兩樣本孟德爾隨機(jī)化中工具變量對因果估計的性別特異性影響
——人體測量學(xué)性狀與乳腺癌關(guān)系的實證研究*

徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)系(221004) 高一欣 曾 平 趙華碩

【提 要】 目的 研究兩樣本孟德爾隨機(jī)化(mendelian randomization，MR)分析中性別特異工具變量對因果效應(yīng)估計的影響。方法 利用全基因組關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)以乳腺癌作為結(jié)局，以人體測量學(xué)性狀(身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)、腰圍(WC)和臀圍(HIP))作為暴露，采用兩樣本MR逆方差加權(quán)法估計因果效應(yīng)；通過差異檢驗比較使用女性特異工具變量與性別合并工具變量的因果效應(yīng)(OR值)；進(jìn)一步通過敏感性分析驗證結(jié)果的穩(wěn)健性。結(jié)果 使用性別合并工具變量的MR結(jié)果表明BMI/WC與乳腺癌風(fēng)險存在因果關(guān)聯(lián)(OR值分別為0.85(P=0.003)和0.87(P=0.020))；剔除性別差異的工具變量后，每組OR值與未剔除前基本一致，但WC與乳腺癌的因果關(guān)聯(lián)不再顯著(P=0.069)；使用女性特異工具變量的MR結(jié)果與使用性別合并工具變量結(jié)果相比，每組OR值均呈下降趨勢；其中BMI/HIP與乳腺癌的因果關(guān)聯(lián)效應(yīng)大小發(fā)生了明顯改變(P<0.05)；例如BMI與乳腺癌因果關(guān)聯(lián)的OR值由0.85下降至0.76。結(jié)論 工具變量的性別異質(zhì)會對MR的因果效應(yīng)估計產(chǎn)生實質(zhì)影響，使用性別合并的工具變量可能導(dǎo)致有偏的因果關(guān)聯(lián)。

眾所周知，觀察性研究中無論采用何種研究設(shè)計都難以避免眾多已知或未知的混雜因素，從而會對因果推斷的效應(yīng)估計產(chǎn)生偏倚[1-2]。孟德爾隨機(jī)化(mendelian randomization，MR)方法為解決這一問題提供了行之有效的途徑；MR利用遺傳變異作為工具變量估計暴露與結(jié)局之間的因果關(guān)聯(lián)[3]。為確保MR的有效性，工具變量需滿足三個核心假設(shè)[4]：(1)與暴露密切相關(guān)；(2)與任何影響暴露和結(jié)局的混雜因素不相關(guān)；(3)只能通過暴露影響結(jié)局，即不存在任何多效性效應(yīng)。過去十幾年來大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)已發(fā)現(xiàn)大量單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點與數(shù)百種復(fù)雜疾病或性狀(如血脂[5]、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)[6]、吸煙[7]和飲酒[8])存在關(guān)聯(lián)[9]，使得研究者能直接從GWAS中選擇合適的SNP作為某種暴露的遺傳工具變量[10-11]。

由于數(shù)據(jù)共享和隱私等限制，個體水平的GWAS數(shù)據(jù)不易獲取，實際中往往利用相同群體的兩個獨立GWAS匯總數(shù)據(jù)探索暴露與結(jié)局的因果關(guān)聯(lián)，即所謂兩樣本MR(two-sample mendelian randomization)[11-12]。另外，由于單個工具變量所能解釋的遺傳方差極其有限，為提高M(jìn)R的檢驗效能往往使用多個獨立的工具變量，然后采用類似meta分析的逆方差加權(quán)法(inverse-variance weighted，IVW)合并單個工具變量的因果效應(yīng)估計值從而獲得最終的效應(yīng)估計[13-14]?？傮w而言，兩樣本MR簡單且易于實施，為流行病學(xué)觀察性研究因果推斷提供了強(qiáng)有力的統(tǒng)計工具。

