豬流行性腹瀉病毒AH-2018-HF1株全基因組序列測定與分析

孫 裴，王震震,李 亮，李 杰，樊玉鎮(zhèn)，殷宗俊，徐前明，王 勇，李 郁

(1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)所引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道疾病，臨床癥狀以嘔吐、水樣腹瀉和脫水死亡為特征，可造成5日齡及以下仔豬嚴(yán)重脫水，死亡率高達90%～100%[1-2]。PED自1978年在英國和比利時報道后，在匈牙利、德國、日本和韓國等多個歐亞國家相繼發(fā)生[3-5]。我國于1984年首次報道了PED，但一直處于散發(fā)流行，PED并不嚴(yán)重[6]，2010年秋季，我國南方大規(guī)模暴發(fā)PED，并迅速蔓延至全國各省區(qū)，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[7]。此后，PED在美國、歐洲、韓國和日本等地也造成了極大損失[8-11]。

PEDV屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約28 kb，包含5′非翻譯區(qū)(5′-UTR)、3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)和7個開放閱讀框(ORFs)，從5′到3′端依次是 ORF1ab基因、S基因、ORF3基因、E基因、M基因、N基因[12]。ORF3基因編碼一種離子通道蛋白，與病毒毒力相關(guān)[13-14]。S基因在不同毒株之間極易發(fā)生突變，導(dǎo)致S蛋白氨基酸的插入、缺失及定點突變，而且強毒與弱毒之間的差異非常明顯，因此常以S基因為參考來了解不同地區(qū) PEDV 毒株的遺傳變異和流行情況[15-17]。

2018年安徽省合肥市某規(guī)?；i場豬群免疫了傳統(tǒng)的豬流行性腹瀉二聯(lián)苗，但新生仔豬仍然發(fā)生了嚴(yán)重的腹瀉，對腹瀉病料進行鑒定，證明為PED感染。為揭示該PEDV毒株的遺傳進化情況，以及與國內(nèi)外其他PEDV毒株之間的關(guān)系，本研究進一步提取病毒總RNA，并對全基因組序列進行了克隆測序和分析，旨在明確安徽省境內(nèi)PEDV目前的流行動態(tài)，豐富國內(nèi)PEDV研究資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 待檢樣品與細(xì)胞 2018年從安徽省合肥市某規(guī)?；i場采集PED發(fā)病仔豬的腸道組織，-80 ℃凍存?zhèn)溆?；JM109感受態(tài)細(xì)胞、Vero細(xì)胞，均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 TRIzol，購自Invitrogen公司；EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、2×Transtaq High Fidelity PCR SuperMix Ⅱ，購于北京全式金生物有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；pMD19-T Simple載體，購自寶生物工程有限公司。

1.2 病料RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

取-80 ℃保存的PED感染腸道組織，加DMEM研磨制成懸液并在高速冷凍離心機上4 ℃、 8 000 r/min離心5 min，取上清用TRIzol法提取RNA。根據(jù)EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3 PEDV全基因的克隆

參考GenBank中的 PEDV CV777 株全基因序列(登錄號AF353511)及文獻[18]，根據(jù)分段重疊法將病毒全基因組分為9個片段，采用Oligo 6.0軟件設(shè)計9對引物，引物序列見表1，由上海通用生物有限公司合成。

表1 試驗所用引物序列Table 1 Sequences of primers used in this test

分段擴增PEDV各基因片段，PCR反應(yīng)體系為：上下游引物各2 μL、2×TransTaqHigh Fidelity PCR SuperMixⅡ 25 μL、cDNA 2 μL，RNase-free Water補足至50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，47～55 ℃(具體見表1)退火30 s，72 ℃ 延伸2～4.5 min(延伸速度為1 min/kb，1～9號引物延伸時間分別為4.5，4，3，4，4，4.5，4，3，2 min)，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收目的片段。每個片段獨立重復(fù)3次。

將目的片段與pMD19-T Simple載體進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆37 ℃培養(yǎng)12 h。用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，進行PCR鑒定，將陽性的質(zhì)粒送至生物公司進行基因測序。測序結(jié)果用DNAstar軟件拼接，獲得PEDV毒株全基因組序列。

1.4 PEDV全基因組序列分析

將拼接的PEDV毒株全基因組序列與GenBank上公布的國內(nèi)外25株P(guān)EDV毒株(表2)進行比對和分析。應(yīng)用MegAlign軟件Clustal W算法進行同源性分析，使用MEGA 軟件Neighbor-Joining算法繪制系統(tǒng)進化樹。

表2 PEDV參考毒株信息Table 2 Information of PEDV reference strains

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV基因的分段擴增

經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，1～9號引物PCR擴增分別獲得了4 036，3 724，2 874，3 600，3 950，4 187，3 576，2 953和1 138 bp的片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致。

