干旱耐受型和敏感型玉米應答干旱的比較轉(zhuǎn)錄組學分析

劉春妮，宋明桂，陳思遠，邱志旭，馬 闖

(西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院 生物信息學中心，農(nóng)業(yè)部西北旱區(qū)玉米生物學與遺傳育種重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

作為固著生物，植物的生長與發(fā)育常需要應對干旱、澇漬、冷害、寒害、干熱風等不良環(huán)境脅迫。干旱是影響植物地理分布、農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要環(huán)境因子之一[1]。玉米是一種主要的農(nóng)作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)常受到干旱的影響。玉米在生長中期遭遇干旱，易造成花期不遇，結(jié)實率降低；在灌漿期遭遇干旱，會使籽粒發(fā)育受到抑制，籽粒體積變小，籽粒中蛋白質(zhì)、脂肪酸、淀粉等成分的含量發(fā)生改變[2]。研究玉米響應干旱脅迫的分子機制有助于開拓人們對自然的認識，為創(chuàng)制抗旱耐旱玉米新品種提供理論指導和知識儲備。

轉(zhuǎn)錄組測序(RNA sequencing,RNA-Seq)是近年來快速發(fā)展的一項高通量測序技術(shù)，一次實驗可獲得數(shù)以百萬計的序列片段以及所有基因和轉(zhuǎn)錄本的表達水平，已成為解析植物應答干旱、冷害等各類環(huán)境脅迫的分子機制的重要技術(shù)手段[3-16]。利用干旱敏感型玉米自交系B73為材料，在正常和干旱條件下對不同時期的玉米組織進行轉(zhuǎn)錄組測序， Kakumanu等[13]發(fā)現(xiàn)，玉米子房部位分生組織較葉有更多的基因應答干旱脅迫；Thatcher等[14]發(fā)現(xiàn)選擇性剪接(alternative splicing)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)換(transcriptional switch,TS)事件是玉米響應干旱脅迫的一種重要方式。利用豐富的干旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)，Miao等[15]構(gòu)建了一個B73玉米干旱應答基因的共表達網(wǎng)絡(luò)，并鑒定出與干旱響應密切相關(guān)的基因網(wǎng)絡(luò)模塊。這些以干旱敏感型B73玉米自交系為材料的轉(zhuǎn)錄組學研究，為理解玉米應答干旱的分子機制提供了重要信息。近年來，在高粱等物種上的研究表明，干旱敏感型和耐受型兩種基因型的組學數(shù)據(jù)比較可為干旱應答機制的研究提供更多的信息[16]。在玉米中，干旱脅迫條件下對兩個亞熱帶基因型的幼苗進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)耐旱基因型HKI1532中表達受干旱顯著影響的基因數(shù)目(1 708)明顯多于干旱敏感基因型HKI1532(1 291)[17]。以干旱耐受型Ye8112和敏感型Mo17玉米自交系為研究對象，通過轉(zhuǎn)錄組學比較分析找到多個響應干旱的候選基因和代謝通路(植物激素信號轉(zhuǎn)導、氨基酸的生物合成和氮代謝等)[18]。Han21是我國科學家選育出的一個干旱耐受型玉米自交系，在苗期表現(xiàn)出較強的耐旱性[19]。在干旱脅迫下，Han21受影響的N6A RNA甲基化區(qū)域較B73更多，Han21的根系發(fā)育較B73更加健壯[20]。Jin等[21]利用基因芯片技術(shù)開展了干旱耐受型玉米Han21和干旱敏感型玉米Y478應答干旱的轉(zhuǎn)錄組學比較分析，但研究對象僅局限于17 555個探針對應的約14 850個轉(zhuǎn)錄本。隨著玉米參考基因組序列質(zhì)量的不斷提高以及基因注釋能力的不斷提升，數(shù)萬條以前遺漏的轉(zhuǎn)錄本得以重新注釋[22]。截至2020年2月底，國際知名植物基因組數(shù)據(jù)庫Ensembl Plants(https://plants.ensembl.org)[23]已注釋出39 498個可編碼蛋白質(zhì)的玉米基因以及對應的131 496個轉(zhuǎn)錄本。更加完善的基因注釋信息為同時在基因和轉(zhuǎn)錄本層面深入挖掘干旱耐受型和敏感性玉米自交系響應干旱的轉(zhuǎn)錄組差異提供可能。

