濃香型大曲中降解生物胺菌株的篩選及應(yīng)用

曾玉雪，羅惠波,3，余東，黃丹,3，郭輝祥，鄒永芳*

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644000)2(舍得酒業(yè)股份有限公司， 中國(guó)生態(tài)釀酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，四川 遂寧，629200) 3(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓，644000)

生物胺(biogenic amines，BAs)是一類(lèi)低分子質(zhì)量的含氮有機(jī)堿，具有脂肪族、芳香族和雜環(huán)結(jié)構(gòu)[1]，是細(xì)胞內(nèi)正常的活性成分[2]。游離氨基酸經(jīng)脫羧酶作用和醛被胺化作用后生成生物胺，在胺氧化酶作用下被氧化降解[3-4]。微量的生物胺對(duì)身體有益，促進(jìn)人體新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育，但過(guò)量攝入時(shí)胺氧化酶活性不足，將引發(fā)一系列疾病反應(yīng)產(chǎn)生毒害作用，尤其解毒機(jī)制有缺陷的人易受到威脅[5-7]。常見(jiàn)的生物胺如組胺、酪胺、色胺和β-苯乙胺的中毒癥狀包括惡心、發(fā)熱、出汗、心悸和皮疹等[8]。

生物胺存在于各種食物中，如魚(yú)類(lèi)、肉類(lèi)、酒類(lèi)等發(fā)酵制品及水產(chǎn)品等富含蛋白質(zhì)和氨基酸的食品[9]。白酒生產(chǎn)原料中含有豐富的蛋白質(zhì)，發(fā)酵過(guò)程中會(huì)被降解為游離氨基酸，在氨基酸脫羧酶的作用下會(huì)形成大量的生物胺，影響了白酒的安全性[10]。白酒中生物胺的相關(guān)研究較多。杜木英等[11]通過(guò)自動(dòng)氨基酸分析研究白酒發(fā)酵過(guò)程中生物胺的動(dòng)態(tài)變化，僅鑒定了少數(shù)生物胺。溫永柱等[12]利用液液萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)完成了白酒中生物胺的定性研究，首次在白酒中檢測(cè)出9種生物胺，腐胺、尸胺、甲胺、乙胺、吡咯烷、異戊胺、環(huán)己胺、環(huán)庚胺、環(huán)戊胺，采用反相高效液相色譜法進(jìn)行定量分析，得出吡咯烷含量最高[13]。范文來(lái)等[14]發(fā)現(xiàn)改變酒醅發(fā)酵和蒸餾過(guò)程可以控制生物胺含量，以蛋白質(zhì)含量較低的谷物作釀酒原料也能降低白酒中生物胺含量；另外，也可通過(guò)在發(fā)酵底物曲藥、酒醅中選擇無(wú)氨基酸脫羧酶活性或添加有胺氧化酶和胺脫氫酶活性的微生物來(lái)降低白酒中生物胺的含量[15]。

食品中生物胺的控制方法主要有輻照、控制衛(wèi)生及使用添加劑，在發(fā)酵食品中通過(guò)添加降解生物胺的微生物從而降低其生物胺含量的方法愈來(lái)愈受重視。目前已報(bào)道的文章主要是從泡菜[16]、臭豆腐[17]、豆瓣醬[18]以及發(fā)酵肉制品[19]篩選出具有降解生物胺的菌株，而關(guān)于酒曲中降解生物胺菌株的研究很少。因此，從酒曲中篩選出降解生物胺的菌株，對(duì)生產(chǎn)出更健康安全的酒產(chǎn)品具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 培養(yǎng)基

YPD瓊脂培養(yǎng)基：1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

YPD肉湯培養(yǎng)基：1%酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

YPD小麥浸提液培養(yǎng)基：150 g小麥用1 L去離子水浸泡過(guò)夜，煮沸60 min，4層紗布過(guò)濾得到小麥浸提液，按YPD肉湯培養(yǎng)基配方配制YPD小麥浸提液培養(yǎng)基，分裝，250 mL三角瓶的裝液量為50 mL，滅菌冷卻。

1.1.2 化學(xué)試劑

腐胺鹽酸鹽、尸胺鹽酸鹽、甲胺鹽酸鹽、乙胺鹽酸鹽、吡咯烷、異戊胺、環(huán)己胺、環(huán)庚胺(純度均>98%)、丹磺酰氯(dansyl chlorie,DNSCI)，美國(guó)sigma公司；環(huán)戊胺(純度為98%)，日本TCI公司；乙腈、甲醇(均為色譜級(jí))、丙酮、乙醚(均為分析純)，成都市科隆化學(xué)品有限公司；氯化鈉、碳酸氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸(均為分析純)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖肉湯培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；超純水，由電阻率為18.25 Ω的儀器制備。

