泛素結(jié)合酶UBE2T基因在布魯氏菌感染過(guò)程中的作用

印雙紅，張俊波，易 萌，蔡春連，張 紅，王麗蓉，陸安法，陳創(chuàng)夫

(1 銅仁學(xué)院 a大健康學(xué)院，b 貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，c 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州 銅仁 554300；2 銅仁市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州 銅仁 554300；3 石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000)

布魯氏菌病是一種在全世界范圍內(nèi)廣泛分布的人畜共患傳染病[1]，家畜患病可引起生殖系統(tǒng)疾病，常引起流產(chǎn)、不孕、空懷等；人感染布魯氏菌后可引發(fā)關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、心肌膜炎等，表現(xiàn)為持續(xù)性感染。目前，人們對(duì)布魯氏菌的致病機(jī)制還不清楚。

泛素(ubiquitin,Ub)是一種蛋白質(zhì)，廣泛存在于真核細(xì)胞中，由76個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子質(zhì)量較小，而且氨基酸序列高度保守，從酵母細(xì)胞到人類只相差3個(gè)氨基酸[2]。泛素化修飾是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要形式，泛素化過(guò)程需要泛素激活酶(ubiquitin activation enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin conjugation enzyme，E2)和泛素連接酶(ubiquitin protein ligase，E3)3種酶的參與，其中泛素結(jié)合酶E2T(ubiquitin-conjugating enzyme e2t，UBE2T)是E2家族成員之一，其有一個(gè)16～18 ku的保守結(jié)構(gòu)域(泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，延伸序列在C末端，屬泛素家族中的第二類結(jié)合酶[3]。大量研究證明，細(xì)胞內(nèi)UBE2T表達(dá)增高在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，與乳腺癌[4]、肝癌[5]、骨髓癌[6]及肺癌[7]等的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

泛素蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-proteasomesystem，UPS)被有些病毒利用，參與病毒感染、增殖、釋放與免疫逃逸等各個(gè)階段[8-9]，例如羊口瘡病毒可利用某種機(jī)制干預(yù)UPS的信號(hào)調(diào)控途徑，有效抑制胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和CD8+T細(xì)胞活化，以庇護(hù)病毒粒子成熟和釋放[10]。

E2在胞內(nèi)菌李氏特菌的增殖中起著重要的調(diào)節(jié)作用[11]，本課題組前期研究表明，類泛素SUMO-1 影響胞內(nèi)布魯氏菌的增殖[12]，由于E2在類泛素SUMO-1修飾中發(fā)揮重要作用，因此筆者推測(cè)E2在布魯氏菌增殖過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。本研究以UBE2T為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行沉默和過(guò)表達(dá)，研究UBE2T在布魯氏菌感染過(guò)程中的作用，旨在為布魯氏菌的致病機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

胎牛血清和Opti-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，購(gòu)自GIBCO公司；酵母提取物和蛋白胨，購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；曲拉通X-100(TritonX-100)細(xì)胞裂解液、小鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)、白細(xì)胞介素18(IL-18)、γ-干擾素(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β) ELISA試劑盒，均購(gòu)自上海依科賽生物制品有限公司；SYBR Green Ⅰ熒光染料，購(gòu)于羅氏公司；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性檢測(cè)試劑盒和乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，購(gòu)于北納生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX、Lipofectamine 2000和總RNA提取試劑Trizol，購(gòu)自Invitrogen公司。

羊種布魯氏菌疫苗株M5-90，由新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；pLVX-puro載體和大腸桿菌DH5α，由梵凈山特色動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 UBE2T基因過(guò)表達(dá)RAW264.7細(xì)胞的構(gòu)建

1.2.1 過(guò)表達(dá)載體pLVX-puro-UBE2T的構(gòu)建 通過(guò)NCBI獲得小鼠UBE2T基因序列(GenBank登錄號(hào)：NM_026024.3)，引入EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)，送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成基因片段。將合成的UBE2T基因片段與pLVX-puro載體進(jìn)行連接(16 ℃連接過(guò)夜)，構(gòu)建UBE2T基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pLVX-puro-UBE2T。將pLVX-puro-UBE2T轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃搖床培養(yǎng)1～2 h，8 000 r/min離心2 min，棄上清，沉淀均勻涂布于氨芐青霉素(Ampr)抗性平板(Ampr含量100 g/mL)，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒pLVX-puro-UBE2T，進(jìn)行PCR和EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切驗(yàn)證。

