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    中華管鞭蝦不同部位蝦青素的提取及特征分析

    2021-05-08 08:41:24賈喆劉欣妍張肖瑕許艷宋茹
    食品工業(yè) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:蝦殼蝦肉青素

    賈喆,劉欣妍,張肖瑕,許艷,宋茹

    浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院(舟山 316022)

    蝦青素(astaxanthin)化學(xué)名稱為3,3’-二羥基-4,4’-二酮基-β,β’-胡蘿卜素,是一種天然酮式類胡蘿卜素。蝦青素不溶于水,但能溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑,其抗氧化性比β-胡蘿卜素及葉黃素強(qiáng)10倍,比天然維生素E強(qiáng)100倍[1-2]。研究還發(fā)現(xiàn)蝦青素有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗炎等作用,因此在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[3-4]。天然蝦青素在蝦、蟹、藻等海洋動植物體內(nèi)含量豐富,其中雨生紅球藻中蝦青素的含量可達(dá)到5.14%[5],海蝦殼中蝦青素的含量約為45.5 μg/g,相對含量約為1.29%[6]。

    中華管鞭蝦(Solenocera crassicornis)俗名紅蝦,是一年生底棲甲殼動物,外殼較薄并且光滑,呈粉紅色,廣泛分布于我國南海、黃海及印度尼西亞、日本、印度等海域[7]。中華管鞭蝦味甜鮮美、營養(yǎng)豐富,是我國重要的海捕蝦之一。水產(chǎn)加工中蝦下腳料利用率較低,目前基本的處理方法是加工成附加值不高的水產(chǎn)飼料。而蝦加工的副產(chǎn)物,如蝦殼和蝦頭,含有大量蝦青素,從中回收蝦青素并加以利用,不僅可以給企業(yè)提高經(jīng)濟(jì)效益,也提高了蝦下腳料的綜合利用率。研究以中華管鞭蝦為原料,采用水浴振蕩和超聲輔助提取2種方法提取蝦青素,分析比較中華管鞭蝦不同部位蝦青素的總量,研究提取次數(shù)對蝦青素提取效果影響,并分析不同部位游離型和酯型蝦青素相對含量,旨在為中華管鞭蝦的蝦青素綜合提取利用及生物活性研究奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 主要試驗(yàn)材料

    中華管鞭蝦,購于舟山市定海區(qū)華潤萬家超市;無水乙醇(分析純),購于上海國藥集團(tuán);色譜純二氯甲烷、甲醇、乙腈,購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%)。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    UV-5900型紫外可見分光光度計(jì),上海源喜儀器有限公司;SB-120DTN超聲清洗機(jī),寧波鑫志生物科技有限公司;SSW-600-2S型電熱恒溫水槽,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀,德國安捷倫科技有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 蝦青素的提取

    冷凍的中華管鞭蝦在室溫下自然解凍,手工分離蝦膏、蝦殼和蝦肉,將蝦膏并和,蝦殼、蝦肉各自打碎,然后分別按照1∶5(g/mL)比例在蝦膏、蝦殼和蝦肉中加入無水乙醇,分別采用水浴振蕩和超聲輔助提取法提取1 h(水浴溫度和超聲水浴溫度均為37 ℃),6 000g離心2 min,收集上清液,定容到10 mL刻度試管中,分別收集離心后沉淀,按照上述相同方法進(jìn)行2次和3次提取。

    1.3.2 不同部位蝦青素的特征波長分析

    取水浴振蕩和超聲輔助提取的蝦膏、蝦殼和蝦肉的蝦青素提取物(1提)各1 mL,0.22 μm濾膜過濾,在190~790 nm進(jìn)行紫外可見光譜掃描。

    1.3.3 總蝦青素含量的測定

    避光條件下用無水乙醇制備100 μg/mL的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)液,分別稀釋成1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,16.0和32.0 μg/mL蝦青素應(yīng)用液,過0.22 μm濾膜,以無水乙醇為調(diào)零管,測定477 nm吸光度,以蝦青素濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。

