甘草瀉心湯調控PERK-elF2α-CHOP信號通路保護應激態(tài)腸上皮細胞屏障的機制

沈 雁，鐘繼紅，倪思憶，呂 賓

(1.浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院消化內科，浙江 杭州 310005；2.浙江省中醫(yī)院消化內科，浙江 杭州 310006)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種累及結腸黏膜和黏膜下層的慢性復發(fā)性腸道炎癥性疾病，其臨床表現(xiàn)復雜多樣，病理機制尚不十分明確。隨著國民生活方式的日趨西化，我國UC發(fā)病率不斷上升[1]。因此，深入探索UC的確切發(fā)病機制和尋找有效的治療藥物是迫切需要解決的臨床實際問題。在UC的發(fā)病機制中，免疫紊亂是各種病因導致結腸炎癥損傷的下游環(huán)節(jié)[2]；而目前越來越多的研究證實，腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IECs)過度凋亡導致腸黏膜屏障損傷、局部免疫系統(tǒng)異常暴露是引起UC發(fā)病和病情進展的上游核心環(huán)節(jié)[3-4]。在這一環(huán)節(jié)中，內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)狀態(tài)下激活的蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)-真核細胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，elF2α)-C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)凋亡信號通路起到重要的中介作用[5]。大量證據表明，UC臨床癥狀的消失并不代表長期治療的成功，國際上已將“黏膜愈合”確立為UC的首要治療終點和關鍵預后指標[6-7]，保護腸黏膜屏障穩(wěn)態(tài)、促進黏膜愈合已成為當前UC治療藥物開發(fā)的主要研究方向。甘草瀉心湯(Gancao Xiexin Decoction，GXD)是起源于《傷寒論》的經典名方，可用于如反流性食管炎、復發(fā)性口腔潰瘍、白塞氏病等多種黏膜損傷性疾病，國內眾多學者的臨床實踐亦證實其對UC同樣具有良好療效[8-10]，且長期使用未見明顯不良反應。但該方的作用機制和作用靶點尚不清楚。本研究通過建立體外IECs的應激態(tài)模型，從GXD對細胞的活性、凋亡、通透性和細胞內PERK-elF2α-CHOP信號通路的影響方面闡明該方的部分作用機制。

1 材料

1.1 實驗細胞系Caco-2細胞株購自美國ATCC公司，生長于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每1-2 d更換培養(yǎng)液。5-7 d后細胞生長達融合，按1 ∶2或1 ∶3傳代。實驗時取對數生長期細胞。

1.2 實驗藥物甘草瀉心湯(炙甘草12 g、干姜9 g、半夏9 g、黃芩9 g、黃連3 g、黨參9 g、大棗6 g)，飲片購于浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院中藥房；按照成人-小鼠體表面積換算，確定小鼠臨床甘草瀉心湯等效劑量為8 g·kg-1·d-1；將上述飲片用蒸餾水浸泡，常規(guī)煎煮2次，混合過濾，濃縮為灌胃液后保存于-20 ℃冰箱。

1.3 試劑衣霉素(tunicamycin，Tm，美國Sigma-Aldrich公司，批號：654380)；PERK、eIF2α、ATF4、CHOP一抗(美國Sigma-Aldrich公司，批號分別為：P0074、SAB4500729、SAB4300041、SAB4500631)；羊抗兔和羊抗鼠二抗(杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司，批號分別為：GAR0072、GAM007)；CCK-8試劑盒(上海聯(lián)科生物公司)；Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒(美國Biouniquer公司)、PI染液(美國Sigma-Aldrich公司)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(美國GIBCO公司)；膠原酶Ⅺ、中性蛋白酶Ⅰ、山梨醇和DAPI液(美國Sigma-Aldrich公司)。

1.4 儀器3111型細胞培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱、生物安全操作柜和離心機(美國Thermo公司)；spectraMax Plus 384型全波長酶標儀(美國MD公司)、Accuri C6型流式細胞儀(美國BD公司)、Mini-Proten Tetra System電泳系統(tǒng)和ChemiDoc XRS+System凝膠成像儀(美國Bio-RAD公司)、Millicell-ERS跨膜電阻儀(美國Millipore公司)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備將30只BALB/c雄性小鼠隨機分為兩組：含藥血清組給予甘草瀉心湯8 g·kg-1·d-1，空白血清組給予等體積蒸餾水，每日2次，連續(xù)5 d(給藥劑量=臨床常用劑量×動物等效劑量系數×培養(yǎng)基內的稀釋度)。采血前夜禁食不禁水，次日末次給藥1 h后眼球摘除法取小鼠抗凝血，靜置2 h后，3 000 r·min-1離心10 min，取血清56 ℃恒溫水浴30 min滅活補體，0.22 μm除菌濾膜過濾除菌后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞分組造模Caco-2細胞分為正常對照(NC)組、模型(MC)組、GXD低劑量(GXD-L)、中劑量(GXD-M)和高劑量組(GXD-H)，用Tm誘導法[7]建立細胞ERS模型。

