采用重疊PCR構(gòu)建高靈敏度酵母細胞傳感器評估遺傳毒性化合物

何 穎，夏星雅，魏嘉利，鄭 楓*

（1中國藥科大學(xué)藥物分析學(xué)教研室;2教育部藥品安全與預(yù)警重點實驗室，南京210009）

遺傳毒性化合物由于其潛在的致突變性與致癌作用，引起了制藥行業(yè)和監(jiān)管機構(gòu)的高度關(guān)注［1-2］。遺傳毒性由化合物與DNA或其他控制細胞凋亡的靶標相互作用引起，包括了DNA加合物的誘導(dǎo)、鏈斷裂、點突變以及染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)值變化［3-5］。通常使用體內(nèi)嚙齒動物致癌性試驗準確評估化合物的致癌性，對于沒有致癌性數(shù)據(jù)或支持性致癌數(shù)據(jù)的化合物，則采用基因毒性試驗來預(yù)測致癌潛力［6-8］。自20世紀70年代以來，已經(jīng)開發(fā)了幾種基于細菌的生物測定法來評估化合物潛在的遺傳毒性以作為動物試驗的替代［9］。Ames試驗是致突變性短期檢測最常用的方法之一，其原理基于監(jiān)測鼠沙門氏菌突變株中誘變劑引起的逆突變［8］。Ames試驗具有易操作、成本低的優(yōu)點，但由于細菌檢測在藥物代謝、膜轉(zhuǎn)運和DNA修復(fù)系統(tǒng)方面與真核生物存在差異，試驗會產(chǎn)生大量假陽性與假陰性結(jié)果［10］。目前已經(jīng)開發(fā)幾種基于哺乳動物細胞的微核試驗和彗星實驗來代替動物測試，但均存在評估成本過高和評估時間過長的不足［11］。因此，亟需發(fā)展一種成本更低、速度更快、信息可靠的遺傳毒性評估方法。

芽殖酵母釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一種代表性的單細胞真核生物，在遺傳毒性測試應(yīng)用方面具有多種優(yōu)勢。酵母細胞生長迅速、易于培養(yǎng)、遺傳背景簡單，使其成為優(yōu)良的生物傳感工具［12］。同時，作為真核生物，酵母與人類在許多代謝通路和蛋白表達調(diào)節(jié)等方面高度保守［13］。當(dāng)遺傳毒性化合物引起酵母細胞DNA損傷時，細胞通過DNA損傷檢查點通路激活一系列蛋白激酶來進行修復(fù)，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平被上調(diào)，因此可以通過測量轉(zhuǎn)錄水平來評估DNA的損傷水平［14-15］。核糖核苷酸還原酶（ribonucleotide reduc?tase，RNR）是催化核糖核酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗鹾颂呛塑账徇^程的限速酶，在DNA的復(fù)制與修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用［16］。酵母細胞中存在4種亞單位的RNR（RNR1、RNR2、RNR3、RNR4），其中RNR2在正常狀態(tài)下表達水平很低，當(dāng)受到DNA損傷誘導(dǎo)后，蛋白表達增加十幾倍［17］。因此，將RNR2啟動子（pRNR2）作為感應(yīng)元件與報告元件酵母增強綠色熒光蛋白（yeast enhanced green fluorescent pro?tein，yEGFP）基因相融合，構(gòu)建pRNR2調(diào)控的酵母重組載體（pRNR2-yEGFP），并將重組載體轉(zhuǎn)入酵母細胞中構(gòu)建細胞傳感器。當(dāng)遺傳毒性化合物作用于該重組酵母細胞傳感器時，能夠誘導(dǎo)pRNR2-yEGFP元件中的熒光報告基因的表達，通過測量熒光強度實現(xiàn)對化合物遺傳毒性的定量評估。

