四物湯改善多囊卵巢綜合征大鼠卵巢功能實(shí)驗研究*

朱 彤 張 楚 董浩旭 汪 輝 張明敏△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1婦產(chǎn)科，2中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430030

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種臨床常見婦科疾病，以月經(jīng)稀發(fā)、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變、胰島素抵抗為主要臨床表現(xiàn)，繼發(fā)月經(jīng)不調(diào)、不孕癥、心血管功能改變等疾病，嚴(yán)重影響女性身體健康和生殖功能[1-2]。目前，PCOS的發(fā)病原因仍未清晰，尚無法根治。研究[3-4]表明，應(yīng)用具有整體調(diào)理效果的傳統(tǒng)中藥單獨(dú)或輔助西藥進(jìn)行治療，均能從多方面改善PCOS患者臨床癥狀，達(dá)到調(diào)理月經(jīng)、治療不孕癥等目的。四物湯(Siwu tang，SWT)作為“婦科第一方”，其補(bǔ)血活血特點(diǎn)在治療PCOS方面具有獨(dú)特優(yōu)勢，臨床應(yīng)用中取得了不俗的療效[5-6]?；诖?，本課題組設(shè)計了相關(guān)實(shí)驗，以期觀察SWT對多囊卵巢綜合征(PCOS)大鼠動情周期、卵巢形態(tài)學(xué)及血清激素水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

雌性Wistar大鼠25只，6～8周齡，SPF級，購自湖北省疾病預(yù)防與控制中心實(shí)驗動物中心，飼養(yǎng)在同濟(jì)醫(yī)院SPF級動物房恒溫(23±1)℃、恒濕(50±5)%的條件下，每日的明暗循環(huán)為12 h和12 h，所有實(shí)驗均經(jīng)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(TJH-201901003)。

1.2 藥物、試劑及主要儀器

SWT中藥顆粒(華潤三九醫(yī)藥有限公司)，由熟地黃、當(dāng)歸、白芍和川芎以4∶3∶3∶2的比例組成。來曲唑(Selleck)，二甲雙胍(Solarbio公司)。戊巴比妥鈉(武漢谷歌)，睪酮(testosterone，T)、雌二醇(estradiol，E2)酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(德國Merck)，黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)ELISA試劑盒(武漢華聯(lián)科公司)。

主要實(shí)驗儀器：酶標(biāo)儀(Biotek)，DM IL LED倒置顯微鏡(德國Feica)。

1.3 造模、分組及處理

將25只SPF級雌性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、SWT低劑量組、SWT高劑量組和二甲雙胍組，各5只。除對照組外，各實(shí)驗組大鼠均采用來曲唑1 mg/(kg·d)灌胃誘導(dǎo)建立PCOS大鼠模型[7]，連續(xù)灌胃21 d。造模成功后，SWT低劑量組給予SWT 8.64 g/(kg·d)灌胃，SWT高劑量組給予SWT 25.92 g/(kg·d)灌胃，二甲雙胍陽性對照組[8]給予二甲雙胍200 mg/(kg·d)灌胃，對照組與模型組灌胃等量0.9%氯化鈉注射液。各組均連續(xù)干預(yù)4周。

1.4 動情周期監(jiān)測和統(tǒng)計

自造模開始即來曲唑干預(yù)第1天開始監(jiān)測，使用移液槍吸取0.9%氯化鈉注射液沖洗陰道，使用沖洗液制作陰道涂片，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，以細(xì)胞類型判定大鼠動情周期，分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期[9]。造模成功后，連續(xù)監(jiān)測15 d，繪制動情周期曲線，統(tǒng)計各組大鼠的動情期時間。

1.5 卵巢形態(tài)學(xué)觀察

末次干預(yù)結(jié)束后，采用40 mg/(kg·d)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死大鼠，剖腹摘取雙側(cè)卵巢，4%多聚甲醛固定，24 h后進(jìn)行石蠟包埋切片，并行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢組織病理學(xué)變化，統(tǒng)計黃體及囊腫數(shù)量。

1.6 血清激素水平檢測

末次干預(yù)結(jié)束后，腹主動脈采血，離心取血清后，通過ELISA檢測大鼠血清中FSH、LH、T、E2水平并計算LH/FSH比值，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動情周期比較

