定點偶聯(lián)技術(shù)在抗體藥物偶聯(lián)物中的應(yīng)用

李明瑩，汪琳，馬寧寧*

（1.沈陽藥科大學(xué)無涯創(chuàng)新學(xué)院，遼寧 沈陽 110016；2.沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

1 引言

化療是腫瘤前期治療的主要手段，化學(xué)藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，對正常細(xì)胞也會造成殺傷作用。為了提高藥物的腫瘤靶向性，抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）應(yīng)運而生。ADC 利用連接子將單克隆抗體（以下簡稱單抗）與小分子藥物連接（見圖1），利用單抗的特異性，ADC 可準(zhǔn)確地作用于靶點，降低藥物對正常細(xì)胞的毒副作用。ADC 兼具抗體藥物的特異性、穩(wěn)定性和小分子毒素對腫瘤細(xì)胞的藥效學(xué)特性，是目前抗腫瘤藥物研究的熱點方向之一[1-2]。至今共有10 款A(yù)DC 獲美國FDA 批準(zhǔn)上市（見表1）。

圖1 抗體藥物偶聯(lián)物結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Structural diagram of antibody-drug conjugates

傳統(tǒng)的ADC 利用抗體賴氨酸的氨基或打開鏈間二硫鍵獲得的半胱氨酸的巰基進(jìn)行偶聯(lián)，賴氨酸的氨基與活化的羧酸酯連接子通過酰胺鍵連接，半胱氨酸的巰基與馬來酰亞胺基團(tuán)反應(yīng)[3-4]，其偶聯(lián)示意圖如圖2 所示。一個抗體分子包含了80 ～ 90 個賴氨酸，偶聯(lián)可能會發(fā)生在將近40 個不同賴氨酸殘基上，打開鏈間二硫鍵會得到多個半胱氨酸殘基，同時破壞了抗體分子的完整性，因此傳統(tǒng)的ADC 是高度異質(zhì)混合物，其均一性差，穩(wěn)定性低，影響藥效及治療窗[5]。定點偶聯(lián)技術(shù)可以實現(xiàn)抗體與小分子毒素定點、定量偶聯(lián)，通過該技術(shù)獲得的ADC具有合適的藥抗比（drug antibody ratio，DAR），均一性高，穩(wěn)定性好，批次間重現(xiàn)性高，具有更好的活性和藥動學(xué)特性，同時也更適用于ADC 的大規(guī)模生產(chǎn)[6]。本文將對定點偶聯(lián)技術(shù)在ADC 開發(fā)中的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

表1 已獲FDA 批準(zhǔn)上市的抗體藥物偶聯(lián)物Table 1 Antibody-drug conjugates approved by FDA for marketing

圖2 非定點偶聯(lián)示意圖Figure 2 Schematic diagram of non-site-specific conjugation

2 引入非天然氨基酸的定點偶聯(lián)

天然氨基酸中可用于偶聯(lián)的氨基酸只有賴氨酸和半胱氨酸，非天然氨基酸可被構(gòu)建到重組蛋白中，獲得可與小分子藥物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的殘基側(cè)鏈。因此非天然氨基酸為ADC 的開發(fā)提供了一個新的技術(shù)手段。通過非天然氨基酸可以實現(xiàn)抗體-藥物位點特異性偶聯(lián)。蛋白質(zhì)在核糖體上的合成通過tRNA反密碼子與mRNA 密碼子識別來進(jìn)行[7]。Ambrx 公司引入可特異性識別非天然氨基酸的tRNA 和與之相對應(yīng)的氨酰tRNA 合成酶，在氨酰tRNA 合成酶的作用下，tRNA 與對應(yīng)的非天然氨基酸結(jié)合形成氨酰tRNA，再通過其反密碼子與mRNA 上的密碼子互補(bǔ)，使非天然氨基酸被整合到多肽鏈中，合成含非天然氨基酸的重組抗體[8]。