通過采用細胞壁合成與藥物轉(zhuǎn)運突變體改善酵母細胞滲透性，已經(jīng)實現(xiàn)酵母細胞傳感器的檢測靈敏度與特異性的提高，敲除細胞壁合成基因erg6、cwp1和cwp2與膜轉(zhuǎn)運蛋白基因pdr5、snq2和yor1是提高酵母細胞傳感器檢測遺傳毒性靈敏度的有效方法［18-19］。酵母細胞具有較高的同源重組頻率和較短的同源片段長度需求，因此采用40 bp的同源臂的一步PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化能夠進行目標基因的敲除［20］。為了提高酵母細胞基因敲除的效率，需要設(shè)計更長的同源臂，而一步PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化法難以滿足，通常需要采取酶切、連接的方法構(gòu)建基因敲除組件［19］。本研究采用重疊PCR（overlap PCR）構(gòu)建pdr5與snq2基因敲除組件，設(shè)計的同源臂長度為600～700 bp，相較于傳統(tǒng)方法具有成本更低、操作簡便的優(yōu)點。構(gòu)建了pRNR2調(diào)控的基因突變型酵母細胞傳感器對遺傳毒性化合物進行定量評估，并比較了不同基因突變對酵母細胞傳感器檢測準確度與靈敏度的影響。

1材料

1.1 質(zhì)粒與菌株

酵母重組質(zhì)粒pRNR2-yEGFP由揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系李湘鳴教授贈送；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞（上海生工生物工程有限公司）；釀酒酵母BY4741、pESC-Leu質(zhì)粒、pESC-His質(zhì)粒（上?？吕咨锟萍加邢薰荆?。

1.2試劑

SD/-Ura、SD/-Leu、SD/-His、SD/-His-Leu、SD/-Ura-Leu、SD/-Ura-His、SD/-Ura-His-Leu培養(yǎng)基（上海艾禮生物科技有限公司）；PrimeSTAR Max DNA聚合酶（日本TaKaRa生物股份有限公司）；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、無毒核酸染料、TE緩沖液、TAE緩沖液（上海生工生物工程有限公司）；質(zhì)粒DNA小提試劑盒、膠回收/DNA純化試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；DNA上樣緩沖液（南京翼飛雪生物科技有限公司）；甲磺酸甲酯（methyl meth?anesulfonate，MMS，98%，批號：EJ120007）、甲磺酸乙 酯（ethyl methanesulfonate，EMS，98%，批 號：DK190025）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；順鉑（65%）、4-硝基喹啉-N-氧化物（4-nitroquino?line-N-oxide，4NOQ，98%）、5-氟尿嘧啶（5-fluoroura?cil，5-FU，99%）、羥基脲（99%）、水楊酸（99.5%）、葡萄糖（99%）（上海麥克林生化科技有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.3儀器

專業(yè)型梯度PCR儀（德國耶拿公司）；Spectra?Max M2e多功能酶標儀（美國分子儀器公司）；ECLIPSE Ti2-U型倒置熒光顯微鏡（日本尼康公司）；3500全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

2方 法

2.1 pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件的構(gòu)建

按常規(guī)玻璃珠法從釀酒酵母BY4741中提取基因組DNA后，采用overlap PCR構(gòu)建基因敲除組件，原理如圖1，研究中使用的引物見表1。首先PCR擴增pdr5上游同源臂片段，設(shè)計引物q-1/q-2，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒回收，命名為pdr5-1。同法擴增pdr5下游同源臂片段，設(shè)計引物q-3/q-4，得到純化產(chǎn)物pdr5-2。以pESC-Leu質(zhì)粒為模板，擴增LEU2基因片段，設(shè)計引物q-5/q-6，得到純化產(chǎn)物L(fēng)EU2。

采用overlap PCR方法構(gòu)建pdr5Δ∷LEU2基因敲除組件。分別設(shè)計引物q-1/q-6與q-4/q-5，采用overlap PCR連接pdr5-1與LEU2片段以及pdr5-2與LEU2片段，分別得到純化產(chǎn)物pdr5-1-LEU2與pdr5-2-LEU2。設(shè)計引物q-7/q-8，采用overlap PCR連接pdr5-1-LEU2與pdr5-2-LEU2片段，得到純化產(chǎn)物pdr5Δ∷LEU2。

采用類似方法構(gòu)建snq2Δ∷HIS3基因敲除組件。首先設(shè)計引物q-9/q-10、q-11/q-12與q-13/q-14，分別擴增得到snq2上下游同源臂snq2-1、snq2-2以及HIS3片段；設(shè)計引物q-9/q-14與q-12/q-13采用overlap PCR擴增分別得到snq2-1-HIS3與snq2-2-HIS3片段；設(shè)計引物q-15/q-16，采用overlap PCR連接snq2-1-HIS3與snq2-2-HIS3片段，純化后得到snq2Δ∷HIS3。

