銀杏內(nèi)酯K調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α通路抑制氧糖剝離再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)血管單元損傷

周靜怡,劉 秋,楊 昊,曹澤彧,周 軍,許治良,曹 亮,王振中,肖 偉1，

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室，3.現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺，4.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001)

卒中是60歲以上老年人永久致殘的第一大病因，可導(dǎo)致對側(cè)偏癱、感覺減退等不可逆性的神經(jīng)功能障礙，由卒中繼發(fā)的血管性癡呆也是老年人第二常見高發(fā)的癡呆癥[1]。腦血管栓塞或血栓形成(以大腦中動脈高發(fā))引起的缺血性腦卒中約占卒中的80%。目前，靜脈溶栓和血管內(nèi)血栓切除術(shù)以恢復(fù)血流供應(yīng)是治療缺血性腦卒中最有效的方法，但因治療時間窗窄和禁忌癥等問題臨床受眾范圍小(約10%)[2]。近幾十年來，許多研究致力于證明神經(jīng)保護和神經(jīng)恢復(fù)療法可通過促進結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)來抑制缺血性卒中損傷。然而，大多數(shù)藥物針對的是缺血級聯(lián)中的單個事件和單個神經(jīng)元件，其局限性在一定程度上解釋了臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化失敗的原因。因此，美國國家神經(jīng)疾病和中風(fēng)學(xué)會提出神經(jīng)血管單元(neurovascular unit，NVU)的概念[3]，除神經(jīng)元損傷外，膠質(zhì)類細胞特別是小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和腦部血管內(nèi)皮細胞損傷導(dǎo)致的血腦屏障破壞是卒中神經(jīng)血管單元損傷重要方面，因此，多靶點多效應(yīng)減少神經(jīng)血管損傷是缺血性腦卒中神經(jīng)保護及新藥開發(fā)的方向之一。

目前，多項臨床研究證實，急性缺血性腦卒中患者外周血中HIF-1α水平與患者腦梗死體積和神經(jīng)損傷程度呈正相關(guān)，且可較好的預(yù)測卒中患者預(yù)后情況，HIF-1α血清水平具有作為分子標志物評價缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能損傷嚴重程度及預(yù)后的潛在可能性[4-5]。在缺氧條件下，HIF-1α降解受到抑制，并被轉(zhuǎn)運到細胞核，與HIF-1β形成二聚體后與特定DNA結(jié)合區(qū)即缺氧反應(yīng)元件(HREs)結(jié)合，調(diào)控下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。腦微血管內(nèi)皮細胞是最早對缺血缺氧損傷做出反應(yīng)的神經(jīng)血管單位，其代償反應(yīng)與HIF-1α密切相關(guān)，研究表明，HIF-1α通路激活誘導(dǎo)其靶基因血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血紅加氧素(HO)等蛋白表達，可促進血管新生并調(diào)節(jié)血管緊張度，以建立腦部側(cè)支循環(huán)，對血腦屏障起到了保護作用[6]。與此同時，HIF-1α的靶基因還包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)等，在多種炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，被認為是負責(zé)控制炎癥相關(guān)信號事件的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[7]。因此，HIF-1α具有缺血性腦損傷保護和促進損傷的雙重“身份”，可能在不同細胞及不同病理階段中可能扮演不同“角色”。