1.1.3 儀器與設(shè)備

LEICA DM500型光學(xué)顯微鏡，德國(guó)Leica有限公司；1260 Infinity型高效液相色譜儀，美國(guó)Alilent有限公司；BF-2000M型氮?dú)獯蹈蓛x，青島科迪博電子科技有限公司；HWS-12型電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；STARTER2100型酸度計(jì)，美國(guó)OHAUS儀器有限公司；BSC-400型恒溫恒濕箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；QL-902渦旋儀，海門(mén)市其林貝爾儀器制造公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 生物胺降解菌的篩選

1.2.1.1 生物胺降解菌的初篩

稱(chēng)取25 g大曲樣品到225 mL無(wú)菌生理鹽水中，渦旋振蕩1 min；吸取25 mL上清液至225 mL無(wú)菌生理鹽水中，再依次吸取1 mL～9 mL無(wú)菌生理鹽水，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋液，然后在10-3、10-4、10-5、10-6分別吸取100 μL至YPD瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，28 ℃培養(yǎng)24 h。挑取不同菌落形態(tài)、大小、質(zhì)地、顏色、透明度、生長(zhǎng)位置的單菌落，以平板劃線(xiàn)法反復(fù)分離純化，直至得到純菌落，菌株斜面保藏于4 ℃，用于生物胺的降解研究。

1.2.1.2 生物胺降解菌的復(fù)篩

將大曲中篩選的微生物斜面于28 ℃活化24 h，添加9 mL無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，血球計(jì)數(shù)板調(diào)整菌濃至數(shù)量級(jí)為106個(gè)/mL，接種至含有腐胺、尸胺、甲胺、乙胺、吡咯烷、異戊胺、環(huán)己胺、環(huán)庚胺、環(huán)戊胺100 mg/L的50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，接種量為6%，接種菌株為樣品組，不接種菌株為空白對(duì)照組，按酵母菌一般特性設(shè)置培養(yǎng)條件，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d。采用高效液相色譜法測(cè)定其生物胺的含量，選出生物胺降解率最高的菌株，降解率計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

1.2.2 生物胺含量的測(cè)定

采用外標(biāo)法測(cè)定生物胺含量，生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液及相關(guān)試劑的配制參考GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測(cè)定》[20]。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

按1 000 mg/L稱(chēng)取一定量的生物胺配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別吸取1 mL各生物胺單組分標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于同一個(gè)10 mL的容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容，配成100 mg/L的生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。生物胺標(biāo)準(zhǔn)混合使用液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)|(zhì)量濃度分別為80、60、40、20、10、5 mg/L，得到生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.2.2 發(fā)酵液中生物胺含量的測(cè)定

衍生方法參考GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測(cè)定》[20]和 FRAS等[21]并稍作改動(dòng)。取1 mL生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于15 mL離心管中，依次加入1 mL飽和碳酸氫鈉溶液，1 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液提供一個(gè)堿性環(huán)境，1 mL 10 mg/mL DNSCI溶液，渦旋混勻1 min，于40 ℃恒溫水浴具塞暗處理30 min，15 min搖勻1次，取出，加入1 mL飽和氯化鈉溶液，40 ℃恒溫10 min以終止衍生化，取出冷卻至室溫，加入3 mL×2次乙醚，振蕩2 min，靜置分層后轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相至新的15 mL離心管，合并2次萃取液，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?。加? mL乙腈溶解殘留物，振蕩混勻后，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)定。

1.2.2.3 生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的柱前衍生

樣品前處理：取5 mL發(fā)酵液于15 mL離心管中，6 000×g離心20 min。取1 mL上清液衍生處理，同標(biāo)品。

1.2.2.4 高效液相色譜條件

色譜條件參考陳智毅等[22]的方法，并稍作修改，色譜柱為Angilent ZORBAX SB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.4 mL/min，流動(dòng)相A乙腈、B超純水，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序表Table 1 Gradient elution program list

1.2.3 生物胺降解菌的鑒定

1.2.3.1 生物按降解菌的形態(tài)學(xué)鑒定

觀察菌落顏色、大小、形態(tài)、質(zhì)地、透明度、邊緣整齊性、表面光滑性等，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[23]確認(rèn)其為酵母菌。