Table1 PCRprimersused in thestudy

2.2 基因突變酵母細胞的構(gòu)建

采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件分別轉(zhuǎn)入野生型酵母細胞BY4741，經(jīng)SD/-Leu與SD/-His平板篩選得到pdr5單基因突變與snq2單基因突變酵母細胞；再將snq2Δ∷HIS3基因敲除組件轉(zhuǎn)入snq2單基因突變酵母細胞，經(jīng)SD/-His-Leu平板篩選得到pdr5、snq2雙基因突變酵母細胞。采用玻璃珠法提取pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細胞的基因組DNA，分別設(shè)計引物q-7/q-8、q-15/q-16與q-7/q-8和q-15/q-16擴增突變片段后進行測序驗證。

2.3 pRNR2調(diào)控的重組酵母細胞傳感器的建立

采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將pRNR2-yEGFP轉(zhuǎn)化于感受態(tài)酵母細胞BY4741，經(jīng)SD/-Ura、SD/-Ura-Leu、SD/-Ura-His、SD/-Ura-His-Leu平板篩選得到pRNR2調(diào)控的野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細胞傳感器。提取酵母細胞傳感器質(zhì)粒DNA，設(shè)計引物q-17/q-18擴增質(zhì)粒片段進行驗證。

2.4 最大非細胞毒性濃度的確定

使用2%DMSO水溶液作為溶劑配制遺傳毒性化合物與陰性對照儲備液，并逐級稀釋至以下質(zhì)量濃度：MMS（10，30，60，80，100，180，250，300，400μg/mL）；EMS（50，100，200，400，800，1 000，1 300，1 500，2 000μg/mL）；順鉑（10，20，30，40，60，90，120，150，200μg/mL）；4NOQ（0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5μg/mL）；5-FU（0.01，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2μg/mL）；羥基脲（100，200，400，500，800，1 200，1 500，2 000，2 500μg/mL）；水楊酸（0.1，0.5，1，2，5，10，15，30，50μg/mL）；葡萄糖（5，10，20，40，60，80，100，150，200μg/mL）。過夜培養(yǎng)4種酵母細胞單克隆，用新鮮的酵母培養(yǎng)液稀釋至A600為0.1。以底部透明的黑色微孔板為反應(yīng)載體，每孔中加入稀釋后酵母培養(yǎng)液190μL與測試化合物溶液或溶劑對照10μL，每種質(zhì)量濃度設(shè)置3個平行對照。微孔板置于30℃，220 r/min環(huán)境下培養(yǎng)24 h后，使用酶標儀測量A600。最終測定時每孔中DMSO的濃度低于0.1%，對酵母細胞生長沒有明顯影響。

2.5 最佳暴露時間的確定

過夜培養(yǎng)4種酵母細胞單克隆，用新鮮的酵母培養(yǎng)液稀釋至A600為0.1。以底部透明的黑色微孔板為反應(yīng)載體，每孔中加入稀釋后酵母培養(yǎng)液190μL與MMS溶液10μL，質(zhì)量濃度為10，30，60，80，100，150，180，200，250μg/mL，每種濃度設(shè)置3個平行對照。微孔板置于30℃，220 r/min環(huán)境下培養(yǎng)，使用酶標儀每間隔4小時測量A600與EGFP強度（激發(fā)光波長485 nm，發(fā)射光波長535 nm），持續(xù)時間20 h。

2.6 DNA損傷試劑暴露實驗

根據(jù)實驗“2.4”與“2.5”項下確定測試化合物溶液的最大非細胞毒性濃度與細胞傳感器的最佳暴露時間，選用適宜濃度測試化合物溶液孵育4種酵母細胞傳感器適當(dāng)時間：MMS（10，30，60，100，150，200，250μg/mL）；EMS（50，100，300，600，1 000，1 300，1 500μg/mL）；順鉑（10，20，30，60，90，120，150μg/mL）；4NOQ（0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，0.7，1μg/mL）；5-FU（0.01，0.05，0.1，0.15，0.2，0.3，0.4μg/mL）；羥基脲（100，200，400，800，1 000，1 200，1 500μg/mL）；水楊酸（1，2，5，10，15，20，30μg/mL）；葡萄糖（10，20，40，80，100，150，200μg/mL）。每種質(zhì)量濃度設(shè)置3個平行對照，其余操作同“2.5”項。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