本研究利用RNA-Seq技術(shù)刻畫出干旱敏感型(B73)和耐受型(Han21)玉米自交系在正常和干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組圖譜，利用生物信息學方法對來自B73和Han21的轉(zhuǎn)錄組進行比較分析，鑒定出一批差異表達基因以及轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)換事件，并進一步富集分析了差異表達基因的功能，為理解玉米應答干旱脅迫的分子機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

玉米B73和Han21種子，由本實驗室在西北農(nóng)林科技大學曹新莊試驗農(nóng)場繁種獲得。

1.2 試驗材料的制備

玉米B73和Han21種子發(fā)芽后，種植于對照條件(白天28 ℃/夜間26 ℃，光照16 h/黑暗8 h，田間持水量80%)和干旱處理(白天28 ℃/夜間26 ℃，光照16 h/黑暗8 h，田間持水量40%)的人工培養(yǎng)箱中。14 d后，取葉片樣本(每個處理各3個生物學重復)迅速放至-80 ℃液氮保存。

1.3 cDNA文庫的獲得

利用RNAiso Plus提取玉米葉片樣本完整RNA。用帶有Oligo(dT)的磁珠通過A-T堿基互補配對與mRNA的ployA尾結(jié)合的方式富集mRNA。隨后以mRNA為模板，利用六堿基隨機引物(random hexamers)、緩沖液、dNTPs和DNA polymerase Ⅰ合成cDNA，并利用 AMPure XP beads進行純化。最后經(jīng)PCR富集得到cDNA文庫。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序與預處理

文庫構(gòu)建完成后，利用Illumina HiSeq平臺(美國圣地亞哥Illumina公司)測序并產(chǎn)生2×122 bp的初始數(shù)據(jù)(raw reads)。利用FastQC (version 0.11.4)[24]檢測RNA-Seq初始數(shù)據(jù)的質(zhì)量。利用Trimmomatic (version 0.33)[25]去除低質(zhì)量reads和測序接頭，高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)通過HISAT2 (version 2.1.0)[26]比對至玉米B73參考基因組序列(APGv4)上。比對參數(shù)為“--min-intronlen 20-max-intronlen 10000-k 20-p 3”，比對結(jié)果以BAM文件輸出。從BAM文件中提取能夠唯一比對到玉米參考基因組的reads(uniquely mapped reads)信息進行后續(xù)分析。玉米B73參考基因組序列(APGv4)及其對應的基因注釋信息(APGv4.38)從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫[23](ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-38/gff3/zea_mays/Zea_mays.AGPv4.38.gff3.gz)下載。玉米轉(zhuǎn)錄因子的注釋信息從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn)[27]下載得到。

1.5 基因和轉(zhuǎn)錄本的表達估計

將提取出唯一比對的reads數(shù)據(jù)輸入StringTie (version 1.3.4d)[28]，計算每組樣品中基因和轉(zhuǎn)錄本的表達水平TPM(transcripts per kilobase million)值。

1.6 差異表達分析

對于給定的一組樣品，利用featureCounts (version 2.0.0)[29]計算樣品中每條蛋白編碼基因的reads數(shù)量。將reads數(shù)量輸入edgeR (version 3.7)[30]鑒定差異表達基因。本研究利用單因素差異表達分析策略(即B73-DS-B73-WW，Han21-DS-Han21-WW)分別鑒定B73、Han21玉米自交系苗期干旱脅迫下的差異表達基因，利用雙因素差異表達分析策略(即(Han21-DS-Han21-WW)-(B73-DS-B73-WW))同時考慮不同玉米品系(B73和Han21)、不同試驗條件(對照(WW)和干旱(DS))下的差異表達基因。差異表達基因的確定需滿足以下兩個標準：不同樣本中歸一化的測序數(shù)目的變化倍數(shù)≥2(fold change≥2)；經(jīng)FDR(false discovery rate，錯誤校驗率)校正的P值≤0.05 (FDR-adjustedP-value≤0.05)。