1.2.3.2 生物胺降解菌的分子生物學(xué)鑒定

提取降解率最高的菌株基因組DNA的方法參考文獻(xiàn)[24]所述并稍作改動(dòng)，擴(kuò)增引物為：NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′；NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′，進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，PCR程序條件為：94 ℃預(yù)變形4 min后進(jìn)入以下循環(huán)，94 ℃變形45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；70 ℃修復(fù)延伸10 min，40 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序后，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列對(duì)比，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 生物胺降解菌的生長(zhǎng)特性研究

1.2.4.1 溫度耐受性

(1)菌種斜面于28 ℃活化24 h后，用9 mL無(wú)菌生理鹽水制成菌懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整菌濃至1×106CFU/mL，按三角瓶裝液量的6%接種至無(wú)菌小麥浸提液配制的YPD液體培養(yǎng)基，8層紗布封口；

(2)設(shè)置培養(yǎng)溫度為25、30、35、40、45 ℃，于180 r/min 恒溫振蕩器培養(yǎng)48 h，再于YPD瓊脂培養(yǎng)基平板上活菌計(jì)數(shù)，確定菌株奧默柯達(dá)酵母(Kodamaeaohmeri，HJM)的最高耐受溫度。

(3)若在已設(shè)置培養(yǎng)溫度中沒(méi)有得到其具體耐受溫度，則縮小溫度范圍繼續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4.2 乙醇耐受性

小麥浸提液配制YPD液體培養(yǎng)基，裝液量為50 mL，滅菌后于無(wú)菌環(huán)境下加入乙醇，體積分?jǐn)?shù)為6%、8%、10%、12%、14%，按體積分?jǐn)?shù)6%的接種量接入菌液，然后在28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后平板活菌計(jì)數(shù)，確定HJM的最高耐受乙醇濃度。

1.2.4.3 酸耐受性

小麥浸提液配制YPD液體培養(yǎng)基，裝液量為50 mL，用乳酸調(diào)節(jié)pH值為2、3、4、5、6，滅菌后按6%的接種量接入菌液，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后平板活菌計(jì)數(shù)，確定菌株HJM的最高耐酸pH。

1.2.4.4 糖耐受性

小麥浸提液配制YPD液體培養(yǎng)基，裝液量為50 mL，酵母直接利用葡萄糖，因此加入葡萄糖調(diào)節(jié)糖質(zhì)量濃度為100、200、300、400、500、600 g/L，滅菌后按6%的接種量接入菌液，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后平板活菌計(jì)數(shù)，確定菌株HJM的最高耐受糖濃度。

1.2.5 生物胺降解菌在固態(tài)發(fā)酵條件下對(duì)生物胺的降解

酵母的最適生長(zhǎng)溫度是28～30 ℃，本實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)濃香型大曲生產(chǎn)中溫、濕度的變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)28 ℃左右時(shí)對(duì)應(yīng)濕度為90%左右[25]，在實(shí)驗(yàn)室條件下以小麥為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)測(cè)定該菌對(duì)生物胺的降解能力。稱(chēng)取一定量小麥，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水進(jìn)行潤(rùn)料4 h，粉碎呈2、4、6瓣，加入20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))水，拌勻，以100 mg/L分別加入9種生物胺，再按5%的接種量加入菌液，以不添加菌液作對(duì)照，研究菌株HJM固態(tài)發(fā)酵條件下對(duì)生物胺的降解率，通過(guò)生長(zhǎng)特性研究得到其最適生長(zhǎng)溫度，恒溫恒濕培養(yǎng)2 d后測(cè)定其生物胺含量。另外，相同方法制作小麥固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，不外加生物胺相同條件下培養(yǎng)2 d，以研究其本身是否含有生物胺。

發(fā)酵完成后，取10 g發(fā)酵樣品到100 mL三角瓶中，加入20 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸溶液，30 ℃ 200 r/min 振蕩30 min，轉(zhuǎn)移上清液到50 mL容量瓶，重復(fù)1次，最后用5%三氯乙酸定容，取1 mL衍生，方法同標(biāo)品。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用 SPSS Statistic 25.0 軟件進(jìn)行分析，采用 Origin 2019b軟件進(jìn)行繪圖，使用鄧肯氏多重比較在5%水平下評(píng)估樣品間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺標(biāo)曲制作

采用高效液相色譜法測(cè)定生物胺含量，單標(biāo)定性，混標(biāo)定量，得到9種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品混合液相色譜圖，如圖1所示。

1-甲胺；2-乙胺；3-環(huán)戊胺；4-腐胺；5-環(huán)己胺；6-尸胺； 7-環(huán)庚胺；8-異戊胺；9-吡咯烷圖1 九種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品混合液相色譜圖Fig.1 The mixed liquid chromatogram of 9 biological amines standard