M.D8000 DNA Marker;P1-P9.分別為1～9號引物的擴增產(chǎn)物，片段長度分別為4 036，3 724，2 874，3 600，3 950，4 187，3 576，2 953和1 138 bpM.D8000 DNA Marker;P1-P9.The amplification products of primers 1-9,the fragment lengths are 4 036,3 724,2 874,3 600,3 950,4 187,3 576,2 953 and 1 138 bp圖1 PEDV全基因組引物擴增結(jié)果Fig.1 PEDV genome-wide primer amplification results

2.2 PEDV各基因片段的測序與拼接

使用DNAstar軟件將測序后的9個片段序列進行拼接，最終獲得此毒株的全基因組序列，序列全長為27 937 bp，基因結(jié)構(gòu)為5′UTR-ORF1ab-S-ORF3-E-M-N-3′UTR，各基因所在位置如表3所示。將該毒株命名為AH-2018-HF1，其基因組序列已上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫(登錄號：MN315264)。

2.3 PEDV AH-2018-HF1株的全基因組特征

與經(jīng)典毒株CV777(疫苗株)相比，AH-2018-HF1株全基因組含有多個缺失或插入?yún)^(qū)域，其中5′UTR核苷酸有5 bp堿基缺失和1 bp堿基插入，與CV777的同源性為98.9%；ORF1ab有25 bp堿基缺失，核苷酸序列同源性為98.3%；S基因有6 bp堿基缺失，核苷酸序列同源性為96.8%；ORF3有49 bp堿基缺失，核苷酸序列同源性為97.9%；E基因有12 bp堿基缺失，核苷酸序列同源性為97.3%；M和N基因無堿基缺失和插入，核苷酸序列同源性分別為98.9%和97.4%。

表3 PEDV AH-2018-HF1株的基因組結(jié)構(gòu)Table 3 Genomic structure of PEDV strain AH-2018-HF1

2.4 PEDV AH-2018-HF1株全基因組序列同源性分析

PEDV AH-2018-HF1株與GenBank 中25個參考毒株全基因組序列同源性的分析比對結(jié)果(表4)顯示，AH-2018-HF1株與2012年山東毒株SD-M核苷酸同源性最高，為99.9%，與2015年江蘇毒株HLJBY的核苷酸同源性為99.8%，與疫苗毒株CV777核苷酸同源性為97.7%；與近年流行變異毒株核苷酸同源性較低，為96.0%～97.2%。

表4 PEDV AH-2018-HF1株與參考毒株全基因組序列核苷酸同源性比對Table 4 Nucleotide homology alignment of the whole genome sequence of PEDV AH-2018-HF1 strain and reference strains

表4(續(xù)) Continued table 4

2.5 PEDV AH-2018-HF1株S基因序列分析

AH-2018-HF1株S基因全長為4 146 bp，編碼1 382個氨基酸。核苷酸層面，AH-2018-HF1株與參考毒株的同源性為92.7%～99.8%，與CV777、JS2008和SD-M等經(jīng)典毒株的核苷酸同源性為96.2%～99.8%，其中與毒株SD-M核苷酸同源性最高，為99.8%；與AH2012、AJ1102和CH/HNAY/2015等國內(nèi)變異毒株的核苷酸同源性為92.9%～93.5%；與USA/Colorado/2013、FR/001/2014和K14JB01等國外流行毒株的核苷酸同源性為92.7%～95.8%。與CV777、LZC經(jīng)典毒株相比，AH-2018-HF1株S基因在459～460位缺失堿基ATA。同時，與近年中國和歐美國家變異毒株相比，AH-2018-HF1株S基因核苷酸在461-462位插入TGGAAA，在174-175位缺失CAGGGTGTCAAT。與所有參考菌株相比，在2 319-2 321位缺失GTT。與經(jīng)典毒株和變異毒株相比，AH-2018-HF1株S基因堿基的缺失與插入導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)在153-154位缺失異亮氨酸，在154-155位插入甘氨酸和賴氨酸，在57-58位缺失谷氨酰胺、脯氨酸、纈氨酸和天冬酰胺，在773-774位缺失纈氨酸。

2.6 PEDV AH-2018-HF1株ORF3基因序列分析

AH-2018-HF1株ORF3基因全長為626 bp，編碼207個氨基酸。AH-2018-HF1株與25株參考毒株的核苷酸同源性為88.6%～100%。與AH2012、AJ1102和USA/Colorado/2013等流行變異毒株及經(jīng)典毒株CV777相比，AH-2018-HF1株核苷酸在245-246位有49個堿基缺失。AH-2018-HF1株與毒株SD-M和JS2008的核苷酸同源性最高，為100%；其次為HLJBY，核苷酸同源性為99.7%，有1個堿基發(fā)生了突變(導(dǎo)致1個氨基酸突變)。與CV777的核苷酸同源性最低，僅為90.8%。