2.3 CCK-8法檢測細胞存活率細胞以5×107個·L-1的密度接種于96孔板，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h，棄上清后分組給藥：NC組為200 μL培養(yǎng)基中含有100 μL空白血清；MC組為200 μL培養(yǎng)基中含有100 μL空白血清和終濃度為10 mg·L-1的Tm；GXD-L、GXD-M和GXD-H組(分別含 5%、10%、20% 含藥血清)為200 μL培養(yǎng)基中分別對應含有10、20和40 μL GXD含藥血清，90、80和60 μL空白血清以及終濃度為10 mg·L-1的Tm。12 h藥物干預結束后，PBS洗滌，每孔加入10 μL CCK-8工作液，37 ℃孵育2 h，450 nm讀板，記錄OD值。每組設6個復孔，同時設溶劑對照組。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率和細胞周期調整細胞濃度為1×108個·L-1，3 mL接種于中號培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h，棄上清后按上述分組和濃度比例給藥，繼續(xù)作用12 h后，胰酶消化細胞，PBS漂洗2次，2 000 r·min-1離心5 min。先用Binding buffer 懸浮細胞后加入5 μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光反應5-15 min，上機檢測凋亡率；再加入70%冷乙醇固定12 h，加入1 mL PI染液，室溫避光孵育20 min后，上機檢測細胞周期。激發(fā)波長為488 nm，并用相應軟件進行數據分析。每組重復3次。

2.5 Millicell-ERS電阻儀檢測細胞跨膜電阻抗(TEER)調整細胞濃度為2×107個·L-1，200 μL/孔接種于Transwell頂室。底室中加入培養(yǎng)基600 μL。12 h細胞貼壁完全后，按上述分組和濃度比例給藥，繼續(xù)作用12 h后，用Millicell電阻儀檢測單層膜細胞的TEER。每組設3個復孔。

2.6 FITC-dextran法檢測細胞旁通透性按“2.5”中方法處理細胞并給藥，48 h后，用Hank鹽平衡液清洗頂室、底室，向頂室內加入100 μL異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FITC-dextran，1 g·L-1)，下室內加入500 μL Hank鹽平衡液，37 ℃避光孵育2 h，期間每30 min從基底側收集1次上清液，置于96孔板上，熒光分光光度計測定熒光強度，激發(fā)光波長為480 nm，發(fā)射光波長為520 nm，制作標準曲線并計算FITC-dextran濃度。每組設3個復孔。

2.7 Western blot法檢測細胞內通路蛋白表達水平按“2.4”中方法處理細胞并給藥，繼續(xù)作用12 h后，胰酶消化并裂解細胞，離心收集上清液。BCA法測定蛋白濃度，各組均取30 μg蛋白，加等體積Buffer混合、上樣，行SDS-PAGE電泳。200 mA電轉2.5 h，PVDF膜室溫封閉1 h。洗膜后移入分別含PERK、elF2α、ATF4和CHOP一抗(稀釋比例為1 ∶1 000)的孵育盒中過夜；洗膜3次，轉移到含二抗(稀釋比例為1 ∶5 000)的孵育盒中孵育1 h；再次洗膜3次后用增強化學發(fā)光法檢測陽性信號，分析各電泳條帶的性質。

3 結果

3.1 GXD對應激態(tài)Caco-2細胞存活率的影響Tm干預Caco-2細胞12 h后，通過CCK-8法測定結果顯示：MC組細胞的存活率為46.88%±6.09%，明顯低于NC組的97.16%±4.21%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；GXD-L、GXD-M和GXD-H組的存活率分別為49.01%±3.86%、73.50%±8.94%和82.23%±7.70%，與MC組相比，GXD-M、GXD-H組存活率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見Fig 1。