在“2.4”項下中，采用Microsoft Excel 2013軟件計算測試化合物各濃度下4種酵母細胞傳感器A600均值，取3次獨立實驗的平均值和標準差。定義Ax/A0為暴露組A600與溶劑對照組A600的比值，設(shè)定Ax/A0小于90%為遺傳毒性數(shù)據(jù)的排斥閾值。

在“2.5”與“2.6”項中，通過扣除空白培養(yǎng)基校正EGFP與A600，采用Microsoft Excel 2013軟件計算4種酵母細胞傳感器的EGFP與A600的均值（n=3）。定義單位細胞的平均相對熒光強度AF（aver?age fluorescence）=EGFP/A600，取3次獨立實驗的平均值及標準差。定義熒光誘導(dǎo)倍數(shù)FI（fold induc?tion）為暴露組與溶劑對照組的單位細胞的平均相對熒光強度之比，則FI=AFtreated/AFuntreated。設(shè)定遺傳毒性閾值為1.5倍，即當(dāng)AF增加50%，且熒光強度隨劑量的增加表現(xiàn)出增長趨勢時，判斷化合物為遺傳毒性陽性，反之為陰性。采用Graphpad Prism 7.00軟件進行制圖分析。

3結(jié) 果

3.1 pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件的構(gòu)建

采用overlap PCR方法構(gòu)建pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件，PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2與圖3。結(jié)果顯示，pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件的堿基大小與預(yù)期一致，表明pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件構(gòu)建成功。

3.2 pRNR2調(diào)控的野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細胞傳感器的構(gòu)建

pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3基因敲除組件轉(zhuǎn)入酵母細胞后，經(jīng)平板篩選得到的單克隆DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖4與圖5。結(jié)果顯示，擴增出的酵母細胞基因突變片段的堿基大小與預(yù)期一致。對PCR擴增產(chǎn)物進行測序并與GenBank序列比對，pdr5基因片段相似度為99.88%（3 289/3 293），間隙為0.12%（4/3 293）；snq2基因片段相似度為99.96%（2 542/2 543），間隙為0.04%（1/2 543），表明pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細胞構(gòu)建成功。

Figure 2 Gene knockout of pdr5Δ∷LEU2M:DNA markers;Lane 1-2:pdr5-1-LEU2(2 789 bp);Lane 3-4:pdr5-2-LEU2(2 817 bp);Lane5-9:pdr5Δ∷LEU2 geneknockout(3 304 bp)

Figure 3 Gene knockout of snq2Δ∷HIS3M:DNA markers;Lane 1-2:snq2-1-HIS3(1899 bp);Lane 3-4:snq2-2-HIS3(1 948 bp);Lane5-7:snq2Δ∷HIS3 gene knockout(2540 bp)

Figure 4 Mutant gene fragment of pdr5M:DNA markers;Lane 1-4:Single-gene mutation of pdr5(3 293 bp);Lane5-8:Double-genemutation of pdr5 and snq2(3 293 bp)

Figure 5 Mutant gene fragment of snq2M:DNA markers;Lane 1-4:Single-gene mutation of snq2(2 543 bp);Lane5-8:Double-genemutation of pdr5 and snq2(2 543 bp)

pRNR2-yEGFP重組載體轉(zhuǎn)入野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變4種酵母細胞，質(zhì)粒DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，擴增出的質(zhì)粒DNA片段的堿基大小與預(yù)期一致，表明重組載體pRNR2-yEGFP已轉(zhuǎn)入4種酵母細胞，pRNR2調(diào)控的野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細胞傳感器構(gòu)建成功。

Figure6 Fragment of recombinant plasmid pRNR2-yEGFPM:DNA markers;Lane 1:Wild-type yeast cell sensor(1 493 bp);Lane 2:Yeast cell sensor of single-gene mutation of pdr5(1 493 bp);Lane 3:Yeast cell sensor of single-gene mutation of snq2(1 493 bp);Lane 4:Yeast cell sensor of double-gene mutation of pdr5 and snq2(1 493 bp)