銀杏葉提取物和銀杏二萜內(nèi)酯有效部位制劑已長期用于腦血管系統(tǒng)相關(guān)疾病的臨床治療，相關(guān)藥物可通過拮抗PAF受體抑制血小板聚集預(yù)防二次血栓，同時可通過抑制興奮性神經(jīng)毒性、炎癥反應(yīng)、氧化損傷、代謝紊亂、細胞凋亡等多途徑抗缺血性腦卒中損傷[8]，具有抗血栓和神經(jīng)保護的雙重功能。其中，GK作為最強的PAF受體拮抗劑[8]，其調(diào)節(jié)HIF-1α通路對小膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)及內(nèi)皮細胞的作用，目前尚未見報道。本研究通過培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細胞系BV-2細胞和人臍靜脈細胞融合細胞EA.hy926進行OGD/R造模模擬缺血性腦卒中損傷，確定GK抑制神經(jīng)血管單元損傷藥效及調(diào)節(jié)HIF-1α通路機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器小鼠小膠質(zhì)細胞BV-2細胞購自中國科學(xué)院昆明植物研究所；人臍靜脈細胞融合細胞EA.hy926購自于上海中科院細胞庫；DMEM(含HEPES)培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基、FBS由美國Gibco公司提供；Mouse TNF-α Valukine ELISA Kit、Mouse IL-1β Valukine ELISA Kit、Mouse IL-6 Valukine ELISA Kit由美國R&D公司提供；CCK-8試劑盒由南京建成公司提供；LY294002由美國Sigma-aldrich公司提供；LDH試劑盒、磷酸化酶抑制劑由瑞士Roche公司提供；HIF-1α (D2U3T) Rabbit mAb (14179S)、Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP?Rabbit mAb (4370T)、p44/42 MAPK (Erk1/2) (137F5) Rabbit mAb (4695T)、Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP?Rabbit mAb (13038T)、Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb (4691T)、HO-1 (E3F4S) Rabbit mAb (43966S)、Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb (9664T)、Cleaved Caspase-9 (Asp315) (D8I9E) Rabbit mAb (20750S)、Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody (7074S)由美國CST公司提供；Anti-VEGFA antibody (ab1316)由英國abcam公司提供；三氣培養(yǎng)箱由德國Binder公司提供；多模式微孔檢測系統(tǒng)Flex Station 3由美國MD公司提供；GK(HPLC純度≥99%)由江蘇康緣藥業(yè)中藥制藥過程新技術(shù)國家重點實驗室制備。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)，OGD/R模型制備和給藥 BV-2和EA.hy926細胞均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含體積分數(shù)為10% FBS)中，置于37 ℃，含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

OGD/R模型制備及給藥：將細胞傳代種植于96孔培養(yǎng)板或細胞皿中，在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h后進行造模。吸棄細胞上清，加入無FBS無糖DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞，去除殘留含糖培養(yǎng)基，然后加入適量無FBS無糖DMEM培養(yǎng)基后將細胞置于無氧(O2≤0.2%)三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h進行缺糖缺氧造模。同時，正常組細胞吸棄培養(yǎng)基，加入無FBS含糖DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞去除殘留培養(yǎng)基，然后加入適量無FBS含糖DMEM培養(yǎng)基后將細胞置于正常培養(yǎng)箱中培養(yǎng)作為對照。4 h后，取出造模細胞給予無FBS含糖DMEM培養(yǎng)基和不同劑量的GK干預(yù)后將細胞置于正常培養(yǎng)箱中進行復(fù)糖復(fù)氧1、6或24 h。

1.2.2應(yīng)用炎癥因子試劑盒檢測OGD/R損傷BV-2細胞上清中炎癥因子分泌 將BV-2細胞用胰酶消化后按照2×104個/孔的密度種植于96孔培養(yǎng)板中，在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h進行造模。細胞OGD損傷4 h后，加入0.18-25.00 μmol ·L-1GK并復(fù)糖復(fù)氧再灌注干預(yù)24 h。將細胞板1 000 r·min-1離心5 min后，收集細胞上清按照試劑盒說明檢測上清中炎癥因子分泌水平。

1.2.3應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測OGD/R損傷EA.hy926細胞活力 將EA.hy926細胞用胰酶消化后按照1×105個/孔的密度種植于96孔培養(yǎng)板中，在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h進行造模。細胞OGD損傷4 h后，加入6.25-25.00 μmol ·L-1GK并復(fù)糖復(fù)氧再灌注干預(yù)24 h。按照試劑盒說明，加入CCK-8試劑10 μL/孔，置于正常培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)1 h。用微孔板檢測系統(tǒng)Flex Station 3讀取各組細胞于450 nm處的吸光度值OD450 nm，然后計算細胞相對活力(The relative cell viability)/%=(各組OD450 nm值-背景OD450 nm值)/(正常組OD450 nm值-背景OD450 nm值)。

