高效液相色譜波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定歸芍調(diào)經(jīng)片中9種成分的含量

黃林杰，林華（.梧州市食品藥品檢驗(yàn)所生測(cè)室，廣西 梧州 54300；.柳州市食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 柳州 545000）

歸芍調(diào)經(jīng)片由柴胡、白芍、白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、川芎、澤瀉等7 味中藥制成的中藥復(fù)方制劑，具有疏肝理脾、調(diào)經(jīng)止帶功效，用于肝郁脾虛證、月經(jīng)不調(diào)、小腹疼痛、帶下色黃量多[1]。方中柴胡具有疏散退熱、疏肝解郁和升舉陽(yáng)氣等功效，柴胡中含有五環(huán)三萜類皂苷100 多種，其中柴胡皂苷a、d 含量較高[2-3]，且柴胡皂苷a 活性較強(qiáng)[4]。白芍具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽(yáng)的功效[5]，白芍總苷是其有效部位，其中以芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為特征性成分[6-7]。白術(shù)具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎功效，其主要藥效成分為揮發(fā)性成分、多糖類、內(nèi)酯類、黃酮類、苷類等，其中內(nèi)酯類成分對(duì)腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用[8-9]。茯苓具有利水滲濕、健脾寧心之效，主要有效成分為茯苓三萜及茯苓多糖等，其中茯苓酸是主要的三萜酸[10]。澤瀉具有利水滲濕、泄熱、化濁降脂等功效，三萜類是其主要成分，其中23-乙酰澤瀉醇B 為主要活性成分[11]。歸芍調(diào)經(jīng)片的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅把白芍中的芍藥苷作為指標(biāo)成分，然而單一的指標(biāo)質(zhì)量控制難以體現(xiàn)中藥復(fù)方制劑中多成分、多效應(yīng)、多靶點(diǎn)的整體作用，不能全面反映制劑的質(zhì)量。本研究結(jié)合參考文獻(xiàn)[12-19]，首次采用HPLC 波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定歸芍調(diào)經(jīng)片中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柴胡皂苷d、柴胡皂苷a、23-乙酰澤瀉醇B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的含量，為該品種的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

UltiMate3000 高效液相色譜儀，包括HPG-3400SD 二元泵、WPS-3000TSL自動(dòng)進(jìn)樣器、TCC-3000RS 柱溫箱、DAD-3000 二極管陣列檢測(cè)器、Chromeleon 7 色譜工作站（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公 司）；ABS-135S 型電子天平（d＝0.01 mg）、MS205DU 型電子天平（d＝0.001 mg）（瑞士梅特勒公司）；FP240 型鼓風(fēng)干燥箱（德國(guó)Binder 公司）；DAT-27 超聲波清洗機(jī)[鼎泰（湖北）生化科技設(shè)備制造有限公司]。

1.2 試藥

芍藥苷（批號(hào)：110736-201842，純度：97.4%）、柴胡皂苷a（批號(hào)：110777-201711，純度：91.1%）、柴胡皂苷d（批號(hào)：110778-201711，純度：95.8%）、23-乙酰澤瀉醇B（批號(hào)：111846-201705，純度：99.7%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)：111978-201501，純度：99.9%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)：111975-201501，純度：99.9%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號(hào)：111976-201501，純度：99.9%）對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院），芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)：170624）和茯苓酸（批號(hào)：160907）對(duì)照品（純度≥98%，成都普菲德生物技術(shù)有限公司）。歸芍調(diào)經(jīng)片[華潤(rùn)三九（郴州）制藥有限公司，規(guī)格：0.22 g/片，批號(hào)：18040360、18110970、19010920]；甲醇、乙腈均為色譜純（德國(guó)默克），其他試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters XBridge-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0 ～10 min，17%A；10 ～15 min，17%→45%A；15 ～18 min，45%→65%A；18 ～25 min，65%A；25 ～33 min，65%→83%A；33 ～40 min，83%→50%A；40 ～45 min，50%→17%A；45 ～50 min，17%A）；流速：0.8 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)：0 ～10 min 232 nm（芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷）；10 ～22 min 208 nm（柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 和23-乙酰澤瀉醇B）、22 ～32 min 220 nm（白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和茯苓酸）、32 ～50 min 278 nm（白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品適量，加甲醇使溶解，配制成每1 mL 含芍藥內(nèi)酯苷1.522 mg、芍藥苷4.401 mg、柴胡皂苷a 0.252 mg、柴胡皂苷d 0.101 mg、23-乙酰澤瀉醇B 0.026 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ0.804 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ0.752 mg、茯苓酸1.018 mg、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ0.558 mg 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置同一25 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，室溫避光保存，備用。