3.2 GXD對應激態(tài)Caco-2細胞凋亡率和細胞周期分布的影響通過流式細胞術測定結果顯示：① MC組細胞的凋亡率為29.95%±2.16%，明顯高于NC組的3.13%±0.28%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；GXD-L、GXD-M和GXD-H組的凋亡率分別為19.02%±1.90%、16.33%±2.11%和10.26%±2.07%，與MC組相比，GXD-L、GXD-M和GXD-H組的凋亡率均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果見Fig 1、2。② MC組G2期細胞的比例為5.24%±0.58%，明顯低于NC組的31.12%±4.41%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示Tm誘導細胞處于內質網應激狀態(tài)時，細胞被大量阻滯于有絲分裂早期，從而增加了細胞DNA及其修復系統(tǒng)暴露于外源性有害刺激的時間和幾率，細胞易發(fā)生損傷和凋亡；GXD-L、GXD-M和GXD-H組G2期細胞的比例分別為13.90%±1.81%、18.63%±2.50%和24.97%±1.90%，與MC組相比，GXD-L、GXD-M和GXD-H組的G2期細胞比例均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，提示GXD的干預可緩解細胞周期阻滯，有利于細胞對損傷的DNA進行及時有效的修復，避免細胞的損傷和凋亡。見Fig 3。

Fig 1 Comparison of survival rate and apoptotic rate of stress Caco-2 cells after intervention of different concentrations of GXDA:Normal control group;B:Model group;C:Low-dose GXD group;D:Medium-dose GXD group;E:High-dose GXD group.##P<0.01 vs normal control group;**P<0.01 vs model group.

Fig 2 Effects of different concentrations of GXD on apoptosis of stress Caco-2 cells A:Normal control group;B:Model group;C:Low-dose GXD group;D:Medium-dose GXD group;E:High-dose GXD group.

Fig 3 Effects of different concentrations of GXD on cell cycle distribution of stress Caco-2 cellsA:Normal control group;B:Model control group;C:Low-dose GXD group;D:Medium-dose GXD group;E:High-dose GXD group.#P<0.05,##P<0.01 vs normal control group;**P<0.01 vs model group.

3.3 GXD對應激態(tài)Caco-2細胞屏障通透性的影響通過TEER檢測和FITC-dextran法的結果顯示：MC組的TEER值明顯低于NC組，前者FITC-dextran的濃度明顯高于后者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與MC組相比，GXD-L、GXD-M和GXD-H組的TEER值不同程度地升高(P<0.01)、FITC-dextran的濃度不同程度地降低(P<0.05)。見Tab 1。

Tab 1 Effects of different concentrations of GXD on cell barrier permeability of stress Caco-2 n=3)

3.4 GXD對應激態(tài)Caco-2細胞內PERK-elF2α-CHOP信號通路關鍵蛋白表達水平的影響通過Western blot法的結果顯示：MC組細胞內磷酸化的PERK(p-PERK)、磷酸化的elF2α(p-elF2α)、ATF4和凋亡關鍵蛋白CHOP的表達水平均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與MC組相比，GXD-M、GXD-H組中p-PERK、p-elF2α、ATF4和CHOP的表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見Fig 4。

Fig 4 Effects of different concentrations of GXD on expression of PERK-eIF2α-CHOP signaling pathway in stress Caco-2 cellsA:Normal control group;B:Model group;C:Low-dose GXD group;D:Medium-dose GXD group;E:High-dose GXD group.#P<0.05,##P<0.01 vs normal control group;*P<0.05,**P<0.01 vs model group.

4 結論

既往普遍認為，UC的發(fā)生發(fā)展可能是包括遺傳、環(huán)境、腸道菌群、免疫等在內的多因素共同作用的結果，其中免疫功能紊亂是下游共同的病理環(huán)節(jié)[2]。研究表明，腸黏膜屏障穩(wěn)態(tài)破壞是引起UC發(fā)病和病情進展的重要原因。作為腸黏膜屏障主要結構和功能基礎的IECs若發(fā)生過度凋亡，將導致屏障結構損傷、腸上皮通透性增高，多種外源性抗原物質異常暴露于固有層黏膜相關淋巴組織，刺激后者大量釋放致炎因子，進而通過因子間網絡化通訊使免疫反應級聯(lián)放大，最終引起腸道炎癥失控和結腸黏膜損傷[3-4]。在UC患者、UC動物模型中[11-13]以及體外ERS狀態(tài)腸細胞模型[14]中均存在IECs大量凋亡和屏障通透性增高現(xiàn)象，提示IECs異常凋亡是引起腸黏膜屏障破壞、進而導致UC發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