引入的非天然氨基酸通常為乙酰苯丙氨酸（1）、疊氮基甲基-L-苯基丙氨酸（2）和疊氮賴氨酸（3）。非天然氨基酸上帶有的酮基、疊氮基官能團(tuán)可與藥物連接子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，獲得DAR 均一的ADC。酮基可與羥胺基團(tuán)形成肟鍵（見圖3A），疊氮基團(tuán)可與炔基在銅的催化下形成1，2，3-三唑的環(huán)加成反應(yīng)（見圖3B），疊氮基團(tuán)還可以在沒有銅催化的情況下與環(huán)辛炔結(jié)合，發(fā)生疊氮-辛炔環(huán)加成反應(yīng)（見圖3C）[9-12]。引入非天然氨基酸的抗體與藥物連接子可定點、定量偶聯(lián)，獲得DAR 均一、藥效高、穩(wěn)定性好、安全性高的ADC，但也存在抗體表達(dá)困難，易產(chǎn)生免疫原性的弊端。Ambrx 公司的ARX788 是首個利用非天然氨基酸開發(fā)的抗體偶聯(lián)藥物，目前處于臨床研究階段。

圖3 引入非天然氨基酸的定點偶聯(lián)Figure 3 Site-specific conjugation with insertion of non-natural amino acids

3 酶法偶聯(lián)

酶具有高特異性和高效性，現(xiàn)也應(yīng)用于ADC的開發(fā)，抗體和小分子藥物可以利用酶法實現(xiàn)定點偶聯(lián)。酶法偶聯(lián)具備定點偶聯(lián)的優(yōu)勢，但也存在因引入額外序列而造成免疫原性的潛在弊端。以下將對4 種酶在ADC 開發(fā)中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

3.1 谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶

谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（TGase）催化谷氨酰胺與賴氨酸及其衍生物反應(yīng)，通過TGase 也可以實現(xiàn)抗體和藥物定點偶聯(lián)。野生型TGase 將藥物連接子的胺轉(zhuǎn)移到去糖基化的抗體重鏈Q(jìng)295 中（見圖4A）[13]。Innate Pharm 對抗體重鏈連接糖鏈的N297 進(jìn)行突變，再通過TGase 實現(xiàn)抗體藥物偶聯(lián)（見圖4B）[14]。輝瑞提出在抗體上插入谷氨酰胺標(biāo)記的LLQGA 五肽序列，通過TGase 特異性識別LLQGA 五肽序列中的谷氨酰胺（見圖4C），將藥物與其進(jìn)行偶聯(lián)[15]。

圖4 應(yīng)用谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行定點偶聯(lián)Figure 4 Site-specific conjugation using transglutaminase

3.2 分選酶

分選酶普遍存在于革蘭陽性菌中，具有轉(zhuǎn)肽催化作用，可特異性識別LPXTG 序列，并打開蘇氨酸和甘氨酸之間的肽鍵，插入重復(fù)的甘氨酸序列。通過這項技術(shù)，Beerli 等[16]在抗體的重鏈和輕鏈的C 末端插入了LPETG 序列，與帶有甘氨酸鏈的MMAE 偶聯(lián)（見圖5），從而實現(xiàn)抗體藥物定點偶聯(lián)。

圖5 應(yīng)用分選酶進(jìn)行定點偶聯(lián)Figure 5 Site-specific conjugation using sortase

3.3 甲酰甘氨酸生成酶

甲酰甘氨酸生成酶（FGE）可特異性識別CXPXR 五肽序列，將半胱氨酸的殘基替換成醛基，與二甲基化的2-（聯(lián)氨甲基）-3-吲哚發(fā)生反應(yīng)，在接近中性的pH 值下，通過四氫異喹啉合成（HIPS）反應(yīng)形成穩(wěn)定的碳碳鍵（見圖6）[17]。Redwood Bioscience 公司的專利SMARTag?技術(shù)即采用FGE來實現(xiàn)抗體與藥物的定點偶聯(lián)[18]。