然而，實際中兩樣本MR分析依然面臨諸多應(yīng)用和方法上的挑戰(zhàn)。首先，兩樣本MR要求暴露與結(jié)局的GWAS樣本互不重疊，否則會產(chǎn)生有偏的因果效應(yīng)估計[15]。其次，暴露與結(jié)局的GWAS人群應(yīng)具有相似的種族特征，如均來自歐洲或亞洲人群[16]。除此之外，對某些特殊疾病(如女性乳腺癌，男性乳腺癌僅占約1%不在本文討論之列)，其暴露的工具變量會出現(xiàn)性別異質(zhì)性(sex heterogeneity)問題。理論上，當(dāng)采用兩樣本MR估計某些暴露因素(如BMI)與乳腺癌的因果關(guān)聯(lián)時，從暴露GWAS中獲取的工具變量效應(yīng)大小理應(yīng)是女性特有的。大量的GWAS曾報道很多人體測量學(xué)性狀的遺傳結(jié)構(gòu)存在性別差異(表1)；例如，研究者在多個與肥胖相關(guān)的基因座上發(fā)現(xiàn)了性別差異，其中大多數(shù)與腰臀比(waist-to-hip ratio，WHR)相關(guān)的SNP在女性中呈現(xiàn)出比男性更強(qiáng)的效應(yīng)[17-19]。然而，很多研究者在面對類似問題時往往簡單忽略工具變量性別異質(zhì)性，這很可能會產(chǎn)生錯誤的因果推斷結(jié)果[12，20]。另外，實際中GWAS協(xié)作組并沒有公開發(fā)布性別相關(guān)的匯總數(shù)據(jù)而僅有男女混合的匯總數(shù)據(jù)，因此研究者不得不采用男女混合的工具變量。需要注意的是，這一問題是基于匯總數(shù)據(jù)的兩樣本MR分析，由于數(shù)據(jù)的可獲得性而特有，在個體水平數(shù)據(jù)的因果推斷分析中不存在。在這種情況下，應(yīng)用者仍需對工具變量性別異質(zhì)性可能產(chǎn)生的因果估計偏倚做出說明并進(jìn)行敏感性分析。

表1 GWASs報道的具有顯著性別差異的基因和SNP

我們的文獻(xiàn)綜述顯示大多數(shù)兩樣本MR分析尚未系統(tǒng)研究過工具變量性別異質(zhì)性的問題。因此，本文以乳腺癌和四個人體測量學(xué)性狀(即身體質(zhì)量指數(shù)BMI、腰臀比WHR、腰圍WC和臀圍HIP)為例，說明工具變量性別異質(zhì)性在MR分析中可能產(chǎn)生的一系列問題，并提出相應(yīng)的分析策略和建議。

資料和方法

1.數(shù)據(jù)來源

鑒于人體測量學(xué)性狀具有性別差異的客觀證據(jù)[22-23]，本研究從人體性狀遺傳研究聯(lián)盟(GIANT)獲得了四個人體測量學(xué)性狀(即BMI、WHR、WC和HIP，后三種性狀均對BMI加以校正)的性別合并和性別特異的GWAS匯總數(shù)據(jù)[19，21]。從國際乳腺癌研究聯(lián)盟(BCAC)獲得了女性乳腺癌的GWAS匯總數(shù)據(jù)[24]。所有個體均為歐洲血統(tǒng)(表2)。

表2 MR分析中使用的GWASs數(shù)據(jù)信息

2.工具變量的選擇

首先，從GWAS中直接篩選達(dá)到全基因組顯著性水平(即P<5×10-8)的SNP作為每個人體測量學(xué)性狀的工具變量(表3)。隨后，根據(jù)男性和女性的效應(yīng)估計以及標(biāo)準(zhǔn)誤進(jìn)行性別異質(zhì)性檢驗，使用Cochran Q統(tǒng)計量以及Bonferroni校正P值(即0.05/給定人體測量學(xué)性狀的工具變量數(shù))評估每個工具變量的性別異質(zhì)性。

為提供更全面的結(jié)果，根據(jù)以往研究[25]，運用PLINK(版本v1.90b3.38)[26]的clumping程序生成另一組女性特異的工具變量(表3)。SNP的主要顯著性水平和次要顯著性水平均設(shè)置為5×10-8，連鎖不平衡和物理距離分別設(shè)置為0.01和1Mb，以千人基因組項目中的503個歐洲個體基因型作為參考面板[27]。

表3 達(dá)到全基因組顯著性水平的工具變量數(shù)

3.因果效應(yīng)估計

首先，利用性別合并的工具變量，采用兩樣本MR[28]中的IVW法[13，29]估計人體測量學(xué)性狀與乳腺癌的因果關(guān)聯(lián)。為檢驗性別異質(zhì)性的工具變量對因果效應(yīng)估計的潛在影響，通過剔除具有性別異質(zhì)性的工具變量進(jìn)行敏感性分析。其次，利用女性特異的工具變量再次實施兩樣本MR。采用差異檢驗比較使用女性特異工具變量與性別合并工具變量的因果效應(yīng)

其中，d和SEd分別代表效應(yīng)估計之差和標(biāo)準(zhǔn)誤之差；ρ代表相關(guān)系數(shù)，我們的研究顯示ρ基本在0.8以上，因此本文中設(shè)置ρ=0.8。