1.7 基因功能富集分析

利用R包topGO[31]進行基因功能(gene ontology,GO)富集分析。topGO自動從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫中獲取玉米B73參考基因組中所有注釋基因的功能注釋信息，然后利用費舍爾精確檢驗方法(Fisher’s exact test)檢查每個GO術(shù)語(GO term)中基因的富集程度，并計算出對應的統(tǒng)計顯著性水平(P-value)。以P-value≤0.05及包含基因的數(shù)目大于3為標準選擇基因功能顯著富集的GO術(shù)語。

1.8 轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)換事件的鑒定

轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)換(transcriptional switch,TS)是指在不同試驗條件下，來自同一條基因的兩條轉(zhuǎn)錄本的相對表達地位發(fā)生轉(zhuǎn)換。將對照(WW)和干旱(DS)條件下的轉(zhuǎn)錄本表達豐度TPM值輸入deepTS[32]，利用其中的“Pairwise transcriptome comparison”功能模塊及默認參數(shù),鑒定B73在正常和干旱脅迫、Han21在正常和干旱脅迫、正常條件下B73和Han21、干旱脅迫下B73和Han21發(fā)生的TS事件。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米自交系苗期干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組整體分析

在對照(WW)和干旱(DS)條件下，Han21和B73玉米自交系在苗期的葉片樣本，經(jīng)過RNA-Seq測序之后，得到初始reads。這些reads經(jīng)過FastQC和Trimmomatic質(zhì)控之后，每個樣本最終獲得4千萬～6千萬條高質(zhì)量reads(表 1)。將過濾后的RNA-Seq數(shù)據(jù)分別與玉米B73參考基因組序列進行比對，來自B73自交系的樣本數(shù)據(jù)的整體比對率為96.47%～97.13%，其中能與參考基因組序列唯一比對的reads比例為92.31%～93.86%；來自Han21自交系的樣本數(shù)據(jù)的整體比對率相對降低，為86.66%～87.89%，其中能與參考基因組序列唯一比對的reads比例為83.66%～84.77%(表 1)。后續(xù)分析均使用唯一比對到基因組的reads。

表1 12組RNA-Seq數(shù)據(jù)比對信息Table 1 Mapping information of 12 sets of RNA-Seq

Spearman相關(guān)性分析基因的表達值顯示每種條件下3個生物學重復樣本間的相關(guān)系數(shù)較高(0.95～0.97)，而樣本間的相關(guān)系數(shù)相對較低(0.90～0.96)。從整體上看，B73和Han21在WW和DS條件下基因表達的分布略有差異(圖1-A)。具體到表達基因的數(shù)目，干旱導致B73和Han21幼苗葉片組織中基因表達數(shù)目的增加。B73玉米自交系在WW和DS條件下分別有20 450和21 775條基因表達(TPM≥1)；Han21玉米自交系在WW和DS條件下分別有21 858和21 980條基因表達(圖1-B)。此外，每種條件下都存在一定數(shù)目(94～623)的條件特異表達的基因。

圖1 正常和干旱條件下Han21和B73玉米自交系苗期的轉(zhuǎn)錄組整體分析Fig.1 Transcriptome analysis of Han21 and B73 maize inbred lines at seedling stage under WW and DS conditions

從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫共下載得到2 708個玉米轉(zhuǎn)錄因子，涉及到125個轉(zhuǎn)錄因子家族，其中105個家族的轉(zhuǎn)錄因子在至少一個試驗條件下有表達(TPM ≥ 1)。在表達的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目方面，有57個轉(zhuǎn)錄因子家族在B73、Han21玉米自交系的WW和DS條件下存在表達基因數(shù)的差異(圖1-C)。以AP2轉(zhuǎn)錄因子家族為例，B73玉米自交系在WW和DS條件下表達的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目分別為77和97個，Han21玉米自交系在WW和DS條件下表達的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目分別為92和94個。

2.2 玉米自交系苗期干旱脅迫下的單因素差異表達

兩種玉米自交系(B73、Han21)在WW和DS條件下基因的差異表達情況見表2。

表2 B73、Han21自交系在WW和DS條件下基因的差異表達Table 2 Differential expression analysis of B73 and Han21 inbred lines under WW and DS conditions

