維吾爾族與漢族痤瘡患者皮膚微生物分布特點(diǎn)分析

黃桃源 帕力旦·阿布都卡的 買買提斯依提·買買提斯依明 馬新莉 唐三梅 肖樹朋 何仁亮

痤瘡是毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病， 多發(fā)生于面頰部、 胸部等皮脂溢出區(qū)［1］， 臨床表現(xiàn)為粉刺、 丘疹、 膿皰、 結(jié)節(jié)等， 對(duì)患者身心健康均具有較大影響。 已有研究表明， 皮膚表面寄居的數(shù)以億計(jì)的微生物可參與機(jī)體抵御外界病原菌的入侵， 激活機(jī)體先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)［2］， 然而， 一旦發(fā)生菌群失衡即可引發(fā)痤瘡等炎癥性皮膚病。 如寄生于毛囊皮脂腺中的痤瘡丙酸桿菌可通過誘導(dǎo)炎癥因子的釋放而引發(fā)痤瘡的發(fā)生［3－4］； 表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌等可通過誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子?α （tumor necrosis factor alpha，TNF?α）、 白細(xì)胞介素 （interleukin， IL） ?1、 IL?6而引發(fā)毛囊皮脂腺的炎癥反應(yīng)［5］。 部分研究學(xué)者指出， 不同民族人群由于生活環(huán)境、 生活習(xí)慣不同可造成皮膚微生物菌群分布差異， 但是否會(huì)導(dǎo)致引發(fā)痤瘡的微生物分布及治療敏感性不同卻未見報(bào)道。鑒于此， 筆者于本研究中分析了維吾爾族和漢族痤瘡患者的皮膚微生物分布特點(diǎn)， 以期為后續(xù)的臨床精準(zhǔn)治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

分別選取2018 年6 月喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院收治的5 例維吾爾族痤瘡患者和南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院收治的5 例漢族痤瘡患者作為研究對(duì)象， 兩族患者性別、 年齡、 體重及痤瘡嚴(yán)重程度均無明顯差異（P均＞0.05）， 具有可比性， 詳見表1。

表1 維吾爾族和漢族痤瘡患者臨床資料對(duì)比Table 1 Comparison of clinical data of Uyghur and Han patients with acne

1.2 主要試劑與儀器

TransGen AP221?02 聚合酶： 北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)； AxyPrep RNA 凝膠回收試劑盒： 美國(guó)Axygen 公司生產(chǎn)； QuantiFluorTM?ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)： 美國(guó)Promega 公司生產(chǎn)； TruSeqTMRNA Sample Prep Kit 試劑： 四川瑞博特生物科技有限公司生產(chǎn)； 甲醇、 乙腈、 乙醇（均為色譜純）：德國(guó)Merck 公司生產(chǎn)； PCR 儀： 美國(guó)ABI 公司生產(chǎn)； Illumina MiSeq 測(cè)序儀： 美國(guó)Illumia 公司生產(chǎn)。

1.3 樣品收集

皮膚采樣區(qū)于70% 乙醇消毒后， 用生理鹽水＋0.1%吐溫?20 溶液潤(rùn)濕的無菌棉棒反復(fù)旋轉(zhuǎn)擦拭25 s 后， 將棉棒放入采集管內(nèi)， 置入－80 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 微生物16S rRNA 多樣性檢測(cè)

收集樣品中加入裂解液70 ℃孵育5 min， 洗滌液除去雜質(zhì)后， 將樣品置入吸附柱， 洗脫液洗脫提取總DNA， 并采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量；按指定測(cè)序區(qū)域合成帶有條形碼（barcode） 的特異引物27F_338R （F 端序列為AGAGTTTGATCCTG GCTCAG， R 端序列為TGCTGCCTCCCGTAGGAGT），并在95 ℃變性7 min、 95 ℃變性10 s、 52 ℃退火1 min、 72 ℃延伸2 min （重復(fù)30 個(gè)循環(huán)） 的條件下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物使用AxyPrep RNA 凝膠回收試劑盒回收， 采用QuantiFluorTM?ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測(cè)； 構(gòu)建Miseq 文庫(kù)， 并將Illumina 官方接頭序列添加至目標(biāo)區(qū)域外端后， 再次使用AxyPrep RNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收； 繼而加入改造后的DNA 聚合酶及帶有4 種熒光標(biāo)記的dNTP， 讀取模板序列第一輪聚合反應(yīng)核苷酸種類， 化學(xué)切割熒光基團(tuán)及終止基團(tuán)， 恢復(fù)3’端粘性（循環(huán)操作至每條模板序列都完全被聚合為雙鏈）；統(tǒng)計(jì)每輪聚合反應(yīng)收集的熒光信號(hào)結(jié)果， 獲知模板DNA 片段序列。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Flash 軟件對(duì)Illumina MiSeq 檢測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化及過濾后， 使用Qiime 平臺(tái)進(jìn)行OUT 聚類、物種分類、 多樣性指數(shù)分析以及測(cè)序深度檢測(cè)。 最終所得數(shù)據(jù)于SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)、 方差齊性檢驗(yàn)以及計(jì)數(shù)資料的卡方檢驗(yàn)與計(jì)量資料的t檢驗(yàn)， 物種及代謝物的相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)性分析， 均以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 熱圖繪制采用Complex Heatmap 軟件，相關(guān)性熱圖繪制采用psych 與pheatmap 軟件， β 多樣性分析采用reshape 2、 ggplot 2、 factoextra 軟件。