設(shè)計(jì)pLVX-puro載體和pLVX-puro-UBE2T的共同檢測(cè)引物：F.5′-CACGCTGTTTTGACCTCCAT-3′，R.5′-GGATGTGGAATGTGTGCG-AG-3′。質(zhì)粒pLVX-puro和pLVX-puro-UBE2T PCR驗(yàn)證反應(yīng)體系為20 μL：2×ESTaqMasterMix 10.0 μL，pLVX-puro-UBE2T或pLVX-puro 1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR反應(yīng)條件： 94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)30次；72 ℃ 7 min。反應(yīng)結(jié)束后，取二者PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。質(zhì)粒pLVX-puro-UBE2TEcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切驗(yàn)證體系為40 μL：EcoR Ⅰ限制性內(nèi)切酶2.0 μL，BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶2.0 μL，重組質(zhì)粒pLVX-puro-UBE2T 20.0 μL，10×H Buffer 4.0 μL和ddH2O 12.0 μL。反應(yīng)結(jié)束后，取酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.2 過(guò)表達(dá)效果的檢測(cè) 用6孔板培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的Opti-MEM)，1 mL/孔，待密度為1×106mL-1時(shí)，更換培養(yǎng)基為不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基(1 mL/孔)，將細(xì)胞分為PBS對(duì)照組、pLVX-puro空質(zhì)粒組和pLVX-puro-UBE2T過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組。取2支滅菌的EP管，一管加入10 μL Lipofectamine 2000和240 μL Opti-MEM；另一管加入15 μL質(zhì)粒(pLVX-puro或pLVX-puro-UBE2T)或PBS(PBS對(duì)照組)和235 μL Opti-MEM，混勻后室溫孵育5 min。將上述2個(gè)EP管中的液體混合并混勻，室溫孵育15 min。將上述混合液全部加入各組細(xì)胞的6孔板內(nèi)，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)；4 h后在6孔板中加入含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基(2 mL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)UBE2T基因過(guò)表達(dá)效果。從NCBI網(wǎng)站GenBank上查找UBE2T和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因序列(GenBank登錄號(hào)分別為NM_026024.3和NM_008084.3)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參，在羅氏LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為：2×SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，雙蒸水6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃(UBE2T)或60 ℃(GAPDH) 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。試驗(yàn)設(shè)以PBS處理的RAW264.7細(xì)胞為對(duì)照。每組細(xì)胞3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

表1 UBE2T和GAPDH的qRT-PCR引物Table 1 Primers of qRT-PCR of UBE2T and GAPDH

1.3 UBE2T沉默表達(dá)RAW264.7細(xì)胞的構(gòu)建

1.3.1 小干擾RNA(siRNA)的設(shè)計(jì) 依據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司針對(duì)UBE2T基因序列設(shè)計(jì)3對(duì)陽(yáng)性siRNA片段(UBE2T-379-siRNA、UBE2T-599-siRNA、UBE2T-661-siRNA)和1對(duì)陰性siRNA片段(表2)。

表2 UBE2T siRNA序列Table 2 Sequences of UBE2T siRNA

1.3.2 沉默表達(dá)效果的檢測(cè) 用六孔板培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7(培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的Opti-MEM)，1 mL/孔，待密度為1×106mL-1時(shí)，更換培養(yǎng)基為不含血清的Opti-MEM培養(yǎng)基(1 mL/孔)，將細(xì)胞分為PBS對(duì)照組、陰性siRNA組、UBE2T-379-siRNA干擾組、UBE2T-599-siRNA干擾組和UBE2T-661-siRNA干擾組。取2支滅菌的EP管，每管分別加125 μL Opti-MEM，然后一管加入7 μL Lipofectamine RNAiMAX，另一管加入12.5 μL siRNA(UBE2T-379-siRNA、UBE2T-599-siRNA、UBE2T-661-siRNA或陰性siRNA)或PBS(PBS對(duì)照組)，混勻后室溫孵育5 min。將上述2個(gè)EP管中的液體混合并混勻，室溫孵育15 min。將上述混合液全部加入各組細(xì)胞的六孔板內(nèi)，放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4 h后在6孔板中加入含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基(2 mL/孔)；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以GAPDH為內(nèi)參，利用qRT-PCR檢測(cè)UBE2T基因沉默表達(dá)效果,具體試驗(yàn)方法同1.2.2節(jié)。