最后，若使用女性特異的工具變量確定了某種人體測量學(xué)性狀與乳腺癌存在因果關(guān)聯(lián)，則對其進(jìn)一步實施加權(quán)中值法[30]，極大似然估計[31]，留一法(leave-one-out，LOO)[32]，MR-PRESSO測試[33]和MR-Egger回歸[34-35]等一系列敏感性分析驗證MR結(jié)果的穩(wěn)健性。

結(jié) 果

1.因果效應(yīng)估計結(jié)果

(1)使用性別合并的工具變量

基于隨機(jī)效應(yīng)的IVW結(jié)果顯示，BMI和WC每增加1個標(biāo)準(zhǔn)差，乳腺癌的OR值分別為0.85(95%CI：0.76～0.95，P=0.003)和0.87(95%CI：0.77～0.98，P=0.020)(表4)。同時，性別異質(zhì)性檢驗發(fā)現(xiàn)了2個與BMI相關(guān)的SNP、17個與WHR相關(guān)的SNP、10個與WC相關(guān)的SNP以及4個與HIP相關(guān)的SNP。將這些SNP剔除后，與原始結(jié)果相比，OR與未剔除前基本一致(表4)，但WC與乳腺癌風(fēng)險的因果關(guān)聯(lián)不再顯著(P=0.069)，表明具有性別異質(zhì)性的工具變量的確會對因果效應(yīng)估計產(chǎn)生影響。

表4 人體測量學(xué)性狀與乳腺癌風(fēng)險的因果關(guān)系(使用性別合并的工具變量)

(2)使用女性特異的工具變量

從結(jié)果可見，與原始結(jié)果相比，使用GIANT報告的女性特異工具變量后WC與乳腺癌風(fēng)險的因果關(guān)聯(lián)不再顯著(P=0.057)(表5)；同時，每種人體測量學(xué)性狀與乳腺癌因果關(guān)聯(lián)的效應(yīng)大小均呈下降趨勢，其中BMI/HIP與乳腺癌的因果關(guān)聯(lián)效應(yīng)大小發(fā)生了明顯改變(P<0.05)(表5)。例如，BMI每增加1個標(biāo)準(zhǔn)差，使用性別合并工具變量的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險降低約15.5%(OR=0.85)(表4)，而使用女性特異工具變量的乳腺癌發(fā)病風(fēng)險降低約21.8%(OR=0.78)或23.7%(OR=0.76)(表5)；表明使用性別合并的工具變量可能會導(dǎo)致有偏的因果關(guān)聯(lián)。

表5 人體測量學(xué)性狀與乳腺癌風(fēng)險的因果關(guān)系(使用女性特異的工具變量)

2.敏感性分析

由于表5顯示BMI/WC與乳腺癌的因果關(guān)聯(lián)顯著，故對其進(jìn)一步進(jìn)行敏感性分析(圖1)。加權(quán)中值法和極大似然估計與IVW法的結(jié)果近似。通過構(gòu)建散點圖(圖2A1～C1)，我們發(fā)現(xiàn)可能存在潛在的異常值工具變量。為檢驗這些異常值是否對因果效應(yīng)估計產(chǎn)生影響，以由clumping生成的兩個BMI異常值為例(即rs2229616和rs17024393)，依次將其剔除后的效應(yīng)(OR=0.79，95%CI：0.69～0.91，P=1.30E-03)和(OR=0.79，95%CI：0.69～0.91，P=1.20E-03)與同時將其剔除后的效應(yīng)(OR=0.80，95%CI：0.70～0.93，P=2.48E-03)基本一致，且近似于未剔除前的效應(yīng)大小(OR=0.78)。此外，LOO和MR-PRESSO表明，并不存在對因果效應(yīng)估計產(chǎn)生實質(zhì)性影響的工具變量。最后，由于MR-Egger回歸的截距沒有明顯偏離于0，且漏斗圖的因果效應(yīng)點估計呈對稱模式(圖2A2～C2)，進(jìn)一步表明遺傳多效性不會對因果效應(yīng)估計產(chǎn)生偏倚。

圖1 敏感性分析

圖1中MR-Egger為移除潛在異常值后的結(jié)果，Egger截距自上而下分別為0.009(95%CI：-0.006～0.025，P=0.239)、0.006(95%CI：-0.009～0.022，P=0.418)和0.033(95%CI：-0.002～0.068，P=0.066)。

圖2散點圖 A1～C1中的藍(lán)線及漏斗圖A2～C2中的垂直紅線均表示IVW估計的因果效應(yīng)，散點圖中的紅點代表潛在異常值。(A)使用40個由clumping生成的與BMI相關(guān)的女性特異SNPs，異常值由左向右依次是位于GNAT2上的rs17024393和MC4R上的rs2229616；(B)使用36個來自GIANT的與BMI相關(guān)的女性特異SNPs，異常值是位于GNAT2上的rs17024393；(C)使用26個由clumping生成的與WC相關(guān)的女性特異SNPs，異常值由左向右依次是位于VEGFA上的rs998584和CYCSP55上的rs1776897。