受到干旱脅迫后，干旱敏感型玉米自交系B73中有917個基因表達水平發(fā)生顯著變化，其中表達量顯著上調(diào)的基因有798個，表達量顯著下調(diào)的有119個；干旱耐受型玉米自交系Han21中有2 832個基因表達水平發(fā)生顯著變化，其中表達量顯著上調(diào)的基因有1 556個，表達量顯著下調(diào)的有1 276個(表2)。

分析發(fā)現(xiàn),285條基因同時在B73和Han21中被鑒定為差異表達基因。GO富集分析的結(jié)果(表2)表明，這285條差異表達基因主要富集在類黃酮的合成和代謝(GO:0009813，flavonoid biosynthetic process；GO:0009812，flavonoid metabolic process)、應激響應(GO:0009628，response to chemical；GO:0009628，response to abiotic stimulus)、氧化還原過程(GO:0055114，oxidation-reduction process)等生物學過程。B73特異的632條差異表達基因主要富集在系統(tǒng)獲得抗性(GO:0009627，systemic acquired resistance)、細胞壁代謝過程(GO:0044036，cell wall macromolecule metabolic process；GO:0042546，cell wall biogenesis；GO:0010383，cell wall polysaccharide metabolic process；GO:0070592，cell wall polysaccharide biosynthetic process等)、應激響應(GO:0042221，response to chemical；GO:0009719，response to endogenous stimulus)等生物學過程中。Han21特異的2 547條差異表達基因主要富集在光合作用(GO:0015979，photosynthesis；GO:0009768，photosynthesis,light harvesting in photosystem I；GO:0009765，photosynthesis,light harvesting；GO:0019684，photosynthesis,light reaction等)、非生物刺激響應(GO:0009628，response to abiotic stimulus；GO:0009416，response to light stimulus等)、碳水化合物代謝過程(GO:0016052，carbohydrate catabolic process；GO:0005975，carbohydrate metabolic process)等生物學過程。

對于轉(zhuǎn)錄因子，B73和Han21自交系幼苗受到干旱脅迫后，分別有80和214條轉(zhuǎn)錄因子基因在表達水平上發(fā)生了顯著差異。轉(zhuǎn)錄因子家族富集分析顯示，B73中主要是MYB、ARF和Aux/IAA家族的轉(zhuǎn)錄因子表達發(fā)生顯著差異(圖2-A)，而Han21中主要是LIM和Trihelix家族的轉(zhuǎn)錄因子表達發(fā)生顯著差異(圖2-B)。受到干旱脅迫時，有20個轉(zhuǎn)錄因子的表達水平同時在B73和Han21中發(fā)生顯著變化，其中8個轉(zhuǎn)錄因子在B73和Han21中的表達變化模式(上調(diào)或下調(diào))截然相反，包括3個MYB轉(zhuǎn)錄因子(Zm00001d030737、Zm00001d020457和Zm00001d052397)，2個Trihelix轉(zhuǎn)錄因子(Zm00001d054080和Zm00001d002801)(圖2-C)。

A.B73中富集的差異表達轉(zhuǎn)錄因子家族；B.Han21中富集的差異表達轉(zhuǎn)錄因子家族；C.受到干旱脅迫后在B73和Han21中的表達變化模式截然相反的8個差異表達轉(zhuǎn)錄因子A shows enriched family of differentially expressed transcription factors in B73;B shows enriched family of differentially expressed transcription factors in Han21;C shows opposite expression patterns of eight differentially expressed transcription factors in B73 and Han21圖2 B73和Han21自交系在WW與DS條件下的差異表達轉(zhuǎn)錄因子Fig.2 Statistical analysis of differentially expressed transcription factors in B73 and Han21 inbred lines under WW and DS conditions

2.3 玉米自交系苗期干旱脅迫下的雙因素差異表達

單因素差異表達分析分別考慮了兩種不同的玉米自交系響應干旱的基因表達情況。為了同時考慮干旱和品系因素對基因表達的影響，利用edgeR進行雙因素差異表達分析，鑒定出1 475條表達水平顯著差異的基因。GO富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異表達基因主要富集在細胞壁合成(GO:0042546，cell wall biogenesis；GO:0071554，cell wall organization or biogenesis；GO:0071555，cell wall organization；GO:0009832，plant-type cell wall biogenesis等)、碳水化合物合成代謝、多糖代謝(GO:0005975，carbohydrate metabolic process；GO:0005976，polysaccharide metabolic process)等生物學過程(圖3-A)。