2.7 PEDV AH-2018-HF1株系統(tǒng)進化分析

PEDV毒株全基因組序列的系統(tǒng)進化分析結(jié)果(圖2)顯示，供試PEDV可分為2個群：GⅠ和GⅡ，AH-2018-HF1毒株屬于GⅠ群，與毒株SD-M處于同一進化分支，親緣關(guān)系最近，其次為HLJBY和JS2008毒株，再次為CV777和LZC毒株；GⅡ群主要囊括了近年來中國出現(xiàn)的PEDV變異毒株和歐美流行毒株，與AH-2018-HF1親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 PEDV全基因組序列系統(tǒng)進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of the whole genome sequence of PEDV

S基因是PEDV遺傳進化和流行病學(xué)研究的重要基因，因此本試驗對AH-2018-HF1和參考毒株的S基因進行了系統(tǒng)進化分析。結(jié)果(圖3)顯示，S基因的系統(tǒng)進化樹與全基因組系統(tǒng)進化樹具有相似的分組結(jié)構(gòu)，同樣分為GⅠ群和GⅡ群，并且AH-2018-HF1株屬于GⅠ群，與SD-M和HLJBY毒株的親緣關(guān)系最近。

圖3 PEDV S基因序列系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of PEDV S gene sequence

PEDV ORF3作為病毒唯一的輔助基因，可能與PEDV的毒力有關(guān)，因此本試驗對 AH-2018-HF1 ORF3基因與其他PEDV參考毒株進行了系統(tǒng)進化分析。 結(jié)果(圖4)顯示，ORF3的系統(tǒng)進化樹不同于全基因組和S基因的系統(tǒng)進化樹，大部分流行變異毒株屬于GⅡ群；AH-2018-HF1株與AJ1102、CH/YNKM-8/2013、CHGD-01、GD-A和ZJCZ4變異毒株則屬于GⅠ群。

圖4 PEDV ORF3基因序列系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of PEDV ORF3 gene sequence

3 討 論

PED是由PEDV引起的仔豬和育肥豬的一種急性腸道傳染病，已成為世界上最具危害性的豬病毒性疾病之一，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[19]。目前生物安全和疫苗接種是防控該病的基本方法，但不能有效地根除PEDV[20-21]。

PEDV的基因組測序鑒定與分析對該病的流行病學(xué)及病毒基因結(jié)構(gòu)變異監(jiān)測十分重要[22]。S基因是PEDV的毒力基因，在PEDV的遺傳進化過程中起重要作用[23-24]。本研究中， PED AH-2018-HF1株全基因組與CV777株同源性為97.7%，S基因序列同源性為96.8%。與CV777、LZC等經(jīng)典毒株相比，AH-2018-HF1株S基因在459-461位缺失堿基ATA。同時，與近年中國和歐美國家變異毒株相比，AH-2018-HF1株核苷酸在461-462位插入TGGAAA，在174-175位缺失CAGGGTGTCAAT。與所有參考毒株相比，AH-2018-HF1在2 319-2 320位缺失GTT。這些突變可能會影響S蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致毒株的毒力發(fā)生變化。Park等[25]比較了野生型和減毒型PEDV，發(fā)現(xiàn)減毒型毒株ORF3中均有17個氨基酸缺失(82-98位)，表明PEDV全長基因組基因的缺失對病毒毒力有影響。AH-2018-HF1株ORF3基因與CV777株相比，有13個堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致5個氨基酸突變，在245-293位有49個堿基缺失，暗示毒株AH-2018-HF1毒力可能降低，但此毒株能否作為減毒毒株用于研制PEDV的減毒活疫苗，還需后續(xù)動物致病性試驗進行進一步驗證。

為深入了解PEDV AH-2018-HF1株的遺傳變異情況和流行病學(xué)現(xiàn)狀，將該毒株與其他不同地點、不同年份的毒株進行了全基因組、S基因和ORF3基因序列比較分析。全基因組序列同源性分析顯示，AH-2018-HF1株與SD-M株核苷酸同源性最高(99.9%)，親緣關(guān)系最近，與HLJBY株的核苷酸同源性為99.8%，與毒株CV777核苷酸同源性為97.7%；與近年中國流行變異毒株和歐美流行流行毒株核苷酸同源性較低，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。表明PEDV在我國存在流行變異情況。S基因系統(tǒng)進化結(jié)果與全基因組系統(tǒng)進化結(jié)果相似，但ORF3系統(tǒng)進化結(jié)果與全基因組序列系統(tǒng)進化結(jié)果不同，ORF3基因的系統(tǒng)進化樹顯示AH-2018-HF1株與部分流行變異株屬于GⅠ群。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果提示,AH-2018-HF1 ORF3可能是流行株與經(jīng)典株之間基因重組的結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)基于PEDV不同基因構(gòu)建的進化樹不同，這可為PEDV重組和進化分析提供數(shù)據(jù)支持。