圖2 散點圖及漏斗圖

討 論

乳腺癌是全球絕大多數(shù)國家女性最常見的癌癥，其發(fā)病率與死亡率均位于女性癌癥患者首位[36]。迄今為止，乳腺癌的MR實例分析已多達(dá)61篇，MR的廣泛應(yīng)用為識別乳腺癌的復(fù)雜病因提供了極佳途徑。然而，我們發(fā)現(xiàn)僅個別原始報告[37-40]中使用的工具變量效應(yīng)大小是女性特有的(女性特異暴露如乳房大小、初潮年齡等的MR研究除外)；尤其對于某些已被證實性別差異顯著的性狀如WHR等，在性別相關(guān)的匯總數(shù)據(jù)公開發(fā)布的情況下，絕大部分研究者依然簡單地使用性別合并的SNP效應(yīng)[41-42]且并未在文章中澄清這一點。兩樣本MR分析中使用性別合并指示變量事實上潛在假設(shè)性別之間不存在效應(yīng)差異，而在實際中這一假設(shè)并不一定成立(例如表1的結(jié)果)。使用性別合并指示變量也潛在增加了暴露所在的GWAS樣本量。在本文中，也即是假設(shè)男性樣本可用于女性樣本從而用于BMI等的關(guān)聯(lián)檢驗，這將導(dǎo)致有更多的指示變量被選擇和用于MR分析，在提高檢驗效能的同時也增加了指示變量間異質(zhì)性的風(fēng)險。

本研究借助人體測量學(xué)性狀以及女性乳腺癌的大規(guī)模GWAS匯總數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)使用性別特異和性別合并的工具變量得到的MR結(jié)果存在實質(zhì)的差別，且在因果效應(yīng)估計方面存在偏差。在我們的實例研究中使用性別合并的工具變量會削弱暴露與結(jié)局的因果關(guān)聯(lián)。據(jù)我們所知，本研究是首次利用實例數(shù)據(jù)探討兩樣本MR分析中性別特異工具變量對因果效應(yīng)估計的影響。

兩樣本MR的嚴(yán)格方法論認(rèn)為，若兩樣本來自不同的人群，因果效應(yīng)估計可能存在偏倚[1]。 MR仍可證明現(xiàn)有暴露與結(jié)局間是否存在因果關(guān)聯(lián)，但因果關(guān)聯(lián)的效應(yīng)大小不能準(zhǔn)確估計[43]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，使用女性特異的工具變量，與使用性別合并的工具變量相比因果效應(yīng)估計的大小呈下降趨勢。當(dāng)工具變量從男女混合的樣本中提取，由于男性乳腺癌的稀缺性，加入了男性的效應(yīng)即意味著減弱了原本存在的因果效應(yīng)。本研究還注意到，單從數(shù)值看因果效應(yīng)估計的下降幅度不大，我們認(rèn)為這是合理的：若因果效應(yīng)降幅明顯，則意味著以人體測量學(xué)性狀為典型的各類表型在男性和女性之間本就存在顯著差異，而同一人群中不同性別的表型差異十分顯著的現(xiàn)象并不多見[44-45]。因此，該結(jié)果證明，多數(shù)研究者未考慮工具變量的性別異質(zhì)性，會導(dǎo)致MR的效應(yīng)估計產(chǎn)生偏倚。

我們建議在類似的MR分析中應(yīng)該首先查看原始論文以及出版物或聯(lián)系原作者，明確是否可能在相同性別的人群中實施MR，同時分析時明確說明[39]。其次，當(dāng)使用性別合并的工具變量時需進(jìn)行性別異質(zhì)性檢驗，移除顯著性別差異的工具變量以實施敏感性分析；當(dāng)使用性別特異的工具變量時需同步進(jìn)行敏感性分析以確保結(jié)果的穩(wěn)健性。最后，若無法獲得指定的工具變量或無法完成上述敏感性分析，可借鑒Au Yeung[40]和Jiang[46]等人的文章，報告或討論可能存在的偏倚，同時進(jìn)一步考慮實施MR分析是否可靠。

總之，盡管使用公開匯總數(shù)據(jù)的MR在技術(shù)上是易于實現(xiàn)的，但仍應(yīng)遵循MR的基本理論與原則。尤其在評估暴露因素與性別特異疾病的因果關(guān)聯(lián)時，選擇合適的性別特異工具變量可以在一定程度上減少因果推斷的偏倚，使MR結(jié)果更加可信。