    測定蝦膏、蝦殼和蝦肉提取液在477 nm下吸光度,根據(jù)圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液的蝦青素濃度(μg/mL),根據(jù)公式(1)計(jì)算蝦青素含量。

    式中:c為提取液中蝦青素質(zhì)量濃度,μg/mL;V為提取液體積,mL;m為樣品質(zhì)量,g。

    圖1 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線

    1.3.4 游離型和酯型蝦青素分析

    參考Yuan等[8]方法,具體如下:采用C18色譜柱,柱溫25 ℃,流動相A為V(二氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=5∶85∶5.5∶4.5,流動相B為V(二氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=22∶28∶45.5∶4.5。進(jìn)樣量10 μL,0~10 min用100% 流動相A洗脫,10~20 min用0%~100%流動相B線性洗脫,20~35 min用100%流動相B洗脫,35~45 min用100%~0%流動相B線性洗脫,流速1.0 mL/min,檢測波長477 nm。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

    試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(n=3)表示,用Origin 2018軟件繪制圖形,SPSS 19.0軟件進(jìn)行組間顯著性差異分析(p<0.05)。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 中華管鞭蝦不同部位蝦青素提取液的紫外可見光譜比較

    蝦膏、蝦殼和蝦肉經(jīng)37 ℃水浴振蕩和37 ℃超聲輔助法提取后的紫外可見掃描圖譜如圖2所示。

    圖2 中華管鞭蝦不同部位蝦青素提取物的紫外可見掃描圖譜比較

    圖2結(jié)果顯示:中華管鞭蝦的蝦膏和蝦殼提取液在200~300 nm和450~550 nm 2個區(qū)域有吸收峰,而蝦肉提取液僅在200~300 nm有吸收峰。試驗(yàn)采用濕基物料提?。ㄎr膏、蝦殼和蝦肉的含水量達(dá)到70%以上),所以不可避免有大量水溶性蛋白質(zhì)、肽或氨基酸被提取出來,其中芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸在280 nm附近有吸收。因此,圖2中提取物在紫外區(qū)的吸收應(yīng)與芳香族氨基酸或富含該類氨基酸的肽和蛋白質(zhì)溶出有關(guān)。超聲處理有細(xì)胞破壁作用[9],蝦膏本身已為軟化狀態(tài),所以試驗(yàn)主要考察了蝦殼和蝦肉經(jīng)超聲輔助提取后蝦青素提取效果。圖2結(jié)果顯示水浴振蕩提取的蝦膏和蝦殼提取液在477 nm下有特征吸收,同理超聲輔助提取的蝦殼提取液也在477 nm有特征吸收,與許培雅等[10]報(bào)道的蝦青素最大吸收波長477 nm一致。

    2.2 提取次數(shù)對中華管鞭蝦不同部位蝦青素總量影響

    考察了水浴振蕩和超聲輔助提取次數(shù)對不同部位蝦青素的提取效果影響,結(jié)果見圖3。

    無論是水浴振蕩還是超聲輔助提取,中華管鞭蝦的蝦肉中均未檢出蝦青素,可能與提取液中蝦青素含量低于檢出限,或者本身含量就低的蝦青素發(fā)生降解有關(guān)。經(jīng)過水浴振蕩提取3次,蝦膏和蝦殼提取液中蝦青素質(zhì)量濃度分別降至0.76±0.07 μg/mL和1.18± 0.11 μg/mL,顯著低于提取2次時的蝦青素濃度(p< 0.05)。在水浴振蕩提取2次和3次時,蝦膏和蝦殼的蝦青素累積含量無顯著性差異(p>0.05),表明水浴振蕩提取3次后蝦膏和蝦殼中的蝦青素已經(jīng)基本提取完全。同樣,超聲輔助提取次數(shù)對提取液中蝦青素濃度有顯著影響(p<0.05),但是蝦青素累積含量在超聲輔助提取2次和提取3次時無顯著性差異(p>0.05),也說明超聲輔助提取3次后蝦殼中蝦青素也基本提取完全。