1.4 UBE2T沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響

采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)試驗(yàn)檢測(cè)，將UBE2T-661-siRNA和pLVX-puro-UBE2T質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔103～104個(gè)細(xì)胞的量接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積為200 μL，邊緣孔用無(wú)菌的PBS填充。棄去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm處測(cè)量各孔的吸光值，具體操作見說(shuō)明書。試驗(yàn)設(shè)正常培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞為對(duì)照，重復(fù)3次。

1.5 羊種布魯氏菌M5-90感染對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

采用qRT-PCR法,檢測(cè)M5-90感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞UBE2T基因相對(duì)表達(dá)量的影響，以及對(duì)過(guò)表達(dá)或沉默表達(dá)UBE2T基因的RAW264.7細(xì)胞中含pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族3(NLRP3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)基因相對(duì)表達(dá)量的影響。從NCBI網(wǎng)站GenBank上查找NLRP3和Caspase-1基因序列(GenBank登錄號(hào)分別為NM_145827.4和NM_009807.2)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表3)，UBE2T和GAPDH的引物相關(guān)信息見表1，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表3 NLRP3和Caspase-1的qRT-PCR引物Table 3 Primers of qRT-PCR of NLRP3 and Caspase-1

取RAW264.7細(xì)胞，用羊種布魯氏菌M5-90感染(感染復(fù)數(shù)(MOI)為100)，于感染后4，8，12和24 h后收集細(xì)胞，用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，在羅氏LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上對(duì)各時(shí)間點(diǎn)UBE2T的表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，具體方法見1.2.2節(jié)。試驗(yàn)設(shè)以PBS處理的RAW264.7細(xì)胞為對(duì)照。

取轉(zhuǎn)染pLVX-puro-UBE2T和UBE2T-661-siRNA的RAW264.7細(xì)胞，用羊種布魯氏菌M5-90感染(MOI為100)，于感染后24 h收集細(xì)胞，用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參，在羅氏LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上對(duì)NLRP3和Caspase-1表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，具體方法同1.2.2節(jié)。同時(shí)設(shè)正常RAW264.7細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pLVX-puro空質(zhì)粒、陰性siRNA、PBS處理的RAW264.7細(xì)胞為對(duì)照。

1.6 UBE2T沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌增殖的影響

取1.5中M5-90感染的5組細(xì)胞，37 ℃共孵育1.5 h后，PBS洗除未感染的胞外細(xì)菌，添加含有50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基以殺死胞外菌，PBS漂洗，更換無(wú)抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)液，孵育4，8，12和24 h時(shí)用體積分?jǐn)?shù)0.2%的TritonX-100裂解細(xì)胞，室溫放置12 min以釋放胞內(nèi)菌，對(duì)裂解液倍比稀釋，涂布固體平板，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果以活菌數(shù)的常用對(duì)數(shù)表示。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 UBE2T沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)LDH、Caspase-3活性及相關(guān)細(xì)胞因子的影響

取1.5中M5-90感染24 h的5組細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)LDH水平、Caspase-3活性，利用ELISA方法檢測(cè)IL-6、IL-18、IL-1β和IFN-γ等細(xì)胞因子的水平。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果以“平均值(Means)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)表達(dá)載體pLVX-puro-UBE2T構(gòu)建及表達(dá)效果的驗(yàn)證

2.1.1 pLVX-puro-UBE2T的構(gòu)建 由圖1可知，PCR獲得254 bp的pLVX-puro片段和881 bp的pLVX-puro-UBE2T片段，與預(yù)期結(jié)果相符。由圖2可知，pLVX-puro-UBE2T經(jīng)EcoRⅠ/BamH Ⅰ雙酶切后獲得627 bp的目的基因條帶，片段長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果相符。PCR和EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切結(jié)果表明，pLVX-puro-UBE2T構(gòu)建成功。

M.DL2000 DNA Marker;1.pLVX-puro PCR產(chǎn)物;2.pLVX-puro-UBE2T PCR產(chǎn)物M.DL2000 DNA Marker;1.Products of pLVX-puro by PCR;2.Products of pLVX-puro-UBE2T by PCR圖1 重組載體pLVX-puro-UBE2T的PCR驗(yàn)證Fig.1 PCR verification of recombinant plasmid pLVX-puro-UBE2T

2.1.2 過(guò)表達(dá)效果的檢測(cè) 由圖3可知，pLVX-puro-UBE2T質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組UBE2T的表達(dá)量極顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.01)；UBE2T在空質(zhì)粒組pLVX-puro中的表達(dá)量與PBS對(duì)照組相似。結(jié)果表明，pLVX-puro-UBE2T質(zhì)?？蛇^(guò)表達(dá)UBE2T。