2.2.2 供試品溶液 取本品20 片，除去包衣，研細(xì)，精密稱取本品細(xì)粉0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，室溫超聲處理（功率：700 W，頻率：40 kHz）30 min后，取出放冷，稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液，用0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法分別制備缺白芍、缺柴胡、缺澤瀉、缺白術(shù)、缺茯苓的陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果各待測(cè)成分與前后峰分離度均大于1.5，對(duì)稱因子在0.95 ～1.22，各測(cè)定成分理論塔板數(shù)均大于5000。陰性樣品溶液色譜圖中在與樣品中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、23-乙酰澤瀉醇B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ保留時(shí)間相應(yīng)位置上未見(jiàn)色譜峰，說(shuō)明其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，專屬性較好。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 歸芍調(diào)經(jīng)片高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of Guishao Tiaojing tablet

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 置于同一25 mL 量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液，精密吸取上述系列混合對(duì)照品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg·mL－1），峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明9 種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（見(jiàn)表1）。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 1 Linear range investigation

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柴胡皂苷d、柴胡皂苷a、23-乙酰澤瀉醇B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ峰面積的RSD分 別 為0.76%、0.23%、0.85%、0.67%、0.71%、0.64%、0.48%、0.39%、0.87%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號(hào)：18040360），分別于制備后0、4、6、12、24、48 h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、23-乙酰澤瀉醇B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ峰面積的RSD分別為0.31%、0.22%、0.78%、0.83%、0.69%、0.46%、0.53%、0.45%、0.74%（n＝6），表明供試品溶液48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批供試品（批號(hào)：18040360），除去包衣后的細(xì)粉，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6 份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、23-乙酰澤瀉醇B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ含量的平均值分別為6.17、17.63、1.05、0.38、0.15、3.20、3.01、4.16、2.24 mg·g－1，RSD分別為0.42%、0.15%、0.53%、0.57%、0.74%、0.69%、0.79%、0.63%、0.94%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的歸芍調(diào)經(jīng)片（批號(hào)：18040360）細(xì)粉，精密稱取0.25 g，置于50 mL 棕色量瓶中，共6 份，分別加入“2.2.1”項(xiàng)下各對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算各成分加樣回收率及其RSD值，平均加樣回收率分別為97.1%、99.7%、97.4%、98.0%、96.6%、101.0%、98.5%、98.6%、95.5%，RSD（n＝6）分別為0.5%、0.6%、1.5%、0.8%、1.1%、0.8%、0.7%、0.4%、1.0%。

2.9 樣品含量測(cè)定

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 歸芍調(diào)經(jīng)片中9 種成分含量的結(jié)果(n ＝3，mg·g－1)Tab 2 Determination of 9 components in Guishao Tiaojing tablets (n ＝3，mg·g－1)

3 討論

3.1 提取條件的選擇

分別考察了乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇作為提取溶劑，結(jié)果以70%甲醇溶液提取時(shí)，所測(cè)各成分的提取率相對(duì)較高，故選擇70%甲醇作為提取溶劑；分別對(duì)供試品溶液采用超聲提取、加熱回流提取、索氏提取相同的時(shí)間，結(jié)果超聲提取和索氏提取效果相當(dāng)，綜合考慮提取方法的穩(wěn)定性及簡(jiǎn)便性，最終選擇超聲提??；分別比較了超聲提取15、30、45 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取45 min 時(shí)，柴胡皂苷a的含量相對(duì)于30 min 時(shí)下降，可能與柴胡皂苷a化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定易降解有關(guān)，通過(guò)比較確定超聲時(shí)間為30 min。

3.2 流動(dòng)相的選擇

在流動(dòng)相的選擇上，分別考察了乙腈-水、乙腈-磷酸溶液（0.1%和0.05%）系統(tǒng)，結(jié)果以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ分離效果最佳，干擾少。而茯苓酸的峰形較寬，有拖尾現(xiàn)象；以乙腈-磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷能較好地分離，茯苓酸的峰形較佳，無(wú)拖尾現(xiàn)象，基線較平穩(wěn)，綜合考慮各因素選擇乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相，通過(guò)梯度洗脫，所測(cè)各成分都能很好地分離，且基線比較平穩(wěn)，對(duì)稱因子在0.95 ～1.22。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用DAD 檢測(cè)器對(duì)9 個(gè)活性成分在190 ～400 nm 波長(zhǎng)段光譜掃描，結(jié)果顯示，芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷在232 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 在210 nm 處有末端吸收，23-乙酰澤瀉醇B 在208 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在222 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ在278 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，茯苓酸在210 波長(zhǎng)處有最大吸收，由于過(guò)于頻繁的切換波長(zhǎng)，基線會(huì)有一定幅度的漂移，造成基線不穩(wěn)定，所以最終選擇在232 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷，在208 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 和23-乙酰澤瀉醇B，在220 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和茯苓酸，在278 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。

3.4 小結(jié)

本研究建立了測(cè)定歸芍調(diào)經(jīng)片中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、23-乙酰澤瀉醇B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ9 種成分的HPLC 分析方法，此方法簡(jiǎn)單、有效、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高，可為歸芍調(diào)經(jīng)片的質(zhì)量控制和進(jìn)一步的研究提供參考依據(jù)。