與正常對照組相比，模型組大鼠動情周期明顯改變，動情期顯著縮短(P<0.05)。

與模型組大鼠相比，SWT低劑量組、SWT高劑量組和二甲雙胍組大鼠動情周期有所恢復(fù)，動情期時間顯著增加(P<0.05)。見圖1。

1為模型組，2為對照組，3為SWT低劑量組，4為SWT高劑量組，5為二甲雙胍組。與對照組比較▲P<0.05，與模型組比較*P<0.05圖1 各組大鼠動情周期比較

2.2 卵巢形態(tài)學(xué)比較

與正常對照組相比，模型組大鼠卵巢形態(tài)明顯改變，黃體數(shù)量顯著減少(P<0.05)，囊腫數(shù)量顯著增多(P<0.05)。

與模型組大鼠相比，SWT低劑量組、SWT高劑量組和二甲雙胍組大鼠卵巢形態(tài)均有一定程度的恢復(fù)，黃體數(shù)量顯著增加(P<0.05)，囊腫數(shù)量顯著減少(P<0.05)。見圖2。

A為卵巢HE染色，B為卵巢黃體數(shù)目，C為卵巢囊腫數(shù)目。1為模型組，2為對照組，3為SWT低劑量組，4為SWT高劑量組，5為二甲雙胍組。與對照組比較▲P<0.05，與模型組比較*P<0.05圖2 各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)情況

2.3 血清激素水平比較

與正常對照組相比，模型組大鼠血清T、LH水平顯著升高，E2、FSH水平顯著降低，LH/FSH比值明顯升高(P<0.05)。

與模型組大鼠相比，SWT低劑量組、SWT高劑量組和二甲雙胍組大鼠血清T水平及LH/FSH比值顯著降低(P<0.05)；SWT低劑量組、SWT高劑量組大鼠血清E2水平顯著升高(P<0.05)；SWT高劑量組大鼠血清FSH水平顯著升高、LH水平顯著降低(P<0.05)。見圖3。

1為模型組，2為對照組，3為SWT低劑量組，4為SWT高劑量組，5為二甲雙胍組。與對照組比較▲P<0.05，與模型組比較*P<0.05圖3 各組大鼠血清激素水平比較

3 討論

隨著現(xiàn)代人類社會生活方式、飲食習(xí)慣的改變，PCOS發(fā)病率呈逐年升高趨勢。PCOS的發(fā)病原因仍未明確，但現(xiàn)階段的研究認(rèn)為，該病的發(fā)生是由遺傳層面的基因改變和后天環(huán)境包括飲食、運(yùn)動、情緒等諸多因素共同決定。PCOS患者多因月經(jīng)紊亂、不孕或者面部痤瘡等原因前來就診，臨床上多將生活方式干預(yù)作為PCOS的治療首選。對生活方式干預(yù)效果不理想或有其他治療要求的患者，給予相應(yīng)藥物治療，例如雌孕激素人工周期替代自然周期調(diào)理月經(jīng)和排卵、避孕藥或者螺內(nèi)酯抗雄激素治療面部痤瘡、來曲唑或克羅米芬調(diào)節(jié)性腺軸功能誘導(dǎo)排卵治療不孕癥。上述治療方法療效均較為顯著，但治療效果持續(xù)時間較短，通常影響單個或幾個月經(jīng)周期，長期療效較為欠缺。因此，尋找有效的替代或補(bǔ)充療法，成為當(dāng)前該病臨床和基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。

傳統(tǒng)中醫(yī)未有相應(yīng)病名記載，依據(jù)其臨床表現(xiàn)可將其歸為“閉經(jīng)”“經(jīng)少”“不孕”等。結(jié)合中醫(yī)理論，現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為，PCOS的病位在肝脾腎三臟，主要病機(jī)包括氣滯氣虛、血虛血瘀等。SWT最早記載于唐代《仙授理傷續(xù)斷秘方》，于宋代《太平惠民和劑局方》中被首次記載應(yīng)用于婦科疾病。經(jīng)過長期的臨床應(yīng)用，被后世醫(yī)家稱為“婦科第一方”“調(diào)理一切血證是其所長”，表明SWT在調(diào)理女性月經(jīng)紊亂相關(guān)疾病領(lǐng)域具有十分重要的作用。SWT全方由當(dāng)歸、熟地黃、白芍、川芎4味中藥組成，補(bǔ)肝脾之血虛、化肝脾之瘀血，婦女月經(jīng)量少、經(jīng)閉皆可用之。PCOS患者凝血功能、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)均高于正常人群[10-11]；基礎(chǔ)研究[12]表明，SWT具有類雌激素樣、抗氧化、抗凝血、修復(fù)肝損傷等作用；臨床研究[13]結(jié)果也顯示，SWT加減可調(diào)理PCOS患者月經(jīng)周期，提高患者排卵率和懷孕率?；诖耍菊n題組設(shè)計了相關(guān)實(shí)驗，希望初步探明SWT治療PCOS的起效機(jī)制和作用方式。

