當(dāng)歸多糖減輕癲癇幼鼠海馬組織炎癥及凋亡的作用及機(jī)制

陳治江，樊啟紅

癲癇是兒科常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電為特征，伴有學(xué)習(xí)記憶等神經(jīng)功能損害。海馬是調(diào)控學(xué)習(xí)記憶功能的重要腦區(qū)，癲癇發(fā)病過程中海馬組織炎癥反應(yīng)的激活與學(xué)習(xí)記憶功能的損害密切相關(guān)[1.2]。研究顯示，Toll 樣受 體4（Toll like receptor 4，TLR4）/核 因 子-κ B（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的激活與癲癇發(fā)病過程中海馬組織炎癥反應(yīng)的激活密切相關(guān)，該通路激活后造成腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、高遷移率族蛋白B1（high mobility cluster protein B1，HMGB1）大量釋放，引起海馬組織炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡發(fā)生，造成海馬神經(jīng)元損傷[3]。

當(dāng)歸多糖（angelica polysaccharides，APS）是中藥材當(dāng)歸中的活性成分之一，有抗炎、抗凋亡、抗氧化作用。APS 能夠減輕糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠的周圍神經(jīng)損傷并抑制TLR4/NF-κB 通路的激活[4,5]。但APS 對(duì)癲癇是否有療效及其可能的機(jī)制尚不清楚。本研究即以癲癇幼鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探究APS對(duì)癲癇的治療作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3 周齡的雄性SD 幼鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2018-0001。

1.1.2 主要試劑 戊四氮購自上海翊圣生物科技有限公司；APS購自上海聯(lián)碩寶為生物科技公司；TLR4/NF-κB 信號(hào)通路激動(dòng)劑脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自Sigma 公司；HE 染色試劑盒、TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒為上海碧云天公司；TNF-α、IL-1β、HMGB-1 的酶聯(lián)免疫吸附法（Elisa）檢測(cè)試劑盒購自 上 海 酶 聯(lián) 公 司；cleaved caspase-3、bax、bcl-2、TLR4、NF-κB、β-actin一抗購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 SD 幼鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、模型+APS組、模型+APS+LPS組，每組各8只。除對(duì)照組之外的3組均采用戊四氮點(diǎn)燃建立癲癇模型：單次腹腔注射戊四氮60 mg/kg，參照Racine 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，癲癇發(fā)作≥4 級(jí)且持續(xù)30 min 以上認(rèn)為造模成功，對(duì)于發(fā)作時(shí)間超過120 min 的幼鼠給予10%水合氯醛0.3 mL/kg 腹腔注射以阻止癲癇發(fā)作；對(duì)照組給予等劑量生理鹽水單次腹腔注射。造模成功后，模型+APS組給予200 mg/kg APS腹腔注射，1 次/d，連續(xù)3 d，模型+APS+LPS 組給予200 mg/kg APS 及0.1 mg/kg LPS 腹腔注射，1 次/d，連續(xù)3 d；對(duì)照組、模型組給予等劑量生理鹽水腹腔注射，1 次/d，連續(xù)3 d。

1.2.2 腦電圖檢測(cè) 末次給藥后24 h 進(jìn)行腦電圖檢測(cè)，采用RM6240 型多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄腦電圖波形并計(jì)算腦電頻率及波幅。

1.2.3 血清及海馬組織中細(xì)胞因子的檢測(cè) 各組完成腦電圖檢測(cè)后取4只幼鼠，經(jīng)右心室取血，離心收集血清，采用Elisa試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β、HMGB-1的含量；而后處死幼鼠，分離右側(cè)海馬組織適量，加入生理鹽水制成質(zhì)量體積比為10%的勻漿液，采用Elisa試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β、HMGB-1的含量。

1.2.4 海馬組織中蛋白表達(dá)的檢測(cè) 各組完成腦電圖檢測(cè)后取4 只幼鼠，取右側(cè)海馬組織適量，常規(guī)法行Western Blot 檢測(cè)cleaved caspase-3、bax、bcl-2、TLR4、NF-κB、的表達(dá)水平。

1.2.5 海馬組織細(xì)胞凋亡率的檢測(cè) 各組完成腦電圖檢測(cè)后取8 只幼鼠，取左側(cè)海馬組織做冰凍切片，片厚10 μm，采用TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率%=TUNEL陽性染色細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性染色細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布以及方差齊性的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用方差分析；組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組幼鼠腦電圖參數(shù)的比較