3.4 類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶

LegoChemBio 利用類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶技術(shù)開發(fā)ADC[19]。在抗體C 端插入由幾個甘氨酸序列連接的CAAX 序列，利用類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶將異戊二烯基連接在CAAX 序列的半胱氨酸殘基上，再與連接子發(fā)生肟連接反應(yīng)（見圖7），從而實現(xiàn)抗體藥物定點偶聯(lián)[20]。

圖6 應(yīng)用甲酰甘氨酸生成酶進(jìn)行定點偶聯(lián)Figure 6 Site-specific conjugation using formatylglycine generating enzyme

圖7 應(yīng)用類異戊二烯轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行定點偶聯(lián)Figure 7 Site-specific conjugation using isoprene transferase

4 糖鏈重塑和糖基偶聯(lián)

抗體在Fc 段含有糖鏈，可利用糖鏈重塑和糖基進(jìn)行抗體藥物定點偶聯(lián)。研究人員利用β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（Gal T）和α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶（Sial T）將半乳糖和唾液酸殘基轉(zhuǎn)移到抗體的天然糖基上，然后應(yīng)用高碘酸鈉（NaIO4）氧化半乳糖或唾液酸中的順乙二醇基團(tuán)，引入醛基，利用醛與含有肼或伯胺官能團(tuán)的分子發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而實現(xiàn)定點偶聯(lián)，得到DAR 均一的ADC（見圖8A）[21-22]。文獻(xiàn)報道，還可利用糖基轉(zhuǎn)移酶引入疊氮基，利用疊氮與環(huán)辛炔反應(yīng)形成穩(wěn)定的ADC（見圖8B）[23-24]。

圖8 應(yīng)用糖鏈重塑和糖基進(jìn)行定點偶聯(lián)Figure 8 Site-specific conjugation using saccharide chain remodeling and saccharide

5 基于反應(yīng)性半胱氨酸的定點偶聯(lián)

抗體表面不存在可以用于偶聯(lián)反應(yīng)的半胱氨酸殘基，其均以二硫鍵的形式存在。例如最常見的IgG1，其含有4 個鏈間二硫鍵和12 個鏈內(nèi)二硫鍵，使用傳統(tǒng)的偶聯(lián)方法，要先打開4 個鏈間二硫鍵來獲得游離巰基，該方法制備的ADC 的DAR 值在0 ～ 8之間，均一性較差。通過基于反應(yīng)性半胱氨酸的定點偶聯(lián)可獲得DAR 值確定的ADC。

5.1 基于鏈間二硫鍵改造的定點偶聯(lián)

抗體的輕重鏈由鏈間二硫鍵連接，打開抗體的鏈間二硫鍵對抗體結(jié)構(gòu)和功能的影響較小，可獲得確定的反應(yīng)性半胱氨酸，因此可通過鏈間二硫鍵改造實現(xiàn)抗體藥物定點偶聯(lián)。選擇合適的還原劑將抗體的鏈間二硫鍵還原，再將連有二磺酸鹽（見圖9A）或二溴雙反應(yīng)試劑（見圖9B）的小分子毒素與還原的抗體反應(yīng)，從而實現(xiàn)抗體藥物定點偶聯(lián)[25-26]。但利用該方法獲得的ADC 存在偶聯(lián)效率低的弊端。

圖9 基于鏈間二硫鍵改造的定點偶聯(lián)Figure 9 Site-specific conjugation based on interchain disulfide bond modification

5.2 Thio-Mab 技術(shù)

Thio-Mab 這一概念最早由Genentech 提出，是基于噬菌體展示的方法，在抗體的Fab 表面篩選出反應(yīng)性半胱氨酸的突變位點。Genentech 最終選擇曲妥珠單抗的LC-V110 和HC-A114（Kabat 編號）進(jìn)行半胱氨酸突變，利用三（2-羧乙基）膦（TCEP）或二硫蘇糖醇（DTT）只打開抗體鏈間二硫鍵，并使突變的半胱氨酸的巰基處于自由態(tài)，再應(yīng)用CuSO4或脫氫抗壞血酸（dhAA）將鏈間二硫鍵重新連接，最后利用游離巰基與藥物連接子反應(yīng)，實現(xiàn)抗體藥物定點偶聯(lián)（見圖10）[27]。