9種生物胺的不同濃度采用高效液相色譜法測(cè)定其峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程及相關(guān)系數(shù)如表2所示。9種生物胺在5～80 mg/L線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均>0.99。

2.2 生物胺降解菌的篩選

從大曲中篩選出16株菌，編號(hào)為J1～J16，對(duì)其進(jìn)行9種生物胺降解研究，其中J1～J9這幾株菌的降解情況略好，其降解率如表3所示，編號(hào)為J5的菌株降解的生物胺種類(lèi)最多，只有尸胺和環(huán)庚胺濃度在檢測(cè)限以下無(wú)法測(cè)出，其生物胺降解率也顯著高于其他菌株(P<0.05)，其中對(duì)環(huán)己胺的降解效果最好，降解率達(dá)38.07%。因此，選擇編號(hào)為J5的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

表2 九種生物胺的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations and R2 of 9 biogenic amines

表3 菌株對(duì)生物胺的降解率 單位：%

2.3 生物胺降解菌的鑒定

2.3.1 生物胺降解菌的形態(tài)學(xué)鑒定

編號(hào)為J5的菌株對(duì)生物胺的降解效果最好，其在YPD瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和光學(xué)顯微鏡及電鏡掃描下的細(xì)胞形態(tài)特征如圖2所示。菌落呈圓形、顏色略黃、不透明、表面光滑、邊緣整齊，但在斜面培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，其邊緣會(huì)出現(xiàn)褶皺狀；其菌體呈圓形，出芽繁殖。

a-菌落形態(tài);b-光學(xué)顯微鏡圖;c-電鏡圖圖2 酵母菌J5的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characteristics of strain J5

2.3.2 生物胺降解菌的分子生物學(xué)鑒定

提取編號(hào)為J5的菌株基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到J5的16S rDNA序列，測(cè)序得到序列長(zhǎng)度為498 bp。將該菌株16S rDNA的測(cè)序結(jié)果在NCBI GeneBank中BLAST核酸庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，得到該菌株與Kodamaeaohmeriisolate K68的同源性高達(dá)100%。該菌株與模式菌株GU597323.1及其他近源菌株的16S rDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)如圖3所示，得到其與序列號(hào)為MK414670.1的奧默柯達(dá)酵母(K.ohmeri)的距離最近。因此，可初步確定編號(hào)為J5的菌株為奧默柯達(dá)酵母，將其命名為K.ohmeriHJM。

圖3 菌株J5的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree of strain J5

2.4 K.ohmeri HJM的生長(zhǎng)特性研究

K.ohmeriHJM在不同條件下的生長(zhǎng)狀況如圖4所示。由圖4-a可知，K.ohmeriHJM在30 ℃時(shí)生長(zhǎng)最好，與其他溫度差異極顯著(P<0.01)，40 ℃生長(zhǎng)減少，45 ℃時(shí)停止生長(zhǎng)。須在此范圍之間繼續(xù)試驗(yàn)，才可得其最高耐受溫度。繼續(xù)試驗(yàn)得到43 ℃時(shí)，菌株少量生長(zhǎng)，44 ℃時(shí)不再生長(zhǎng)，即得到K.ohmeriHJM的最高耐受溫度為43 ℃。

由圖4-b可知，隨著乙醇濃度增加菌株生長(zhǎng)總數(shù)減少，乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，菌株生長(zhǎng)較少，14%時(shí)停止生長(zhǎng)。繼續(xù)試驗(yàn)得乙醇體積分?jǐn)?shù)為13%時(shí)，只有少許菌株生長(zhǎng)，即得K.ohmeriHJM的最高耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%。

由圖4-c可知，pH值為6時(shí)菌株生長(zhǎng)情況最好，隨著環(huán)境酸度增加菌株生長(zhǎng)總數(shù)減少，pH值為3時(shí)有少許菌株生長(zhǎng)，pH值為2時(shí)菌株停止生長(zhǎng)，即得K.ohmeriHJM最高耐酸pH值為2。表明K.ohmeriHJM在過(guò)酸環(huán)境下生長(zhǎng)受到抑制，但具有一定耐酸性，在酸性環(huán)境下能生長(zhǎng)。

由圖4-d可知，隨著葡萄糖濃度的增加菌株生長(zhǎng)減少，500 g/L時(shí)相對(duì)減少，但其總數(shù)依然有2.95×108CFU/mL，生長(zhǎng)狀況良好。600 g /L時(shí)，依然有很多菌株生長(zhǎng)，即得到K.ohmeriHJM有較高的糖耐受性。

圖4 不同條件對(duì)K.ohmeri HJM生長(zhǎng)的影響Fig.4 The effect of different conditions on the growth of K.ohmeri HJM