A.B73和Han21玉米自交系中1 475條的差異表達基因GO富集結(jié)果；B.1 475條差異表達基因主要富集的脂肪酸延長通路；C.7條參與脂肪酸延長通路的表達模式；D.B73和Han21自交系受到干旱脅迫后發(fā)生差異表達的轉(zhuǎn)錄因子家族A shows the GO enrichment results of 1 475 differentially expressed genes in B73 and Han21 maize inbred lines under drought stress;B shows the fatty acid elongation pathway mainly enriched by 1 475 differentially expressed genes;C shows expression pattern of seven differentially expressed genes in involved in fatty acid elongation;D shows enriched families of transcription factors differentially expressed in B73 and Han21 inbred lines

利用KEGG進行代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這1 475條差異表達基因富集在脂肪酸延長(zma00062，fatty acid elongation)和苯丙素生物學合成(zma00940，phenylpropanoid biosynthesis)兩個代謝途徑中。在脂肪酸延長通路共有7條差異表達基因參與(圖3-B),其中在合成長鏈3-氧酰基-輔酶A(long-chain 3-oxoacyl-CoA)過程中有6條差異表達基因參與，包括5條3-酮乙基-輔酶A合成酶基因(Zm00001d027904[kcs13]；Zm00001d028241[kcs28]；Zm00001d028406[kcs11]；Zm00001-d051787；Zm00001d048061)、1條脂肪酸延長酶基因(Zm00001d046444(fae2))。相關(guān)研究表明，擬南芥中3-ketoacyl CoA合成酶基因kcs20在干旱脅迫下，其表達量上升[33]，基因kcs20在干旱脅迫條件下參與了角質(zhì)層蠟沉積的增加[34]。在合成長鏈3-羥烷基-輔酶A(long-chain 3-hydroxyacyl-CoA)過程中有基因Zm00001d017111(glossy8)參與,與B73自交系相比，受到干旱脅迫后該基因在Han21自交系的表達水平降低(圖3-C)。近期的研究表明，glossy家族基因glossy6的玉米突變體干旱耐受性較野生型降低[35]。

對于轉(zhuǎn)錄因子，這1 475條差異表達基因中包含143條轉(zhuǎn)錄因子基因。轉(zhuǎn)錄因子家族富集分析顯示，受到干旱脅迫后，B73和Han21自交系之間主要是OVATE、TCP、Trihelix、MYB、AP2、bHLH等14個家族的轉(zhuǎn)錄因子表達發(fā)生顯著差異(圖3-D)。其中，MYB家族中的部分轉(zhuǎn)錄因子已被報道與干旱應答相關(guān)，可調(diào)控氣孔移動，控制表皮蠟質(zhì)合成等過程[36]。受到干旱脅迫處理后，MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子基因Zm00001d018097(myb48)表達水平下調(diào)。Wang等[37]將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥，經(jīng)干旱處理后該基因在干旱脅迫響應中通過ABA信號傳遞，起正調(diào)控作用。

