p-ERK下調(diào)分揀蛋白表達(dá)對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠肝損傷的機(jī)制研究*

藺文燕，田利民，狄寶山，余 靜，牛想娥，張 琦△，劉 靜△

（1甘肅省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，2甘肅省人民醫(yī)院西院區(qū)，甘肅蘭州 730000）

隨著肥胖和糖尿病發(fā)病率的增加，非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcohol fatty liver disease，NAFLD）成為威脅人類(lèi)健康最常見(jiàn)的慢性肝病之一，也是21 世紀(jì)全球重要的公共健康問(wèn)題之一［1-2］。研究統(tǒng)計(jì)，亞洲普通人群中NAFLD 的患病率為25%［3］，在肥胖人群中為57.5%～74.0%，約15%～50%的肝纖維化和肝硬化與NAFLD 有關(guān)［4］，脂肪肝纖維化患者中約30%于10 年后可發(fā)展為肝硬化，進(jìn)一步導(dǎo)致肝癌［5-7］。以往的研究多集中在NAFLD 的血清學(xué)及藥物方面，而NAFLD 的發(fā)病機(jī)制研究較少。因此，體外成功構(gòu)建NAFLD 的動(dòng)物模型對(duì)于研究疾病的發(fā)生、發(fā)展及防治十分重要［5］。

肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）功能紊亂是NAFLD 形成的早期階段［8-10］。分揀蛋白（sortilin）由SORT1基因編碼［11-12］，屬于Vps10P 域受體家族一員，廣泛分布于腦、肝、脂肪和神經(jīng)等組織及相關(guān)細(xì)胞，參與多種蛋白的胞內(nèi)外分泌與轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡和生存及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［13-14］。全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）運(yùn)用無(wú)偏倚的工具研究表明，sortilin 與低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）的降低密切相關(guān)［15-16］，但對(duì)以甘油三酯（triglyceride，TG）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）升高為特征的脂質(zhì)代謝紊亂的NAFLD［17-19］的相關(guān)報(bào)道尚少。本研究結(jié)合動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（phosphorylated extracel?lular signal-regulated kinase，p-ERK）下調(diào)sortilin 表達(dá)與NAFLD肝損傷形成的機(jī)制，為NAFLD的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只8 周齡雄性的SPF 級(jí)Wistar 大鼠（180～220 g），由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（甘）2019-0002，動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號(hào)為syll20160031］，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，大鼠自由進(jìn)水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

2 主要試劑

油紅O（oil red O，ORO）染色試劑盒（細(xì)胞專(zhuān)用）、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipo?protein，ox-LDL）和基底膜六胺銀染色試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（endo?thelial cell growth factor，ECGF）由不倫瑞克公司提供；膠原酶Ⅱ由Sigma提供；兔抗sortilin抗體、兔抗p-ERK 抗體、兔抗CD31 和β-actin 抗體由Abcam 提供；PD98059由Selleck提供；引物由TaKaRa合成；Annex?inⅤ-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒由BD提供；ELISA 試劑盒由上海卒瑞生物科技有限公司提供；DAB 顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋有限公司提供。

3 主要儀器

YD-315 切片機(jī)、YD-AB 生物組織攤烤片機(jī)和YD-6L 生物組織冷凍包埋機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS）；凝膠圖像分析系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（BIO-RAD）；酶標(biāo)儀（TECAN）；流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson）。

4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法

4.1 NAFLD 大鼠模型的建立 40 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為對(duì)照（control）組（n=10）、高脂飲食（high-fat diet，HFD）組（n=10）、PD98059 組（n=10）和HFD+PD98059 組（n=10）。本課題組前期研究表明高脂飼料（基礎(chǔ)飼料73.6%，豬油15%，膽固醇1.2%，膽酸鈉0.2%和蛋黃粉10%）喂養(yǎng)可成功建立NAFLD 大鼠模型［20］，因此本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)建立NAFLD 大鼠模型。同時(shí)，PD98059 組和HFD+PD98059 組給予腹腔注射PD98059（10 mg/kg），con?trol 組及HFD 組給予腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液［21］。