1.2.4應(yīng)用LDH試劑盒檢測OGD/R損傷EA.hy926細胞上清中LDH分泌 將EA.hy926細胞用胰酶消化后按照1×105個/孔的密度種植于96培養(yǎng)板中，在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h進行造模。細胞OGD損傷4 h后，加入6.25-25.00 μmol ·L-1GK并復(fù)糖復(fù)氧再灌注干預(yù)24 h。按LDH試劑盒說明書操作，于492 nm處測定各組吸光度值，然后計算相對LDH釋放量(The relative of LDH release)/%=(各組OD492 nm值-low control組OD492 nm值)/(正常組OD492 nm值-low control組OD492 nm值)。

1.2.5提取全蛋白進行Western blot檢測GK給藥后相關(guān)蛋白的變化 將細胞用胰酶消化后按照BV-2細胞1×106個/皿、EA.hy926細胞5×106個/皿的密度種植于細胞培養(yǎng)皿(直徑為10 cm)中，在細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)約24 h進行造模。細胞OGD損傷4 h后，加入6.25-25.00 μmol ·L-1GK并復(fù)糖復(fù)氧再灌注干預(yù)1 h和6 h。BV-2細胞再灌注1 h提取蛋白進行Western blot檢測通路上游Akt及Erk蛋白磷酸化水平和總蛋白含量，6 h時提取蛋白檢測通路下游HIF-1α蛋白水平。EA.hy926細胞再灌注1 h提取蛋白檢測通路上游Akt蛋白磷酸化水平和總蛋白含量，再灌注6 h提取蛋白檢測通路下游HIF-1α、HO-1、VEGF、cleaved caspase-3及cleaved caspase-9蛋白水平。

應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002驗證通路時，再灌注時加入12.50 μmol ·L-1GK和5-10 μmol ·L-1LY294002共同干預(yù)BV-2細胞1 h和6 h，然后提取蛋白進行Western blot 檢測相應(yīng)通路蛋白的變化。

Western blot具體方法為：收集各組細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，應(yīng)用BCA法測定樣品蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，TBS洗滌膜后，5% 脫脂奶粉室溫封閉1-2 h，TBST洗滌膜，然后加入5% BSA抗體稀釋液1 ∶1 000稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌膜3次，加入HRP標記的羊抗兔二抗(1 ∶3 000)溶液室溫孵育2 h后洗滌膜，ECL法顯影，應(yīng)用Chemi Doc XRS系統(tǒng)拍照，采用Image Lab圖像分析軟件進行顯影條帶灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 GK抑制OGD/R損傷后BV-2細胞炎癥因子的分泌GK給藥氧糖剝離再灌注損傷的BV-2細胞24 h后應(yīng)用試劑盒檢測細胞上清炎癥因子水平結(jié)果(Fig 1)顯示，BV-2細胞OGD/R損傷后分泌至細胞上清中的IL-6和IL-1β炎癥因子水平高于正常對照組，GK可減少IL-6和IL-1β炎癥因子的分泌。同時，0.18-25.00 μmol ·L-1濃度梯度的GK可劑量依賴性抑制BV-2細胞TNF-α炎癥因子的分泌，其IC50值為4.41 μmol ·L-1。

2.2 GK調(diào)節(jié)Akt/Erk/HIF-1α通路抑制BV-2細胞炎癥損傷GK給藥氧糖剝離再灌注損傷的BV-2細胞1 h和6 h后Western blot檢測通路蛋白水平結(jié)果(Fig 2)顯示，GK可劑量依賴性上調(diào)通路上游Akt蛋白磷酸化水平，增加Akt活性，6.25和12.50 μmol ·L-1濃度GK下調(diào)Erk蛋白磷酸化水平，同時12.50和25.00 μmol ·L-1濃度GK下調(diào)通路下游HIF-1α蛋白量。