2.4 玉米自交系苗期干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)換

除了基因水平的表達值，RNA-Seq數(shù)據(jù)還可以用來計算轉(zhuǎn)錄本水平的表達值。在本研究所有的39 498個蛋白質(zhì)編碼基因中，14 855個被注釋為多轉(zhuǎn)錄本基因，其中5 147個基因至少有兩個轉(zhuǎn)錄本在4種試驗條件下表達，對這5 147個基因，利用deepTS檢測其在干旱脅迫時是否會發(fā)生TS事件，結(jié)果見圖4。圖4-A結(jié)果顯示，在B73和Han21玉米自交系中分別有404和480個基因發(fā)生了TS事件。在1 475個差異表達基因中，B73和Han21分別有28和36個基因發(fā)生了TS事件。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫時，部分基因在B73和Han21玉米自交系中均發(fā)生了TS事件，但是呈現(xiàn)出相反的轉(zhuǎn)換模式?？删幋aRemorin 家族蛋白的Zm00001d020708基因是其中的一個代表。已有研究報道，植物特有Remorin家族蛋白在響應生物和非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用[38]。Zm00001d020708的兩條轉(zhuǎn)錄本Zm00001d020708_T002和Zm00001d020708_T009在遭遇干旱脅迫后，在B73和Han21玉米自交系中都發(fā)生了TS事件(圖4-B)。正常條件下，Zm00001d020708_T002在B73玉米自交系中是主要表達的轉(zhuǎn)錄本，其表達量與Zm00001d020708基因表達量的相對表達豐度(relative abundance)在受到干旱脅迫后從0.55下降到0.13，而轉(zhuǎn)錄本Zm00001d020708_T009基因表達量的相對表達豐度則從0.09上升到0.40，成為該基因主要表達的轉(zhuǎn)錄本。在Han21中，Zm00001d020708的變化趨勢則相反，正常條件下Zm00001d020708_T009是主要轉(zhuǎn)錄本，干旱脅迫后其相對表達豐度從0.51下降到0.13，而Zm00001d020708_T002的相對表達豐度則從0.04上升到0.52，成為Zm00001d020708的主要轉(zhuǎn)錄本。除了Zm00001d020708，還有70個基因在B73和Han21玉米自交系中發(fā)生了TS事件，但只有18個基因在兩個自交系中發(fā)生的TS具有相同的模式，表明TS的轉(zhuǎn)換模式存在品系的特異性。

除了TS的轉(zhuǎn)換模式，TS事件本身也存在品系的特異性。編碼EXORDIUM-like 5蛋白質(zhì)的基因Zm00001d029783在受到干旱脅迫后，其轉(zhuǎn)錄本Zm00001d029783_T003和Zm00001d029783_T004也發(fā)生了TS事件，且只發(fā)生在Han21中(圖 4-C)。Han21自交系受到干旱脅迫后，Zm00001d029783_T003相對Zm00001d029783的表達豐度從正常條件下的0.19上升到0.80，從而變成Zm00001d029783的主要表達轉(zhuǎn)錄本，而Zm00001d029783_T004的相對表達豐度則從0.74下降到0.20。在B73自交系中，Zm00001d029783_T004在正常和干旱條件下始終是主要表達轉(zhuǎn)錄本，其相對表達豐度一直維持在0.64左右， Zm00001d029783_T003的相對表達豐度始終維持在0.20左右。進一步研究Zm00001d029783_T003與Zm00001d029783_T004的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩條轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)有明顯差異，Zm00001d029783_T003有5個外顯子，Zm00001d029783_T004有4個外顯子，且兩條轉(zhuǎn)錄本只有一個外顯子的區(qū)域完全相同。比較兩條轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)，Zm00001d029783_P003較Zm00001d029783_P004多一個DPBB_1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。已有研究表明Expansins在細胞壁合成中發(fā)揮一定作用，其不僅會影響植物的生長發(fā)育，與植物應答非生物脅迫等也有關(guān)，而DPBB_1結(jié)構(gòu)域?qū)xpansins蛋白功能的發(fā)揮至關(guān)重要[39-40]。

A.TS基因與1 475個差異表達基因的重疊情況；B、C.B73和Han21自交系中2個特異性TS事件及發(fā)生TS的轉(zhuǎn)錄本與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)A shows the overlapped genes between TS genes and 1 475 differentially expressed genes;B and C show the specific TS events in B73 and Han21 inbred lines,and the transcript and protein structures of the two TS events圖4 B73和Han21玉米自交系在WW與DS條件下的TS分析Fig.4 TS analysis of B73 and Han21 maize inbred lines under WW and DS conditions

3 討 論

本研究基于高質(zhì)量的玉米參考基因組序列和注釋數(shù)據(jù)，利用RNA-Seq技術(shù)刻畫出干旱脅迫下干旱敏感型和耐受型玉米自交系幼苗期葉片中的轉(zhuǎn)錄組圖譜，利用生物信息學方法探究了兩種玉米自交系應答干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)掘出在表達層面顯著應答干旱脅迫的基因，富集出差異表達基因的生物學功能以及通路信息，鑒定出一批干旱脅迫誘導的轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)換事件，為揭示玉米應答干旱的分子機制提供了理論基礎(chǔ)。