2 結(jié)果

2.1 微生物α 多樣性分析

維吾爾族患者面部皮膚微生物α 多樣性Chao指數(shù)中位數(shù)為614、 Simpson 指數(shù)為0.0194， 漢族患者面部皮膚微生物α 多樣性Chao 指數(shù)中位數(shù)為662、 Simpson 指數(shù)為0.0226， 維吾爾族痤瘡患者面部皮膚微生物豐富度和多樣性均顯著低于漢族痤瘡患者（P均＜0.05）， 見圖1。

2.2 微生物β 多樣性分析

維吾爾族患者面部皮膚微生物主要為奈瑟菌屬（neisseria）、 微 球 菌 （ micrococcus）、 鏈 球 菌（streprococcus）， 漢族患者面部皮膚微生物主要為勞特羅普氏菌（lautropia）、 鮑曼不動(dòng)桿菌（acine?tobacter baumannii）、 痤瘡丙酸桿菌（propionibacte?rium acnes）。 主坐標(biāo)分析（PCoA） 結(jié)果顯示， 維吾爾族和漢族痤瘡患者面部皮膚微生物β 多樣性存在顯著差異（P＜0.05）， 見圖2。

2.3 微生物OUT 分類分析

熱圖分析結(jié)果顯示， 維吾爾族患者面部皮膚微生物中豐富度較高（紅色代表豐富度較高， 紫色代表豐富度較低） 的有奈瑟菌屬、 微球菌、 鏈球菌，漢族患者面部皮膚微生物中豐富度較高的有勞特羅普氏菌、 鮑曼不動(dòng)桿菌、 痤瘡丙酸桿菌， 維吾爾族和漢族痤瘡患者面部皮膚微生物種類存在顯著差異（P＜0.05）， 見圖3。

2.4 微生物OUT 分類與痤瘡相關(guān)性分析

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示， 維吾爾族和漢族患者痤瘡的發(fā)生均與痤瘡丙酸桿菌具有顯著相關(guān)性（r＝0.751、 0.583，P均＜0.001）， 見圖4。

圖1 維吾爾族和漢族痤瘡患者面部皮膚微生物α 多樣性Chao 指數(shù)（A） 及Simpson 指數(shù)（B） 柱狀圖Fig.1 Bar graphs of Chao index （A） and Simpson index （B） of facial skin microbe α diversity in Uyghur and Han patients with acne

3 討論

皮膚作為人體最大的器官， 其表面定植有數(shù)以億計(jì)的微生物， 且這些微生物可通過調(diào)節(jié)機(jī)體先天性免疫和適應(yīng)性免疫影響皮膚健康［6］， 如皮膚微生物的失衡可導(dǎo)致痤瘡等皮膚問題的發(fā)生。 且臨床研究證實(shí)， 不同民族人群由于生活環(huán)境和飲食習(xí)慣不同， 皮膚微生物的組成亦不相同。 鑒于此， 本研究筆者為探尋不同民族痤瘡患者皮膚微生物分布情況， 以便為不同患者提供個(gè)性化治療方案， 利用16S rRNA 測(cè)序分析了維吾爾族和漢族痤瘡患者面部皮膚微生物的多樣性、 OUT 分類及其OUT 分類與痤瘡的相關(guān)性。

圖2 維吾爾族和漢族痤瘡患者面部皮膚微生物β 多樣性分析主要貢獻(xiàn)圖Fig.2 Major contribution chart of facial skin microbe β diversity in Uyghur and Han patients with acne

圖3 維吾爾族和漢族痤瘡患者面部皮膚微生物OUT 分類組成熱圖Fig.3 OUT classification heatmap of facial skin microbes in Uyghur and Han patients with acne

圖4 維吾爾族和漢族痤瘡患者面部皮膚微生物OUT 分類與痤瘡相關(guān)性分析（A 為漢族、 B 為維吾爾族）Fig.4 Correlation analysis between facial skin microbe OUT classification and acne in Uyghur and Han patients with acne （A： Han nationality； B： Uyghur nationality）

相關(guān)研究證實(shí)， 痤瘡的發(fā)生與皮膚微生物構(gòu)成的微生物環(huán)境密切相關(guān)， 不同患者皮膚微生物的差異可導(dǎo)致患者愈后效果各不相同。 而本研究結(jié)果顯示， 維吾爾族和漢族痤瘡患者面部皮膚微生物的多樣性存在顯著差異， 但患者痤瘡的發(fā)生均與痤瘡丙酸桿菌具有顯著相關(guān)性。 可能與Contassot E 等［7－9］研究顯示的痤瘡丙酸桿菌能夠引起IL?1α、 IL?1β、Toll 樣受體（toll?like receptor， TLR） ?2、 TLR?4 等過度釋放而導(dǎo)致的毛囊漏斗部過度角化有關(guān)。 另外， 也有研究表明， 鏈球菌可通過誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞釋放IL?1β、 TNF?α、 IL?6 等多種炎癥因子引發(fā)炎癥反應(yīng)而誘發(fā)痤瘡的發(fā)生［10］。 且鏈球菌還能通過激活TLR?2 及酯酶破壞毛囊壁加重炎癥反應(yīng)， 并形成生物膜抵御抗生素的殺菌作用［8］。 而本研究結(jié)果顯示， 維吾爾族患者痤瘡的發(fā)生與鏈球菌高度相關(guān)， 但漢族患者痤瘡的發(fā)生與鏈球菌的相關(guān)性卻不高。 這可能就是導(dǎo)致不同患者同種治療方式效果不一樣的原因之一， 有待進(jìn)一步深入研究探討。

綜上所述， 維吾爾族和漢族痤瘡患者面部皮膚微生物的多樣性、 OUT 分類均存在顯著差異， 但痤瘡的發(fā)生均與痤瘡丙酸桿菌具有顯著相關(guān)性， 其是否會(huì)對(duì)痤瘡的治療效果產(chǎn)生影響還需進(jìn)一步深入研究探討。