4.2 標(biāo)本處理和指標(biāo)檢測(cè) 干預(yù)6 周后，禁食不禁水12 h，次日上午稱(chēng)重、麻醉、摘眼球取血，并迅速取出肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水清洗肝臟表面，稱(chēng)取肝臟濕重，按常規(guī)制備血清和肝組織石蠟切片備用。血清脂質(zhì)指標(biāo)［總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholester?ol，HDL-C）和LDL-C］及肝功能指標(biāo)［丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）］按照試劑盒說(shuō)明方法檢測(cè)；血清白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）用ELISA 法檢測(cè)；肝組織石蠟切片用于HE 染色和免疫組化；六胺銀染色按照試劑盒說(shuō)明方法檢測(cè)。肝臟指數(shù)（%）=肝臟濕重（g）/體重（g）×100%。

5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法

5.1 原代LSECs 的提取、培養(yǎng)及鑒定 按照參考文獻(xiàn)［22-25］及本課題組前期研究［26］的方法提取大鼠的LSECs。將LSECs 培養(yǎng)于含有內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（endothelial cell growth factor，ECGF）的低糖型完全培養(yǎng)液中，把細(xì)胞放進(jìn)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)參數(shù)：潮濕的空氣，5% CO2，37℃），根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、融合度及培養(yǎng)液顏色換液傳代。細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照（con?trol）組、ox-LDL（100 mg/L）組、PD98059（10 μmol/L）組和ox-LDL+PD98059（100 mg/L ox-LDL+10 μmol/L PD98059）組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Anti-CD31 免疫熒光染色鑒定LSECs。

5.2 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按1×107/L 的密度接種至含有蓋玻片的6 孔板上，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)蓋玻片時(shí)，將蓋玻片放入100 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用預(yù)冷的PBS 浸洗3 次，4%的多聚甲醛固定爬片20 min，PBS浸洗3 次，預(yù)冷的0.2% Triton X-100 室溫通透10 min，PBS浸洗3次，在爬片上滴加山羊血清，室溫封閉1 h，棄封閉液，每張玻片加入適量的Anti-CD31 抗體（1∶500）并放入濕盒，4℃孵育過(guò)夜；次日取出濕盒中的爬片，PBS 清洗3 次，滴加熒光Ⅱ抗（Anti-FITC，1∶300），濕盒孵育2 h，PBS 清洗3 次，暗處滴加DAPI 避光孵育5 min染核，PBS清洗4次，用抗熒光淬滅劑的封片劑封片，然后在熒光顯微鏡下采集圖像。

5.3 ORO 染色和LSECs 凋亡的檢測(cè) ORO 染色和流式細(xì)胞術(shù)根據(jù)ORO 染色（細(xì)胞專(zhuān)用）試劑盒和An?nexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的方法進(jìn)行操作。

5.4 RT-qPCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn) RT-qPCR 檢測(cè)時(shí)分別根據(jù)總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，檢測(cè)各組細(xì)胞RNA 的表達(dá)；Western blot 檢測(cè)時(shí)依次按照提取蛋白、蛋白濃度測(cè)定、配制凝膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫反應(yīng)和化學(xué)發(fā)光的步驟進(jìn)行。RT-qPCR 引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式表示。單因素方差分析用于多組間比較。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每次實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)進(jìn)行3次。