與對(duì)照組比較，模型組幼鼠腦電頻率顯著降低（P＜0.05），波幅顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，模型+APS組幼鼠腦電頻率顯著增加（P＜0.05），波幅顯著降低（P＜0.05）；與模型+APS 組比較，模型+APS+LPS 組幼鼠腦電頻率顯著降低（P＜0.05），波幅顯著升高（P＜0.05），見表1。

2.2 各組血清炎癥細(xì)胞因子含量的比較

表1 各組幼鼠腦電頻率及波幅的比較（±s）

表1 各組幼鼠腦電頻率及波幅的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與模型+APS組比較，③P＜0.05

組別對(duì)照組模型組模型+APS組模型+APS+LSP組只數(shù)8888腦電頻率/(次/s)13.58±2.62 4.82±0.89①10.47±2.44①②5.01±0.94①③腦電波幅/mV 60.89±11.38 414.58±88.39①104.57±21.35①②409.33±91.37①③

與對(duì)照組比較，模型組血清TNF-α、IL-1β和HMGB-1 的含量顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，模型+APS 組血清TNF-α、IL-1β和HMGB-1 的含量顯著降低（P＜0.05）；與模型+APS 組比較，模型+APS+LPS 組幼鼠血清中TNF-α、IL-1β和HMGB-1的含量顯著升高（P＜0.05），見表2。

2.3 各組海馬組織中炎癥細(xì)胞因子含量的比較

與對(duì)照組比較，模型組幼鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和HMGB-1的含量顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，模型+APS組幼鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和HMGB-1的含量顯著降低（P＜0.05）；與模型+APS組比較，模型+APS+LPS組幼鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β和HMGB-1的含量顯著升高（P＜0.05），見表3。

2.4 各組海馬組織細(xì)胞凋亡率的比較

與對(duì)照組比較，模型組海馬組織細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，模型+APS組幼鼠海馬組織的細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與模型+APS組比較，模型+APS+LPS組幼鼠海馬組織的細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見表4。

2.5 各組海馬組織中凋亡基因及信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較

與對(duì)照組比較，模型組海馬組織的Cleaved caspase-3、Bax、TLR4 和NF-κB 的表達(dá)水平顯著增加，Bcl-2 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，模型+APS 組幼鼠海馬組織中Cleaved caspase-3、Bax、TLR4 和NF-κB 的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2 的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與模型+APS 組比較，模型+APS+LPS 組幼鼠海馬組織中Cleaved caspase-3、Bax、TLR4和NF-κB的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表5。

表2 各組血清TNF-α、IL-1β和HMGB-1含量比較（ng/L,±s）

表2 各組血清TNF-α、IL-1β和HMGB-1含量比較（ng/L,±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與模型+APS組比較，③P＜0.05

組別對(duì)照組模型組模型+APS組模型+APS+LPS組只數(shù)4444 TNF-α 32.58±8.79 114.72±21.34①45.47±9.34①②124.58±24.29①③組別對(duì)照組模型組模型+APS組模型+APS+LPS組IL-1β 3.11±0.75 22.75±5.62①4.48±0.94①②24.11±6.21①③HMGB-1 13.48±2.95 85.69±14.86①22.67±4.55①②101.57±21.57①③

表3 各組幼鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、HMGB-1含量的比較（ng/L,±s）

表3 各組幼鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、HMGB-1含量的比較（ng/L,±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與模型+APS組比較，③P＜0.05

組別對(duì)照組模型組模型+APS組模型+APS+LPS組只數(shù)4444 TNF-α 83.48±16.68 276.63±51.34①115.62±22.69①②294.76±62.38①③組別對(duì)照組模型組模型+APS組模型+APS+LPS組IL-1β 30.58±8.78 145.37±26.52①45.56±9.14①②160.49±31.44①③HMGB-1 47.68±9.24 189.49±31.45①62.47±10.49①②203.47±37.68①③

表4 各組海馬組織細(xì)胞凋亡率的比較（%,±s）

表4 各組海馬組織細(xì)胞凋亡率的比較（%,±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與模型+APS組比較，③P＜0.05

組別對(duì)照組模型組模型+APS組模型+APS+LPS組只數(shù)8888細(xì)胞凋亡率0 26.59±5.48①5.48±0.95①②28.17±7.67①③