ERS是指細胞在各種應激原的刺激下，其內質網合成加工蛋白質的生理功能障礙，大量未折疊或錯誤折疊蛋白在內質網腔中蓄積所啟動的一系列細胞內穩(wěn)態(tài)失衡過程[15]。靜息狀態(tài)下，ERS標志蛋白——葡萄糖調節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78，GRP78)與內質網膜上的多種跨膜感受蛋白相結合，使后者處于失活狀態(tài)。適度的ERS可使跨膜感受蛋白與GRP78發(fā)生解離而活化，進而激活“未折疊蛋白反應”這一保護性機制，有利于改善蛋白質的合成加工，避免應激細胞損傷死亡，體現(xiàn)了機體的自我穩(wěn)定能力。但若應激過強或過久，未折疊蛋白反應不足以完全代償緩解細胞損傷時，為維持細胞內穩(wěn)態(tài)，活化的跨膜感受蛋白將進一步激活細胞凋亡程序，誘導應激細胞的程序性死亡[16]。目前已明確的ERS跨膜感受蛋白包括：PERK、活化轉錄因子6(the activating transcription factor 6，ATF6)和肌醇酶1(inositol requiring enzyme l，IREI)，分別啟動3條ERS特有的凋亡信號通路。其中PERK所啟動的PERK-eIF2α-CHOP通路是十分重要的凋亡信號轉導途徑。與GRP78解離后的PERK通過同源二聚化而磷酸化激活自身，隨后依次磷酸化elF2α、誘導轉錄活化因子4(the activating transcription factor 4，ATF4)的翻譯表達，最終激活ERS獨特的凋亡標志蛋白——CHOP的基因轉錄，后者通過調控死亡受體途徑和線粒體途徑兩大經典方式激活凋亡效應子Caspase-3，執(zhí)行細胞凋亡發(fā)生[17]。研究表明，PERK-eIF2α-CHOP信號通路參與甚至主導了如神經退行性病變、心肌病、2型糖尿病、慢性腎病、缺血/再灌注及部分化學中毒損傷等的許多疾病的病理生理過程[18]；而抑制該通路上下游各關鍵蛋白的表達和/或活化水平，能夠對抗凋亡，實現(xiàn)對ERS誘發(fā)損傷的保護，有效阻止上述疾病的發(fā)生發(fā)展。

在中醫(yī)基礎理論和實踐中，UC病程長、纏綿難愈，多屬本虛標實之證：其基本病機為正虛邪戀、寒熱錯雜，其中又以脾虛為主要矛盾。脾氣虛弱、濕蘊胃腸的特點始終貫穿于潰病性結腸炎的各個階段及各種證型中。因此，UC治療原則應為健脾和中、平調寒熱。GXD起源于《傷寒論》，拓展于《金匱要略》，該方能有效減輕UC的臨床癥狀和腸鏡下評分，提高生活質量，促進結腸黏膜的再生修復，改善腸黏膜屏障功能，降低復發(fā)率，與美沙拉嗪等藥物共用能進一步提高臨床療效[8-10]。但GXD對腸黏膜屏障的保護作用是否通過調控PERK-eIF2α-CHOP信號通路、進而抑制IECs異常凋亡而實現(xiàn)，其中的具體機制和靶點亦不清楚，需要進一步探明。本課題組以Tm誘導法建立的體外IECs的應激態(tài)模型為研究對象開展實驗，結果顯示：① ERS激動劑Tm干預后，細胞的存活率明顯下降、凋亡率明顯上升、G2期細胞比例明顯減少，單層細胞的TEER值明顯降低，F(xiàn)ITC-dextran濃度明顯升高，提示ERS時細胞被大量阻滯于有絲分裂早期，并發(fā)生了嚴重損傷和大量凋亡，細胞屏障受損、通透性增加；而不同濃度的GXD作用后，各組細胞的存活率均上升、凋亡率均下降、G2期細胞比例均增加，單層細胞的TEER值均升高，F(xiàn)ITC-dextran濃度均下降，提示GXD能緩解應激態(tài)細胞的周期阻滯，利于細胞及時修復損傷，減輕凋亡發(fā)生，保護細胞屏障和穩(wěn)定屏障通透性。② ERS激動劑Tm干預后，細胞內p-PERK、p-elF2α、ATF4和ERS凋亡標志蛋白CHOP的表達水平均明顯升高，提示ERS時PERK-elF2α-CHOP信號通路被激活而介導了凋亡信號的轉導；而中、高劑量的GXD作用后，細胞內p-PERK、p-elF2α、ATF4和CHOP的表達水平均明顯下降，提示GXD可通過抑制該通路的信號轉導，從而發(fā)揮抗凋亡效應，保護IECs屏障。

上述研究結果闡釋了GXD對UC的部分治療機制：GXD可通過減少細胞的應激損傷和過度凋亡，從而保護IECs細胞屏障穩(wěn)態(tài)，抑制PERK-eIF2α-CHOP信號通路的激活可能是其治療靶點。GXD是否能同時影響ERS的其他特異性凋亡途徑，其對IECs的其他損傷方式以及細胞旁途徑是否有保護作用，仍需要后續(xù)更為深入的系列研究來明確。