結(jié)果

1 高脂喂養(yǎng)對(duì)大鼠體重、血脂、肝功能和肝臟指數(shù)的影響

干預(yù)6 周后，與control 組相比，HFD 組和HFD+PD98059 組大鼠體重升高（P＜0.05），血清TC、TG、LDL-C、AST 和ALT 水平升高（P＜0.05），HDL-C 水平降低（P＜0.05），肝臟指數(shù)升高（P＜0.05），PD98059組上述各指標(biāo)無(wú)顯著變化（P＞0.05）；與HFD 組相比，PD98059 組和HFD+PD98059 組大鼠體重降低（P＜0.05），血清TC、TG、LDL-C、AST和ALT水平降低（P＜0.05），HDL-C水平升高（P＜0.05），肝臟指數(shù)降低（P＜0.05）；與PD98059 組相比，HFD+PD98059 組大鼠體重升高（P＜0.05），血清TC、TG、LDL-C、AST和ALT水平升高（P＜0.05），HDL-C水平降低（P＜0.05），肝臟指數(shù)升高（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 大鼠體重、血脂、肝功能和肝臟指數(shù)的比較Table 2.Comparison of body weight，blood lipids，liver function and liver index in rats（Mean±SD. n=10）

2 大鼠血清炎癥因子IL-6和TNF-α表達(dá)的變化

與control 組相比，HFD 組和HFD+PD98059 組IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平升高（P＜0.05），PD98059 組無(wú)顯著變化（P＞0.05）；與HFD組相比，PD98059組和HFD+PD98059 組IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與PD98059 組相比，HFD+PD98059 組IL-6 和TNF-α表達(dá)水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.The serum levels of IL-6 and TNF-α in rats.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HFD group；△P＜0.05 vs PD98059 group.圖1 大鼠血清IL-6和TNF-α水平的變化

3 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的變化

HE 染色表明，control 組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，圍繞中央靜脈呈放射狀排列分布，細(xì)胞內(nèi)無(wú)脂滴形成，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)均勻，無(wú)脂肪變性；HFD 組大鼠肝小葉排列松散、紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大小不等的氣球樣脂肪空泡，呈現(xiàn)顯著的脂肪變性，胞質(zhì)內(nèi)充滿(mǎn)脂滴，炎癥細(xì)胞彌散浸潤(rùn)在脂肪樣變肝組織中；PD98059 組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)脂滴、脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；HFD+PD98059組較高脂組有略少的脂滴形成和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，脂肪變性減少，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)少許脂滴。免疫組化染色表明，與control 組相比，HFD 組p-ERK 蛋白水平升高，PD98059 組和HFD+PD98059 組p-ERK 蛋白水平降低，而HFD組和HFD+PD98059組sortilin蛋白水平降低，PD98059 組sortilin 蛋白水平無(wú)顯著變化；與HFD 組相比，PD98059 組和HFD+PD98059 組p-ERK蛋白水平降低，sortilin 蛋白水平升高；與PD98059 組相比，HFD+PD98059 組p-ERK 蛋白水平無(wú)顯著變化，sortilin 蛋白水平降低。六胺銀染色表明，control組肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝組織連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與肝索平行；HFD 組肝竇基底膜和竇間隙增厚，可見(jiàn)大片銀顆粒沉積和肝細(xì)胞脂肪變性；PD98059 組肝組織結(jié)構(gòu)與control 組無(wú)顯著變化；HFD+PD98059 組肝竇基底膜有銀顆粒沉積，肝細(xì)胞脂肪變性程度較高脂組減輕。見(jiàn)圖2。

4 LSECs的培養(yǎng)和鑒定

LSECs 從control 組大鼠肝臟分離出來(lái)，倒置相差顯微鏡下觀察：細(xì)胞邊緣清晰，胞核位于中央，形態(tài)飽滿(mǎn)，似多邊形或梭形，大小均勻呈“鵝卵石”樣生長(zhǎng)，細(xì)胞間緊密靠攏，見(jiàn)圖3A。Anti-CD31 免疫熒光染色表明，90%的細(xì)胞免疫熒光染色陽(yáng)性，DAPI 染核藍(lán)色，表明CD31表達(dá)于LSECs上，見(jiàn)圖3B。