圖10 基于Thio-Mab 技術(shù)的定點偶聯(lián)Figure 10 Site-specific conjugation based on Thio-Mab technique

5.3 插入半胱氨酸

基于Thio-Mab 技術(shù)的成功，Dimasi 等[28]采用插入半胱氨酸的方法實現(xiàn)抗體和藥物分子的定點偶聯(lián)。在重鏈第239 位氨基酸后插入半胱氨酸，成功引入和藥物連接子反應(yīng)的巰基，將其與馬來酰亞胺基團(tuán)發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，從而獲得ADC（見圖11）。該方法引入額外的半胱氨酸可能會導(dǎo)致二硫鍵錯配。

5.4 特殊位點半胱氨酸突變

除上述介紹的利用半胱氨酸進(jìn)行偶聯(lián)的方法外，Shiraishi 等[29]和Shinmi 等[30]選擇抗體上特殊的位點進(jìn)行半胱氨酸突變，突變后的抗體有2 個游離巰基。與Thio-Mab 技術(shù)相比，該方法省去先還原再氧化的反應(yīng)流程，可以與含馬來酰亞胺基團(tuán)的藥物連接子直接偶聯(lián)，獲得DAR 約等于2 的ADC（見圖12）。該方法對抗體序列進(jìn)行的改造，對突變位點要求較高，需進(jìn)行大量位點篩選工作。

圖11 通過插入半胱氨酸實現(xiàn)定點偶聯(lián)Figure 11 Site-specific conjugation using cysteine insertion

圖12 通過特殊位點半胱氨酸突變實現(xiàn)定點偶聯(lián)Figure 12 Site-specific conjugation using special cystine mutation

6 其他方法

除以上定點偶聯(lián)方法外，硒代半胱氨酸和絲氨酸代半胱氨酸也可以實現(xiàn)定點偶聯(lián)。

6.1 硒代半胱氨酸

硒代半胱氨酸與半胱氨酸非常相似，區(qū)別是氨基酸結(jié)構(gòu)中的一個硫原子被替換為了硒原子。硒代半胱氨酸的硒醇組比半胱氨酸的硫醇組更親核，因此抗體可在弱酸性和還原條件下進(jìn)行偶聯(lián)，而無需將抗體再氧化。這種在抗體中插入硒代半胱氨酸，獲得的工程化抗體被稱為“selenomabs”，可以實現(xiàn)在不改變該抗體完整結(jié)構(gòu)的情況下進(jìn)行區(qū)域特異性偶聯(lián)的目的[31]。

6.2 絲氨酸代半胱氨酸

McDonagh 等[32]開發(fā)了絲氨酸代半胱氨酸的方法來實現(xiàn)定點偶聯(lián)。打開鏈間二硫鍵后，利用絲氨酸取代4 或6 個鏈間半胱氨酸，將反應(yīng)性半胱氨酸的數(shù)量減少到4 或2 個，從而生成均一的ADC。

7 結(jié)語

ADC 是腫瘤治療的研究熱點之一，過去10 年間多款A(yù)DC 上市，帶動ADC 迅速發(fā)展，現(xiàn)有多款A(yù)DC 處于臨床在研階段。ADC 也開始出現(xiàn)更多形式的單抗，如納米抗體、抗體Fab 片段、單鏈可變肽段等；連接子的設(shè)計亦在不斷改進(jìn)，越來越多的小分子藥物將被用于偶聯(lián)抗體。隨著偶聯(lián)技術(shù)的發(fā)展與工藝的完善，ADC 會向著高均一性、高穩(wěn)定性、高藥效的方向發(fā)展，癌癥治療的前景必定柳暗花明。