3 討論

癲癇發(fā)作時(shí)，大腦神經(jīng)元同步異常放電，造成神經(jīng)元損害。海馬是受損的主要部位之一，表現(xiàn)為海馬組織炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡異常激活、海馬神經(jīng)元丟失，進(jìn)而造成學(xué)習(xí)記憶功能下降等神經(jīng)功能損害的臨床表現(xiàn)[6,7]。減輕海馬炎癥及神經(jīng)元凋亡在小兒癲癇的治療中具有重要意義。

表5 各組海馬組織中凋亡基因及信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較（±s）

表5 各組海馬組織中凋亡基因及信號(hào)通路蛋白表達(dá)的比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與模型+APS組比較，③P＜0.05

組別對(duì)照組模型組模型+APS組模型+APS+LPS組只數(shù)4444 Bcl-2 0.72±0.15 0.35±0.07①0.75±0.17①②0.21±0.07①③Bax 0.16±0.03 0.89±0.17①0.39±0.08①②0.94±0.18①③Cleaved caspase-3 0.14±0.03 0.84±0.18①0.33±0.09①②0.95±0.19①③TLR4 0.34±0.09 0.94±0.18①0.20±0.06①②0.88±0.17①③NF-κB 0.32±0.08 0.91±0.20①0.23±0.07①②0.81±0.19①③

APS 是中藥材當(dāng)歸中提取得到的活性成分，有抗炎、抗凋亡、抗氧化作用，對(duì)腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病等，有一定的輔助治療效果[8-10]。本研究創(chuàng)新性地將APS用于癲癇治療，以SD 幼鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象、通過戊四氮點(diǎn)燃的方法[11,12]建立癲癇模型后觀察到腦電頻率顯著降低、波幅顯著增加，表明癲癇造模成功；癲癇造模后給予APS腹腔注射干預(yù)，腦電頻率顯著增加、波幅顯著降低，表明APS緩解了癲癇幼鼠的腦部異常放電。

海馬組織炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的過度激活是小兒癲癇的重要特征，APS 的神經(jīng)保護(hù)作用與其抗炎和抗凋亡作用有關(guān)。在海馬組織炎癥反應(yīng)的激活中，TNF-α、IL-1β、HMGB-1是起重要作用的細(xì)胞因子，能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大[13,14]；在海馬組織細(xì)胞凋亡的激活中，線粒體途徑凋亡起重要作用，該途徑的bcl-2 具有抗凋亡作用，bax 具有促凋亡作用，最終通過調(diào)控cleaved caspase-3的表達(dá)來影響細(xì)胞凋亡[15,16]。本研究在癲癇模型幼鼠的海馬組織中觀察到TNF-α、IL-1β、HMGB-1 的含量及細(xì)胞凋亡率、bax 及cleaved caspase-3 的表達(dá)水平增加，bcl-2 的表達(dá)水平降低，表明癲癇幼鼠出現(xiàn)了海馬組織的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡過度激活。在癲癇造模后給予APS 干預(yù)，海馬組織中TNF-α、IL-1β、HMGB-1 的含量及細(xì)胞凋亡率、bax 及cleaved caspase-3 的表達(dá)水平降低，bcl-2 的表達(dá)水平增加，表明APS 對(duì)癲癇幼鼠海馬組織的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡具有抑制作用，與APS改善癲癇幼鼠腦部異常放電、減輕癲癇幼鼠海馬組織病理改變的作用吻合。

多項(xiàng)研究證實(shí)癲癇發(fā)病過程中海馬組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路過度激活[3,17]。本研究在使用APS治療癲癇幼鼠后觀察到海馬組織中TLR4、NF-κB的表達(dá)水平降低，提示APS對(duì)癲癇發(fā)病過程中海馬組織TLR4/NF-κB通路的激活具有抑制作用。加用了該信號(hào)通路的激動(dòng)劑LPS（聯(lián)合使用APS和LPS）后，海馬的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡均加重，提示TLR4/NF-κB 通路可能參與了APS對(duì)癲癇幼鼠海馬組織炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡的改善作用。

綜上所述，APS能夠減輕癲癇幼鼠海馬組織的炎癥反應(yīng)，減少海馬細(xì)胞凋亡，這一作用可能與TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。