    圖3 水浴振蕩及超聲輔助提取次數(shù)對中華管鞭蝦不同部位蝦青素提取效果

    進(jìn)一步比較了水浴振蕩和超聲輔助提取法對蝦殼蝦青素提取率影響,結(jié)果見圖4。

    圖4 水浴振蕩和超聲輔助法提取蝦殼蝦青素提取率比較

    水浴振蕩和超聲輔助提取的蝦殼蝦青素的提取率(干基計(jì))在0.05%左右,雖然2種提取方法的蝦青素提取率在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異(p>0.05),但是也能看出超聲輔助法的蝦青素提取率低于水浴振蕩法。蝦青素屬于萜烯類化合物,含有多個共軛雙鍵,對光、溫度、氧等因素較為敏感[11]。張麗瑤等[12]曾報(bào)道蝦青素經(jīng)過超聲處理會發(fā)生大幅度降解,引起不同異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)化,且降解和轉(zhuǎn)化與超聲功率、處理時間呈正相關(guān)性。研究中超聲輔助提取的蝦青素是否發(fā)生異構(gòu)體轉(zhuǎn)化還有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。

    2.3 中華管鞭蝦不同部位游離型和酯型蝦青素的相對含量比較

    天然蝦青素主要以游離型和酯型2種形式存在,自然界中游離蝦青素含量較少,酯型蝦青素根據(jù)蝦青素分子中的羥基與脂肪酸反應(yīng)又可以分為蝦青素單酯和蝦青素雙酯。游離型和酯型蝦青素在477 nm附近均有特征吸收。但是,不同原料游離型和酯型蝦青素的相對含量和比例不同[13]。水浴振蕩法提取的中華管鞭蝦的蝦膏、蝦殼游離型和酯型蝦青素分析結(jié)果見圖5。

    蝦青素酯化后疏水性增強(qiáng),而雙酯又強(qiáng)于單酯,因此HPLC采用C18柱分析檢測蝦青素時,依次洗脫下來游離型蝦青素、蝦青素單酯、蝦青素雙酯[14]。圖5中蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品(游離型)在6.9 min處有特征吸收峰,根據(jù)洗脫時間定性可知中華管鞭蝦的蝦膏、蝦殼提取液均含有游離型蝦青素。蝦肉中的游離型蝦青素低于最低檢測限(結(jié)果未列出)。結(jié)合文獻(xiàn)[8]研究結(jié)果,推測圖5中洗脫時間10 min左右出現(xiàn)的分離峰(箭頭所示)應(yīng)該是游離蝦青素的順反式異構(gòu)體,而22~45 min的分離峰應(yīng)該是酯型蝦青素。

    通過對圖5蝦膏和蝦殼的蝦青素分離峰進(jìn)行積分,比較了游離型和酯型蝦青素在中華管鞭蝦的蝦膏和蝦殼中相對含量,其中游離型與酯型蝦青素在蝦膏中相對含量分別為27.70%±0.38%和72.30%± 0.35%,在蝦殼中相對含量分別為30.00%±0.75%和70.00%±0.75%,蝦膏和蝦殼游離型與酯型蝦青素比分別為2.8∶7.2和3∶7。由此可見,中華管鞭蝦的蝦青素以酯型蝦青素為主,且蝦膏中的相對含量稍高于蝦殼,但是蝦膏和蝦殼中酯型蝦青素具體組成是否有差別還有待于進(jìn)一步研究。

    圖5 中華管鞭蝦不同部位游離型和酯型蝦青素高效液相分離圖

    3 結(jié)論

    不同部位提取的中華管鞭蝦的蝦青素在477 nm有特征吸收,蝦青素主要集中在蝦膏和蝦殼中,水浴振蕩法提取的蝦青素總量略高于超聲輔助提取法。蝦膏、蝦殼中蝦青素均以游離型與酯型狀態(tài)存在,且以酯型為主,蝦膏和蝦殼的游離型、酯型蝦青素比值分別為2.8∶7.2和3∶7。

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