2.2 siRNA干擾UBE2T基因表達(dá)效果的驗(yàn)證

由圖4可知，UBE2T-379-siRNA、UBE2T-599-siRNA和UBE2T-661-siRNA干擾組UBE2TmRNA的相對(duì)表達(dá)量均極顯著低于PBS對(duì)照組(P<0.01)，干擾效率分別為58%，62%和84%。結(jié)果表明，UBE2T的最佳干擾片段為UBE2T-661-siRNA。

1.PBS對(duì)照組；2.pLVX-puro空質(zhì)粒組；3.pLVX-puro-UBE2T過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組。與PBS對(duì)照組相比，圖柱上標(biāo)*表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)**表示差異極顯著(P<0.01)，下圖同1.PBS control group;2.pLVX-puro empty plasmid group;3.pLVX-puro-UBE2T overexpression plasmid group.Compared with the PBS control group,*represents significant difference at P<0.05,and ** represents significant difference at P<0.01.The same below圖3 UBE2T過(guò)表達(dá)效果的檢測(cè)Fig.3 Effects of overexpression of UBE2T gene

2.3 沉默和過(guò)表達(dá)UBE2T基因?qū)AW264.7細(xì)胞活性的影響

由圖5可知，UBE2T-661-siRNA干擾組、pLVX-puro-UBE2T過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組RAW264.7細(xì)胞與正常細(xì)胞相比活性均在90%以上，表明沉默或過(guò)表達(dá)UBE2T基因均不影響巨噬細(xì)胞的活性，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 布魯氏菌感染對(duì)UBE2T、NLRP3和Caspase-1基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖6可知，在8，12 和24 h，M5-90感染組RAW264.7細(xì)胞UBE2TmRNA的相對(duì)表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，表明M5-90感染可提高細(xì)胞UBE2T的表達(dá)量。

由圖7可知，與PBS對(duì)照組細(xì)胞相比，pLVX-puro-UBE2T過(guò)表達(dá)組細(xì)胞NLRP3的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，而Caspase-1的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；UBE2T-661-siRNA干擾組細(xì)胞的NLRP3表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，Caspase-1表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA對(duì)照組細(xì)胞的NLRP3和Caspase-1表達(dá)量均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，沉默UBE2T提高了M5-90介導(dǎo)的NLRP3和Caspase-1的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)UBE2T抑制M5-90介導(dǎo)的NLRP3表達(dá)，提高M(jìn)5-90介導(dǎo)的Caspase-1表達(dá)。

1.正常細(xì)胞對(duì)照組；2.PBS對(duì)照組；3.pLVX-puro空質(zhì)粒對(duì)照組；4.pLVX-puro-UBE2T過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組；5.陰性siRNA對(duì)照組；6.UBE2T-661-siRNA干擾組1.Normal cell group;2.PBS control group;3.pLVX-puro empty overexpression control plasmid group;4.pLVX-puro-UBE2T overexpression plasmid group;5.Negative siRNA control group;6.UBE2T-661-siRNA interference group圖7 M5-90感染對(duì)沉默或過(guò)表達(dá)UBE2T基因的RAW264.7細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of overexpression and silence of UBE2T gene on relative expression levels of NLRP3 and Caspase-1 genes of RAW264.7 cells infected with M5-90

2.5 沉默和過(guò)表達(dá)UBE2T基因?qū)Π麅?nèi)布魯氏菌增殖的影響

由圖8可知，在12和24 h，轉(zhuǎn)染UBE2T-661-siRNA片段的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)M5-90數(shù)量顯著低于PBS對(duì)照組(P<0.05);在所有觀察時(shí)間點(diǎn)，轉(zhuǎn)染pLVX-puro-UBE2T質(zhì)粒的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)M5-90數(shù)量顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果表明，沉默UBE2T可抑制胞內(nèi)M5-90的增殖，而過(guò)表達(dá)UBE2T可促進(jìn)胞內(nèi)M5-90的增殖。

圖8 沉默或過(guò)表達(dá)UBE2T對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌增殖的影響Fig.8 Effects of overexpression and silence of UBE2T gene on intracellular replication of Brucella in RAW264.7 cells