5 ORO染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

ORO 染色表明，control 組LSECs 內(nèi)有少量的脂滴，表明細(xì)胞間脂滴含量低；ox-LDL 組LSECs 內(nèi)可看到大量紅色脂滴；PD98059 組LSECs 內(nèi)有極少量脂滴；ox-LDL+PD98059 組LSECs 脂滴較ox-LDL 組減少。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，control 組細(xì)胞的凋亡率為6.65%；ox-LDL 組細(xì)胞的凋亡率為12.14%，較control 組顯著升高（P＜0.05）；PD98059 組細(xì)胞的凋亡率為3.41%，ox-LDL+PD98059 組細(xì)胞的凋亡率為10.83%，均較ox-LDL 組顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

6 LSECs中sortilin和p-ERK的表達(dá)水平

Figure 2.Pathomorphological changes of rat livers（scale bar=50 μm）.A：control group；B：HFD group；C：PD98059 group；D：HFD+PD98059 group.圖2 大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的變化

Figure 3.Morphological changes（A）and CD31 expression（B）in the LSECs observed under fluorescence microscope（scale bar=20 μm）.圖3 熒光顯微鏡下LSECs的形態(tài)和CD31的表達(dá)

Western blot 和RT-qPCR 結(jié)果顯示，與control 組相比，ox-LDL 組p-ERK 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），PD98059 組和ox-LDL+PD98059 組p-ERK 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），sortilin 蛋白和mRNA 水平亦顯著降低（P＜0.05），而PD98059 組sortilin 蛋白及mRNA 水平無(wú)顯著變化（P＞0.05）；與ox-LDL 組相比，PD98059 組和ox-LDL+PD98059 組p-ERK 蛋白水平顯著降低（P＜0.05），而sortilin 蛋白和mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）；與PD98059 組相比，ox-LDL+PD98059 組p-ERK 蛋白水平無(wú)顯著變化（P＞0.05），sortilin 蛋白及mRNA 水平顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

討論

NAFLD是以肝臟脂肪變性和脂肪蓄積為特征的脂質(zhì)代謝紊亂性疾病，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等因素在其中發(fā)揮重要作用［27］。高脂飼料喂養(yǎng)的動(dòng)物模型是目前常用的NAFLD動(dòng)物模型，它模擬了NAFLD的發(fā)生發(fā)展和病變特征［5，20］。LDL 是一種運(yùn)載膽固醇進(jìn)入外周組織細(xì)胞的脂蛋白顆粒，當(dāng)其被氧化成為ox-LDL 時(shí)可引起血管硬化和NAFLD 等相關(guān)疾病［28］。LDL-C 是反映全身的脂代謝狀態(tài)的標(biāo)志之一，血管內(nèi)積聚的LDL-C 一旦超過(guò)了肝臟存儲(chǔ)的極限能力，將會(huì)產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致肝損傷和功能障礙［28］。AST和ALT 是分布在肝細(xì)胞內(nèi)最常用的評(píng)估肝功能和肝損傷的指標(biāo)，其升高程度與肝細(xì)胞受損程度一致。如果肝臟發(fā)生損傷，肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)氨酶便進(jìn)入血液，血液中AST 和ALT 水平升高，是肝臟疾病提示信號(hào)［29］。本實(shí)驗(yàn)中高脂模型大鼠血清AST 和ALT 水平升高，PD98059干預(yù)后，其水平降低。

目前“二次打擊”學(xué)說(shuō)是NAFLD 的機(jī)制假說(shuō)之一，其認(rèn)為脂質(zhì)在肝細(xì)胞的聚集（第1 次打擊）后觸發(fā)一系列細(xì)胞毒素反應(yīng)（第2 次打擊），導(dǎo)致肝損傷是NAFLD 的重要機(jī)制［30-31］，因此脂質(zhì)代謝的調(diào)控是預(yù)防和逆轉(zhuǎn)NAFLD 發(fā)生、發(fā)展的有效手段，尤其是降低血清LDL-C。本研究表明，PD98059 干預(yù)后，能夠顯著降低NAFLD 模型大鼠TC、TG 和LDL-C 水平，同時(shí)升高HDL-C 水平，提示PD98059 能夠通過(guò)減輕“第1次打擊”預(yù)防及逆轉(zhuǎn)NAFLD 的發(fā)生。本研究還發(fā)現(xiàn)，PD98059 干預(yù)后，大鼠肝臟組織sortilin 蛋白及mRNA SORT1 的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)IL-6 和TNF-α 的表達(dá)顯著下調(diào)，說(shuō)明此干預(yù)抑制炎癥因子釋放的同時(shí)能夠顯著上調(diào)肝臟組織sortilin 蛋白及mRNA 的表達(dá)，為減輕NAFLD“第2次打擊”提供了客觀依據(jù)。