3.1 干旱脅迫下玉米B73和Han21自交系的轉(zhuǎn)錄組特點

在全部基因背景下，干旱脅迫下干旱耐受型玉米自交系Han21在基因的表達水平、基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達數(shù)目等方面與干旱敏感型玉米自交系B73相差不大。但是在差異表達基因背景下，Han21中差異表達的基因數(shù)目(2 832)明顯多于B73(917)。這種干旱耐受型玉米自交系有更多基因發(fā)生差異表達以響應干旱脅迫的現(xiàn)象與Thirunavukkarasu等[17]報道的一致。B73中的差異表達基因主要參與系統(tǒng)獲得抗性、細胞壁代謝過程和應激響應等生物學過程，而Han21中的差異表達基因主要富集在光合作用、非生物刺激響應和碳水化合物代謝過程等生物學過程。Han21和B73中差異表達基因富集功能的差異，表明不同耐旱能力的玉米應答干旱的分子機制不同，也意味著僅使用一種自交系材料(如B73)開展玉米響應干旱脅迫分子機制的研究存在明顯不足。今后，有必要利用RNA-Seq技術(shù)對不同耐旱能力的玉米進行大規(guī)模測序，進而全面地刻畫玉米響應干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄組圖譜。

3.2 比較轉(zhuǎn)錄組分析識別可能與耐旱相關(guān)的候選功能基因

研究表明，包括細胞壁在內(nèi)的植物組織參與植物對干旱等非生物脅迫的應答，由這些組織發(fā)出的脅迫響應信號可通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達水平以維持細胞穩(wěn)態(tài)[1]。本研究利用雙因子分析策略，對干旱脅迫下B73和Han21玉米自交系進行轉(zhuǎn)錄組比較，鑒定出1 475條表達水平上表現(xiàn)出顯著差異的基因。GO富集分析表明，這些差異表達基因主要富集在細胞壁合成、碳水化合物合成代謝、多糖代謝等生物學過程。在鑒定出的差異表達基因中發(fā)現(xiàn)，包括Zm00001d024630 (myb92)在內(nèi)的58條基因與細胞壁合成(GO:0071554、GO:0042546、GO:0071555、GO:0009832、GO:0071669、GO:0009833、GO:0009834)有關(guān)。這一結(jié)果也得到了現(xiàn)有文獻的支持。Geng等[41]的研究結(jié)果表明，蘋果中MYB家族轉(zhuǎn)錄因子MdMYB88和MdMYB124可通過調(diào)節(jié)細胞壁來增強耐旱性。這一結(jié)果表明，在干旱脅迫下，不同玉米自交系材料的比較轉(zhuǎn)錄組分析有助于識別一批參與玉米耐旱響應的候選功能基因；同時，對這些候選功能基因的表達水平、生物學功能進行進一步分析，有助于理解玉米應答干旱脅迫的分子機制。

3.3 干旱脅迫下玉米基因發(fā)生的TS事件具有一定的品系特異性

通過選擇性剪接(AS)，同一個基因可以產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)錄本，不同轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白質(zhì)的差異極大地豐富了基因的功能，選擇性剪接方式的變化會引起不同轉(zhuǎn)錄本之間表達量發(fā)生相對變化，進而發(fā)生TS事件。Thatcher等[14]在全基因范圍內(nèi)研究可變剪接對玉米發(fā)育過程和干旱脅迫應答的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選擇性剪接引起的TS事件表現(xiàn)出很強的組織和發(fā)育時期特異性。本研究還發(fā)現(xiàn)，TS事件表現(xiàn)出較強的品系特異性。在干旱脅迫下，B73和Han21玉米自交系中檢測出有404和480個基因發(fā)生了TS事件，但只有71個基因在B73和Han21中都發(fā)生了TS事件。1 475個差異表達基因中，B73和Han21分別有28和36個基因發(fā)生了TS事件，其中15個基因在B73和Han21中的TS事件呈現(xiàn)出相反的轉(zhuǎn)換模式。TS事件的品系特異性與品系耐旱性是否相關(guān)，還有待進一步深入研究。另外，B73和Han21中的差異表達基因與TS基因重疊的比例分別有1.9%和2.4%，說明TS在響應脅迫的生物學過程中可能發(fā)揮一定的作用，提示在比較轉(zhuǎn)錄組分析過程中除了關(guān)注基因?qū)用娴牟町?，還應該重視轉(zhuǎn)錄本層面的變化。