排卵障礙是PCOS患者的常見特點(diǎn)，也是大多數(shù)患者月經(jīng)不調(diào)、不孕癥等的來源。通過觀察，我們發(fā)現(xiàn)來曲唑誘導(dǎo)的PCOS模型大鼠出現(xiàn)了動情周期的顯著改變，其出現(xiàn)與人類排卵期相對應(yīng)的動情期時間顯著減少，表明大鼠排卵功能受損。通過藥物干預(yù)治療，我們發(fā)現(xiàn)SWT低劑量組、SWT高劑量組和二甲雙胍組3個治療組均能有效改善大鼠動情周期結(jié)構(gòu)；與模型組大鼠相比，可顯著增加動情期的出現(xiàn)時間，減少動情間期時間；其中，SWT高劑量組大鼠動情期增加最為明顯。表明高低劑量SWT、二甲雙胍均能有效改善PCOS大鼠排卵功能，且高劑量SWT效果最優(yōu)。

卵巢的形態(tài)學(xué)改變是PCOS患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，表明患者的卵巢功能出現(xiàn)異常。通過HE染色，我們觀察到PCOS模型大鼠卵巢出現(xiàn)了與臨床相類似的多囊樣改變，表現(xiàn)為囊腫數(shù)量增加、黃體數(shù)量顯著降低。治療干預(yù)后，與模型組對比，SWT低劑量組和SWT高劑量組2組大鼠卵巢囊腫數(shù)量降低、黃體數(shù)量顯著升高，而作為陽性對照的二甲雙胍組大鼠雖然同樣表現(xiàn)出卵巢囊腫數(shù)量降低，黃體數(shù)量卻沒有統(tǒng)計學(xué)差異；這與動情周期的統(tǒng)計結(jié)果是相符合的，高低劑量SWT能有效改善PCOS大鼠卵巢形態(tài)，一定程度地恢復(fù)其卵巢功能。

PCOS患者血清性激素、促性腺激素水平往往異于正常人群，表現(xiàn)為T濃度、LH/FSH比值的異常增高，不僅會直接抑制卵泡的發(fā)育和成熟，引起上述排卵功能障礙和卵巢形態(tài)功能改變，高雄激素還會誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)胰島素抵抗、慢性炎癥狀態(tài)、氧化應(yīng)激的異常激活等多種代謝功能異常，導(dǎo)致整體功能穩(wěn)態(tài)破壞和局部組織損傷。而雌激素水平的降低，表明其主要分泌來源的卵巢顆粒細(xì)胞功能受損，影響子宮內(nèi)膜的發(fā)育和著床時的容受性。實(shí)驗結(jié)果顯示，與正常對照大鼠相比，PCOS模型大鼠血清T、LH濃度顯著升高，E2、FSH濃度顯著降低，且LH/FSH升高，表明PCOS大鼠出現(xiàn)了與臨床患者相類似的血清激素水平變化。藥物治療后，3組大鼠的血清T濃度、LH/FSH比值均顯著降低；SWT低劑量組和SWT高劑量組大鼠血清E2濃度顯著升高，有且僅有SWT高劑量組大鼠表現(xiàn)出FSH濃度升高、LH濃度降低。上述結(jié)果表明，高低劑量SWT和二甲雙胍均能在一定程度上糾正PCOS大鼠血清激素水平的異常變化，且SWT的效果明顯優(yōu)于二甲雙胍。

綜上，SWT可通過糾正PCOS大鼠血清激素水平，一定程度上恢復(fù)下丘腦-垂體-卵巢性腺軸功能，改善卵巢排卵功能。本次實(shí)驗初步探討了SWT治療PCOS的起效機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用和更深層次的機(jī)制研究提供了一定參考依據(jù)。