2.6 沉默和過(guò)表達(dá)UBE2T基因?qū)5-90感染細(xì)胞的LDH、Caspase-3水平及IL細(xì)胞因子的影響

2.6.1 LDH水平 由圖9可知，與PBS對(duì)照組相比，pLVX-puro-UBE2T質(zhì)粒組RAW264.7細(xì)胞的LDH水平極顯著升高(P<0.01)，UBE2T-661-siRNA干擾組RAW264.7細(xì)胞的LDH水平顯著降低(P<0.05)。pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA組細(xì)胞的LDH水平均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，沉默UBE2T可抑制M5-90介導(dǎo)的LDH水平，而過(guò)表達(dá)UBE2T可提高M(jìn)5-90介導(dǎo)的LDH水平。

1.PBS對(duì)照組；2.pLVX-puro空質(zhì)粒組；3.pLVX-puro-UBE2T過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組；4.陰性siRNA對(duì)照組；5.UBE2T-661-siRNA干擾組。下圖同1.PBS control group;2.pLVX-puro empty plasmid group;3.pLVX-puro-UBE2T overexpression plasmid group;4.Negative siRNA control group;5.UBE2T-661-siRNA interference group.The same below圖9 沉默和過(guò)表達(dá)UBE2T對(duì)M5-90感染的RAW264.7細(xì)胞LDH水平的影響Fig.9 Effects of overexpression and silence of UBE2T on LDH levels of RAW264.7 cells infected with M5-90

2.6.2Caspase-3活性 由圖10可知，與PBS對(duì)照組相比，pLVX-puro-UBE2T質(zhì)粒組RAW264.7細(xì)胞的Caspase-3活性顯著降低(P<0.05)，UBE2T-661-siRNA干擾組Caspase-3活性顯著升高(P<0.05)，pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA組細(xì)胞的Caspase-3活性均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，沉默UBE2T可提高M(jìn)5-90介導(dǎo)的Caspase-3活性，而過(guò)表達(dá)UBE2T可抑制M5-90介導(dǎo)的Caspase-3活性。

圖10 沉默和過(guò)表達(dá)UBE2T對(duì)M5-90感染的RAW264.7細(xì)胞Caspase-3活性的影響Fig.10 Effects of overexpression and silence of UBE2T on Caspase-3 activity of RAW264.7 cells infected with M5-90

2.6.3 IL細(xì)胞因子水平 由圖11可知，與PBS對(duì)照組相比，pLVX-puro-UBE2T質(zhì)粒組RAW264.7細(xì)胞的IL-18水平無(wú)明顯變化，而IL-1β水平顯著降低(P<0.05)；UBE2T-661-siRNA干擾組IL-18水平無(wú)明顯變化，而IL-1β水平顯著升高(P<0.05);pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA組細(xì)胞的IL-18和IL-1β水平均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，沉默UBE2T可提高M(jìn)5-90介導(dǎo)的IL-1β水平，而過(guò)表達(dá)UBE2T可抑制M5-90介導(dǎo)的IL-1β水平。

圖11 沉默和過(guò)表達(dá)UBE2T對(duì)M5-90感染的RAW264.7細(xì)胞IL-18及IL-1β水平的影響Fig.11 Effects of overexpression and silence of UBE2T gene on levels of IL-18 and IL-1β of RAW264.7 cells infected with M5-90

由圖12可知，與PBS對(duì)照組相比，pLVX-puro-UBE2T質(zhì)粒組RAW264.7細(xì)胞的IFN-γ水平顯著降低(P<0.05)，而IL-6水平無(wú)明顯變化;UBE2T-661-siRNA干擾組IFN-γ和IL-6水平均顯著升高(P<0.05);pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA組細(xì)胞的IFN-γ和IL-6水平均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，沉默UBE2T可提高M(jìn)5-90介導(dǎo)的IFN-γ和IL-6水平，而過(guò)表達(dá)UBE2T可抑制M5-90介導(dǎo)的IFN-γ水平。

圖12 沉默和過(guò)表達(dá)UBE2T對(duì)M5-90感染的RAW264.7細(xì)胞IFN-γ及IL-6水平的影響Fig.12 Effects of overexpression and silence of UBE2T gene on levels of IFN-γ and IL-6 of RAW264.7 cells infected with M5-90