2.3 LY294002干預(yù)后GK對Akt/Erk/HIF-1α通路蛋白調(diào)節(jié)作用下降LY294002和GK共同干預(yù)氧糖剝離再灌注損傷的BV-2細胞1 h和6 h后Western blot檢測通路蛋白水平結(jié)果(Fig 3)顯示，5-10 μmol ·L-1濃度梯度的LY294002干預(yù)后GK對p-Akt/Akt、p-Erk、Erk和下游HIF-1α蛋白調(diào)節(jié)作用下降，因此，GK可能通過作用于Akt下調(diào)Erk和HIF-1α活性抑制炎癥因子分泌發(fā)揮抗炎作用。

2.4 GK提高OGD/R損傷后EA.hy926細胞活力和抑制LDH釋放GK給藥氧糖剝離再灌注損傷的EA.hy926細胞24 h后應(yīng)用試劑盒檢測細胞活力和上清LDH水平結(jié)果(Fig 4)顯示，EA.hy926細胞OGD/R損傷后細胞活力下降，25.00 μmol ·L-1濃度的GK提高細胞活力；同時，GK抑制OGD/R損傷后細胞上清中LDH釋放量，且呈劑量依賴性。

Fig 1 GK inhibited release of cytokines in BV-2 cells induced by OGD/R n=4)A:GK dose-dependently inhibited the release of TNF-α in BV-2 cells induced by OGD/R injury;B-C:GK inhibited the release of IL-6 and IL-1β in BV-2 cells induced by OGD/R injury.##P<0.01 vs Control group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD/R group

Fig 2 GK regulated activities of Akt/Erk and protein expression of HIF-1α##P<0.01 vs Control group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD/R group

Fig 3 LY294002 inhibited regulation of GK on Akt/Erk/HIF-1α activity#P<0.05 vs Control group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD/R group;△P<0.05,△△P<0.01 vs GK group

2.5 GK明顯抑制OGD/R誘導(dǎo)的EA.hy926細胞凋亡GK給藥氧糖剝離再灌注損傷的EA.hy926細胞6 h后Western blot檢測cleaved caspase-3及cleaved caspase-9蛋白水平結(jié)果(Fig 5)顯示，12.50和25.00 μmol ·L-1GK抑制其表達，即抑制OGD/R誘導(dǎo)的EA.hy926細胞凋亡。

2.6 GK調(diào)節(jié)Akt/HIF-1α/HO-1/VEGF通路抑制EA.hy926細胞損傷GK給藥氧糖剝離再灌注損傷的EA.hy926細胞1 h和6 h后Western blot檢測通路蛋白水平結(jié)果(Fig 6)顯示，GK可劑量依賴性上調(diào)通路上游Akt激酶磷酸化，HIF-1α蛋白及下游HO-1及VEGF蛋白表達。因此，GK可能通過作用于Akt/HIF-1α/HO-1通路抑制EA.hy926細胞凋亡和Akt/HIF-1α/VEGF通路促進細胞生長發(fā)揮保護作用。

Fig 4 GK improved viability and inhibited release of LDH in EA.hy926 cell induced by OGD/R n=3)##P<0.01 vs Control group;**P<0.01 vs OGD/R group

Fig 5 GK inhibited activities of cleaved caspase-3/9 induced by OGD/R injury##P<0.01 vs Control group;**P<0.01 vs OGD/R group

Fig 6 GK regulated activities of Akt and protein expression of HIF-1α/HO-1/VEGF##P<0.01 vs Control group;*P<0.05,**P<0.01 vs OGD/R group

3 討論

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐實質(zhì)性巨噬細胞，發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。在缺血性腦卒中病理過程中，持續(xù)的血流減少誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞極化為M1樣表型(促炎型)，釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子，誘導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致血腦屏障及神經(jīng)細胞損傷[9]。本研究表明，BV-2細胞OGD/R損傷后分泌至細胞上清中的TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子水平顯著升高，而GK干預(yù)可顯著減少其分泌，抑制小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。除誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)外，小膠質(zhì)細胞還與構(gòu)成血腦屏障的微血管內(nèi)皮細胞保持著持續(xù)的“雙向通訊”，使其能夠檢測血腦屏障相關(guān)活動[10]。缺血性腦卒中腦微血管內(nèi)皮細胞損傷引起血腦屏障通透性增加，導(dǎo)致白細胞外滲，并通過“雙向通訊”進一步吸引并激活小膠質(zhì)細胞，放大炎癥過程[10]。本研究表明，GK提高內(nèi)皮細胞活力，并抑制OGD/R損傷后細胞上清中LDH釋放量，同時，cleaved caspase-3及cleaved caspase-9促凋亡蛋白表達被抑制，表明GK可能通過保護微血管內(nèi)皮細胞，抑制血腦屏障損傷。