3.3 化合物對酵母細胞傳感器的最大細胞毒性濃度的確定

應(yīng)用野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細胞傳感器對8種測試化合物進行24 h生長抑制測試，4種細胞傳感器的Ax/A0結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，MMS、EMS、順鉑、4NOQ、5-FU、羥基脲與陰性對照水楊酸在高濃度下表現(xiàn)出抑制細胞生長的細胞毒性，陰性對照葡萄糖未表現(xiàn)出明顯細胞毒性。

3.4 MMS對酵母細胞傳感器最佳暴露時間的確定

經(jīng)“2.4”項確定MMS最大非細胞毒性濃度后，采用MMS進行最佳暴露時間測試，野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變4種細胞傳感器結(jié)果見圖8。當(dāng)pRNR2調(diào)控的細胞傳感器與MMS作用時，F(xiàn)I值隨時間增加而逐漸增大，并于16 h時達到最大值，繼續(xù)暴露至20 h時下降，因此選擇16 h作為酵母細胞傳感器的暴露時間。

Figure 7 Cytotoxicity in yeast cells for tested compounds in 24 h(xˉ±s,n=3)A:MMS(methyl methanesulfonate);B:EMS(ethyl methanesulfonate);C:Cisplatin;D:4NOQ(4-nitroquinoline-N-oxide);E:5-FU(5-fluoroura?cil);F:Hydroxyurea;G:Salicylic acid;H:Glucose

Figure 8 Yeast cell sensors exposed to different concentrations of MMSsolution for 0,4,8,12,16,20 h(xˉ±s,n=3)

當(dāng)MMS質(zhì)量濃度最低為50μg/mL時，16 h暴露組細胞傳感器FI值超過1.5。pRNR2調(diào)控的野生型細胞傳感器暴露于MMS溶液下16 h的倒置熒光顯微鏡圖見圖9。與溶劑對照組（圖9-C）相比，50μg/mL MMS溶液組（圖9-D）的細胞傳感器表達出更亮的熒光。結(jié)果進一步表明16 h為細胞傳感器適宜的暴露時間。

3.5 酵母生物傳感器暴露于測試化合物的熒光蛋白表達的量效關(guān)系

野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變4種酵母細胞傳感器暴露于系列濃度測試化合物16 h后，熒光蛋白表達的劑效關(guān)系見圖10。將本次研究中酵母細胞傳感器測試結(jié)果與已有報道的Ames試驗、體外遺傳毒性試驗與體內(nèi)遺傳毒性試驗的數(shù)據(jù)進行對比，結(jié)果如表2所示。對于體內(nèi)外遺傳毒性數(shù)據(jù)呈陰性的兩種測試化合物水楊酸與葡萄糖，4種酵母細胞傳感器檢測結(jié)果均表現(xiàn)為遺傳毒性陰性；對于已有體內(nèi)外遺傳毒性數(shù)據(jù)的6種測試化合物，snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變細胞傳感器均檢測出陽性結(jié)果，測試準確度100%，野生型與pdr5單基因突變細胞傳感器能檢測出4NOQ以外的其余五種測試化合物，測試準確度87.5%。結(jié)果表明，pRNR2調(diào)控的細胞傳感器能夠用于遺傳毒性化合物檢測，且snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變細胞傳感器表現(xiàn)出更高的準確度與特異性。

Figure 9 Wild-type cell sensor regulated by pRNR2 exposed to MMS solution for 16 hA:Bright-field image at 0μg/mL;B:Bright-field image at 50μg/mL;C:Inverted fluorescence microscope image at 0μg/mL;D:Inverted fluo?rescence microscope image at 50μg/mL

Figure10 Yeast cell sensorsexposured totested compoundsfor 16 h(xˉ±s,n=3)A:MMS(methyl methanesulfonate);B:EMS(ethyl methanesulfonate);C:Cisplatin;D:4NOQ(4-nitroquinoline-N-oxide);E:5-FU(5-fluorouracil);F:Hydroxyurea;G:Salicylic acid;H:Glucose