Figure 4.Oil red O（ORO）staining（scale bar=20 μm）and determination of apoptosis rate in LSECs by flow cytometry.A：control group；B：ox-LDL group；C：PD98059 group；D：ox-LDL+PD98059 group.圖4 油紅O染色和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定LSECs凋亡率

Figure 5.The expression of sortilin and the protein level of p-ERK detected by Western blot and RT-qPCR.A：the protein levels of sortilin and p-ERK detected by Western blot；B：the mRNA expression of sortilin detected by RT-qPCR.Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；△P＜0.05 vs PD98059 group.圖5 Western blot和RT-qPCR檢測(cè)sortilin表達(dá)及p-ERK蛋白水平

sortilin 是體內(nèi)調(diào)控脂質(zhì)轉(zhuǎn)錄與合成的關(guān)鍵因子，作為L(zhǎng)DL 的細(xì)胞表面清除受體，其通過(guò)與載脂蛋白ApoB 的結(jié)合調(diào)控LDL 分泌，并將其導(dǎo)向細(xì)胞表面分泌或降解［32-34］，從而參與脂質(zhì)顆粒的形成及轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程［15-16］。ERK 是將信號(hào)從表面受體傳至細(xì)胞核的關(guān)鍵細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶［35］，可接受上游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)信號(hào)刺激（如ox-LDL）轉(zhuǎn)化為p-ERK 進(jìn)入細(xì)胞核，活化細(xì)胞核內(nèi)的某些轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而參與細(xì)胞的調(diào)控及增殖等［36-37］。在本實(shí)驗(yàn)中，高脂條件下sortilin表達(dá)下調(diào)，p-ERK 表達(dá)上調(diào)，PD98059 抑制p-ERK 后，sor?tilin 表達(dá)上調(diào)，p-ERK 表達(dá)下調(diào)，PD98059 可以逆轉(zhuǎn)sortilin 的表達(dá)，且sortilin 的mRNA 表達(dá)水平呈同等趨勢(shì)改變，提示ERK 信號(hào)通路的激活可能是sortilin調(diào)節(jié)NAFLD 形成的途徑之一，PD98059 通過(guò)ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制高脂血癥小鼠的肝脂肪形成和脂肪變性。因此抑制肝臟內(nèi)p-ERK 的活性（PD98059），上調(diào)sortilin 的表達(dá)，可能促進(jìn)脂質(zhì)代謝，預(yù)防NAFLD的形成和炎癥反應(yīng)。血漿中增加的ox-LDL 被認(rèn)為是脂積累和LSECs 凋亡的誘導(dǎo)劑［38-39］，本實(shí)驗(yàn)中，高脂條件下，LSECs 的凋亡增加，PD98059 干預(yù)后，LSECs 的凋亡降低，提示高脂在引起細(xì)胞凋亡過(guò)程中有重要作用。

綜上所述，ox-LDL 激活p-ERK 信號(hào)通路下調(diào)肝組織sortilin 的表達(dá)，PD98059 干預(yù)后，sortilin 表達(dá)上調(diào)且p-ERK、TNF-α 和IL-6 表達(dá)下調(diào)，同時(shí)大鼠肝臟損傷、脂質(zhì)蓄積、脂肪變性、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡得到顯著改善，其機(jī)制可能與sortilin 增強(qiáng)肝功能和降低脂質(zhì)氧化水平帶來(lái)的毒性反應(yīng)有關(guān)。