā)現(xiàn)對發(fā)花作用比較顯著,并有利于產(chǎn)品和品質(zhì)的改變,可以縮短發(fā)酵周期,且有降低雜菌的污染等作用。但由于在發(fā)花過程中外源物添加量過大,不適合工業(yè)化生產(chǎn);2014年,羅冰[20]利用麩皮、碳源物質(zhì)及NaCl等物質(zhì)制備發(fā)酵劑;2018年,周國慶等[14]在前人研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化了培養(yǎng)基配方,以含水量、氯化鈉濃度及接種量制備液體培養(yǎng)基及對發(fā)花促進(jìn)效果較好等。但是每次接種都需要洗金花菌的孢子液,儲存時間也較短,不利于工廠化推廣。

    制備發(fā)酵劑要嚴(yán)格控制無菌環(huán)境外,影響發(fā)酵劑的內(nèi)在因素也很多,其涉及到制備工藝的每個環(huán)節(jié)。其中含水量是影響發(fā)酵劑的重要條件之一,金花菌—冠突曲霉只有吸收了茶葉中的營養(yǎng)成分才能生長,營養(yǎng)和吸收都需要以水為介質(zhì)[21];賈洪信等[22]研究散茶發(fā)花主要因素發(fā)現(xiàn),蔗糖處理對發(fā)花有一定的影響,加糖直接提供了冠突曲霉的營養(yǎng)條件且有利于發(fā)花,但大規(guī)模生產(chǎn)中加糖,發(fā)花成本較高;接種量是影響散茶發(fā)花的一個重要指標(biāo),歐陽梅等[23-25]在茯磚茶散茶發(fā)花的技術(shù)研究表明,菌液接種能提高發(fā)酵茶的有益菌數(shù)量,同時提高了茶葉的感官品質(zhì),是提高發(fā)酵茶質(zhì)量和產(chǎn)量的有效途徑[13]。但直接用菌液接種有可能加大污染幾率、操作過程繁瑣以及需要大量的菌液。

    在前人的研究基礎(chǔ)上,開發(fā)了新型發(fā)酵劑,通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵劑最優(yōu)配方。研究結(jié)果表明,茯磚茶金花發(fā)酵劑的最佳制備條件為以10 g黑毛茶為基質(zhì),添加含水量31.96%、蔗糖含量2.98%、接種量321.92 μL,28℃條件下,培養(yǎng)10 d,該條件下的產(chǎn)孢量可達(dá)27.36×107個/g。

    4 結(jié)論

    直接用黑毛茶為基質(zhì)的發(fā)酵劑相對于利用麩皮等為基質(zhì)要簡單,使用便利、儲藏時間長且成本更低,優(yōu)化的工藝參數(shù)經(jīng)濟可行,孢子產(chǎn)量更高及發(fā)花品質(zhì)較好,更加適宜進(jìn)行工廠化推廣應(yīng)用,可為下一步茯磚茶散茶發(fā)花的工業(yè)生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。

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