對于測試的6種遺傳毒性陽性模型化合物，pdr5、snq2雙基因突變細胞傳感器表現(xiàn)出明顯高于其他3種細胞傳感器的FI。在檢測靈敏度方面，雙基因突變細胞傳感器同樣表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。在測試6種遺傳毒性數(shù)據(jù)陽性化合物時，相較于其他3種細胞傳感器，雙基因突變細胞傳感器達到遺傳毒性閾值所需濃度降低了數(shù)倍。snq2單基因突變細胞傳感器相較于pdr5單基因突變細胞傳感器，在檢測4NOQ中表現(xiàn)出更高的準確度；而在檢測5-FU方面，pdr5單基因突變細胞傳感器表現(xiàn)出更高的熒光響應(yīng)。野生型細胞傳感器在檢測靈敏度與熒光響應(yīng)強度方面并無突出表現(xiàn)。結(jié)果表明盡管snq2與pdr5高度同源，具有共同的反應(yīng)底物，但對于特異性底物表現(xiàn)出不同的響應(yīng)強度，snq2單基因突變細胞傳感器的檢測準確度優(yōu)于pdr5單基因突變細胞傳感器，雙基因突變細胞傳感器在測試中表現(xiàn)出最佳的準確度和靈敏度。

Table2 Genotoxicity of compoundstested by yeast cell sensorsand comparison with other tests

4討論

基于DNA損傷誘導(dǎo)型啟動子的酵母細胞傳感器進行遺傳毒性測定具有成本低、樣品用量少、檢測迅速、準確度高的優(yōu)點，已被廣泛用于環(huán)境樣品與藥物化合物的遺傳毒性評估。通過敲除膜轉(zhuǎn)運蛋白基因或細胞壁合成基因增加酵母細胞滲透性已成為改善細胞傳感器檢測靈敏度的有效方法。本研究采用overlap PCR方法分別構(gòu)建pdr5與snq2基因敲除組件pdr5Δ∷LEU2與snq2Δ∷HIS3，設(shè)計的上下游同源臂長度為600～700 bp。將基因敲除組件與pRNR2-yEGFP重組質(zhì)粒通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母細胞得到野生型、pdr5單基因突變、snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變酵母細胞傳感器，PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果與基因測序結(jié)果驗證了基因突變細胞傳感器構(gòu)建的成功。采用24 h酵母生長抑制試驗測得各化合物最大非細胞毒性濃度，測試的6種遺傳毒性數(shù)據(jù)陽性化合物MMS、EMS、順鉑、4NOQ、5-FU、羥基脲與陰性化合物水楊酸都在一定濃度下表現(xiàn)出細胞毒性，遺傳毒性數(shù)據(jù)陰性化合物葡萄糖在測試濃度范圍內(nèi)未表現(xiàn)出細胞毒性。4種酵母細胞傳感器暴露于系列濃度化合物16 h后，結(jié)果表明snq2單基因突變與pdr5、snq2雙基因突變細胞傳感器檢測準確度為100%，高于野生型與pdr5單基因突變細胞傳感器（87.5%）。同一濃度下，雙基因突變細胞傳感器的熒光響應(yīng)顯著高于其他3種細胞傳感器，pdr5單基因突變細胞傳感器在5-FU檢測中表現(xiàn)出顯著高于野生型和snq2單基因突變細胞傳感器的熒光響應(yīng)。結(jié)果表明盡管snq2與pdr5高度同源，蛋白功能具有代償性，本研究發(fā)現(xiàn)snq2單基因突變細胞傳感器的檢測準確度優(yōu)于pdr5單基因突變細胞傳感器，雙基因突變細胞傳感器檢測準確度與靈敏度優(yōu)于單基因突變和野生型細胞傳感器。

綜上，本研究采用overlap PCR方法構(gòu)建組件對酵母細胞進行基因敲除，相較于一步PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化法基因敲除效率更高，相較于酶切連接構(gòu)建法具有成本更低、操作更簡便的優(yōu)勢。snq2單基因突變細胞傳感器的遺傳毒性檢測準確度優(yōu)于pdr5單基因突變細胞傳感器，pdr5、snq2雙基因突變酵母細胞傳感器具有最佳的準確度和靈敏度。因此，本實驗為構(gòu)建高準確度與靈敏度的酵母細胞傳感器提供了思路與方法，為酵母細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白基因pdr5與snq2的進一步功能研究奠定了基礎(chǔ)。