2.5 K.ohmeri HJM在固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用

2.5.1 小麥固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中生物胺的含量

研究K.ohmeriHJM的溫度耐受性，于25～30 ℃ 分別培養(yǎng)48 h計(jì)數(shù)，得到其最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃。制作小麥固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，不添加生物胺不接種菌液，于28 ℃、90%下培養(yǎng)2 d，測(cè)定其生物胺含量，結(jié)果如表4所示?？傻玫叫←溁|(zhì)中含有一定量生物胺，其中吡咯烷含量最高，達(dá)到133.89 mg/kg，這與溫永柱等[13]研究的白酒中吡咯烷含量最高一致。

表4 小麥發(fā)酵基質(zhì)中生物胺的含量 單位:mg/kg

2.5.2 生物胺降解菌在小麥基質(zhì)中對(duì)生物胺的降解

小麥固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中含有一定量生物胺，但為更好地表征K.ohmeriHJM在固態(tài)發(fā)酵條件下對(duì)生物胺的降解能力，向小麥基質(zhì)中添加生物胺，接種菌液相同條件下進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定其生物胺含量如圖5所示。與未添加生物胺的小麥固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中生物胺的含量一致，吡咯烷含量最高，其次是環(huán)戊胺。樣品組中的生物胺含量顯著低于空白組，尤其是吡咯烷和環(huán)己胺，二者樣品組合空白組中的含量有極顯著差異，表明K.ohmeriHJM在固態(tài)發(fā)酵條件下降解生物胺的效果較好。

圖5 固態(tài)發(fā)酵條件下樣品中生物胺的含量Fig.5 The contents of biogenic amines in samples under solid-state fermentation conditions注：“*”表示樣品組與空白組相比有顯著差異(P<0.05)， “**”表示與空白組相比有極顯著差異(P<0.01)

K.ohmeriHJM在固態(tài)發(fā)酵條件下對(duì)不同生物胺的降解率如表5所示。環(huán)庚胺在檢測(cè)限以下無(wú)法測(cè)出，除此之外，其他幾種生物胺的降解率多在30%以上，對(duì)環(huán)戊胺的降解能力最強(qiáng)，降解率達(dá)到66.07%，其次是吡咯烷的降解率達(dá)到63.42%。固態(tài)發(fā)酵條件下，K.ohmeriHJM對(duì)生物胺的降解效果比在液態(tài)環(huán)境中更好，這可能是因?yàn)镵.ohmeriHJM在固態(tài)環(huán)境中利用小麥基質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)更旺盛，能更好地發(fā)揮作用降解生物胺。

3 結(jié)論

該研究從大曲中分離出16株酵母菌，將其接種到含有9種生物胺的小麥浸提液配制的YPD液體培

表5 K.ohmeri HJM在固態(tài)發(fā)酵中對(duì)生物胺的降解率 單位：%

養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，對(duì)其進(jìn)行生物胺降解研究，得到1株降解效果最好的編號(hào)為J5的酵母菌。對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，得到其為奧默柯達(dá)酵母(K.ohmeri)，將其命名為K.ohmeriHJM。在固態(tài)發(fā)酵條件下，不添加生物胺不接種菌液，直接將小麥發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定其中含有一定量的生物胺，吡咯烷含量最高。將奧默柯達(dá)酵母接種到小麥固態(tài)基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)，以未接菌種為空白對(duì)照，得到其對(duì)幾種生物胺的降解率分別為腐胺(39.19±0.08)%、尸胺(33.77±0.06)%、甲胺(32.44±0.06)%、乙胺(23.39±0.06)%、吡咯烷(63.42±0.02)%、異戊胺(49.83±0.07)%、環(huán)己胺(49.73±0.03)%、環(huán)戊胺(66.07±0.08)%，尤其對(duì)環(huán)戊胺、吡咯烷的降解效果很好。

該菌株對(duì)腐胺、尸胺、甲胺、吡咯烷等都有較好的降解效果，可以降低以小麥為原料制作的酒曲中生物胺的含量，在白酒釀造中曲藥的意義重大，因此降低曲中生物胺含量可為安全生產(chǎn)白酒提供保障。本研究從大曲中分離出降解生物胺的菌株，可為白酒中生物胺的調(diào)控提供一定參考價(jià)值。另外，對(duì)K.ohmeriHJM進(jìn)行生長(zhǎng)特性研究，得到其具有較高的耐糖性、耐酸性和耐乙醇性，推測(cè)其在白酒釀造的酸性環(huán)境中亦能較高效地降解生物胺。