3 討 論

非特異性免疫在抵御病原微生物早期感染過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其中巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞均能快速識(shí)別入侵的病原菌，進(jìn)而釋放大量的促炎因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，但布魯氏菌可利用巨噬細(xì)胞表面的特殊結(jié)構(gòu)而逃避布魯氏菌Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)的識(shí)別與補(bǔ)體第三組分(C3)的活化，因此不能激發(fā)強(qiáng)烈的非特異性免疫反應(yīng)[13-15]。固有免疫系統(tǒng)模式識(shí)別受體共有4類，即TLR、NOD樣受體(NLR)、凝集素樣受體(CLR)和解旋酶樣受體(RLR)，其中TLR和NLR是識(shí)別病原微生物并誘導(dǎo)炎癥的受體[16]。NLRP3炎癥小體是識(shí)別配體并誘發(fā)慢性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵，NLRP3主要表達(dá)于嗜中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和一些初級(jí)免疫細(xì)胞中，主要分布在細(xì)胞間質(zhì)及細(xì)胞膜中[17]。存在于胞內(nèi)的部分NLR激活后形成巨大的蛋白復(fù)合體“炎癥小體”，激活Caspase-1，進(jìn)而對(duì)IL-1β和IL-18等炎癥因子的前體形式進(jìn)行切割，使其成熟并釋放至胞外，引起炎癥反應(yīng)。NLRP3炎性小體是迄今為止結(jié)構(gòu)和功能最為明確的炎性小體，主要由NLRP3、ASC和Caspase-1共同組成[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默UBE2T表達(dá)可提高M(jìn)5-90介導(dǎo)的IL-1β水平及NLRP3和Caspase-1基因的表達(dá)；過(guò)表達(dá)UBE2T可提高M(jìn)5-90介導(dǎo)Caspase-1基因的表達(dá)，抑制IL-1β水平和NLRP3基因的表達(dá)。該結(jié)果表明，UBE2T可調(diào)控胞內(nèi)布魯氏菌介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

目前，有關(guān)病毒感染與細(xì)胞泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)作用的相關(guān)研究較多，泛素能作為病毒的胞內(nèi)目標(biāo)，主要是由于其作為蛋白翻譯后修飾者，普遍參與細(xì)胞周期[20]、胞吞作用[21]和DNA修復(fù)[22]等復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程。針對(duì)豬源布魯氏菌胞內(nèi)生存機(jī)制與UPS關(guān)系的研究表明，一方面豬源布魯氏菌S2的感染促進(jìn)了巨噬細(xì)胞泛素及蛋白酶體的表達(dá)；另一方面，泛素蛋白酶體系統(tǒng)功能的增強(qiáng)，顯著降低了豬源布魯氏菌S2的早期感染，但對(duì)于中后期感染作用不明顯；而感染后期利用蛋白酶體抑制劑乳胞素(Lactacystin)抑制巨噬細(xì)胞蛋白酶體功能，卻可顯著降低豬源布魯氏菌S2的胞內(nèi)增殖能力[23]，這種情況可能是因?yàn)榉核氐鞍酌阁w功能的抑制在一定程度上促進(jìn)了巨噬細(xì)胞自體吞噬系統(tǒng)的活化，從而增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的殺菌能力[24]。目前，關(guān)于UPS中E2的研究主要集中在腫瘤疾病方面，在病原方面的研究較少，本研究探討了E2中的UBE2T在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌增殖過(guò)程中的功能，發(fā)現(xiàn)布魯氏菌M5-90在感染后8，12和24 h可激活UBE2T的表達(dá)，沉默UBE2T表達(dá)可抑制胞內(nèi)M5-90的增殖，過(guò)表達(dá)UBE2T可促進(jìn)胞內(nèi)M5-90的增殖。結(jié)果表明，UBE2T在布魯氏菌增殖中發(fā)揮重要作用。

IFN-γ是抗布魯氏菌感染免疫反應(yīng)中關(guān)鍵性的細(xì)胞因子[25]，主要由活化后的NK、CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生，其作用主要是促進(jìn)CD8+和CD4+T細(xì)胞的聚集，增強(qiáng)細(xì)胞的抗原呈遞能力。IL-6是一種具有多種效能的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)T細(xì)胞合成分泌IL-2和誘導(dǎo)B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞并促進(jìn)抗體的分泌[26]。本研究表明，沉默UBE2T表達(dá)可提高M(jìn)5-90介導(dǎo)的IFN-γ和IL-6水平；過(guò)表達(dá)UBE2T可抑制IFN-γ水平，因此可知UBE2T可調(diào)控布魯氏菌介導(dǎo)的IFN-γ和IL-6水平。