VEGF被認為是最有效的血管生成因子之一，缺氧情況下，HIF-1α與HIF-1β結(jié)合形成異二聚體并與VEGF的5′-末端增強子區(qū)域中的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合后，激活VEGF轉(zhuǎn)錄并使其表達增加[11]，從而促進血管生成，增加血液及氧氣的輸送。HO-1代謝產(chǎn)物一氧化碳和膽紅素是有效的抗凋亡劑和抗氧化劑，兩者均顯示出血管單元保護作用[12]。相關(guān)研究表明，HIF-1α對HO-1的上調(diào)可促進細胞存活和血管生成[13]。PI3K/Akt通路是調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白質(zhì)合成的主要信號傳導(dǎo)途徑，在葡萄糖代謝，細胞凋亡，細胞增殖，轉(zhuǎn)錄和細胞遷移、炎癥等過程中起關(guān)鍵作用?；罨腜I3K誘導(dǎo)Akt磷酸化，然后p-Akt進一步磷酸化酪氨酸和色氨酸的下游殘基，從而激活了目標基因HIF-1α的轉(zhuǎn)錄[14]。本研究表明，GK可劑量依賴性上調(diào)Akt激酶磷酸化水平，激活HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄，進而上調(diào)下游HO-1及VEGF蛋白表達。因此，GK可能通過作用于Akt/HIF-1α/VEGF通路促進細胞生長和Akt/HIF-1α/HO-1通路抑制細胞凋亡，保護微血管內(nèi)皮細胞，抑制血腦屏障損傷。

不同類型細胞中的HIF-1α可與上下游多種蛋白組成不同的信號通路，調(diào)控細胞產(chǎn)生一系列對缺糖缺氧的代償反應(yīng)。除了保護血腦屏障，HIF-1α也是神經(jīng)炎癥的主要參與者，通過PKM2的核易位介導(dǎo)炎癥相關(guān)的基因的表達[15]。HIF-1α除受Akt通路調(diào)控，Erk通路也可誘導(dǎo)的HIF-1α磷酸化，通過阻止其CRM1依賴性核輸出，促進了核積累和轉(zhuǎn)錄活性[16]。抑制Erk通路下調(diào)HIF-1α表達，進而抑制M1小膠質(zhì)細胞極化，發(fā)揮抗炎的神經(jīng)保護作用[17]。因此，Akt及Erk通路均可影響HIF-1α表達，且兩者并不獨立，Akt可以直接抑制Erk通路?；罨腞af使MEK磷酸化，進而使Erk活化，而Raf的活性受到保守區(qū)2調(diào)節(jié)域上的磷酸化的負調(diào)控，Akt可以使保守區(qū)2域中Raf-1上Ser364或B-Raf上的Ser259和Ser428磷酸化，從而抑制Raf活性[18]。本研究表明，GK可增加Akt活性，并下調(diào)Erk蛋白磷酸化水平，從而下調(diào)HIF-1α蛋白表達，LY294002干預(yù)后GK相關(guān)調(diào)節(jié)作用減少，提示GK在小膠質(zhì)細胞內(nèi)可激活A(yù)kt下調(diào)Erk和HIF-1α活性抑制炎癥因子分泌發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，GK可通過調(diào)控神經(jīng)血管單元中小膠質(zhì)細胞內(nèi)Akt/Erk/HIF-1α通路及血管內(nèi)皮細胞內(nèi)Akt/HIF-1α/HO-1/VEGF通路，實現(xiàn)對HIF-1α表達的不同調(diào)控趨勢抑制腦缺血誘導(dǎo)的損傷。