載他克莫司可注射溫敏水凝膠促牙髓干細(xì)胞成骨向分化作用研究

王芃 何華春 李道偉 孫宏晨 吳立鵬

人牙髓干細(xì)胞(human pulp stem cells，hDPSCs)是組織再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[1]。hDPSCs的獲取方便，可以由患者自身牙齒的自體細(xì)胞提供。hDPSCs是干細(xì)胞，能夠多向分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)源性細(xì)胞，脂肪細(xì)胞細(xì)胞等[2]。由于它們有向成骨分化的能力[3]，可作為骨組織工程中細(xì)胞的選擇。

他克莫司FK506是一種強(qiáng)效的免疫抑制劑，廣泛用于實(shí)驗(yàn)和臨床中的預(yù)防移植后的器官排斥和治療自身免疫性疾病[4]。有研究報(bào)道，F(xiàn)K506的治療可能會(huì)增加骨量，并可能對(duì)骨缺損是一種潛在的治療方式[5]。

本研究提出一種由可注射溫敏水凝膠與FK506復(fù)合材料(FK506-TH)制備的生物相容性骨修復(fù)材料。單純應(yīng)用FK506存在半衰期短、價(jià)格昂貴、易降解等問(wèn)題，因此，常需與合適的藥物控釋系統(tǒng)復(fù)合，以保證其在損傷處持續(xù)高效釋放，更好的發(fā)揮促進(jìn)組織再生的作用。而載有促進(jìn)組織修復(fù)藥物的水凝膠材料在達(dá)到適宜溫度時(shí)凝結(jié)成膠狀固體，更具有藥物緩釋性能。在保證FK506藥物正常發(fā)揮功能的同時(shí)，增加了可溶性溫敏水凝膠的協(xié)同促進(jìn)作用，以期獲得具有較大性能空間的材料。長(zhǎng)期、持續(xù)、少量的給藥形式，有望在個(gè)性化醫(yī)療中得到應(yīng)用。本文旨在探討載FK506可注射溫敏水凝膠(FK506-TH)作為一種有效的骨修復(fù)材料是一種有前景的治療策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與設(shè)備

FK506、ALP試劑盒、茜素紅S(Sigma公司，美國(guó))；胎牛血清(FBS)(Gibco公司，美國(guó))；青霉素鏈霉素雙抗溶液(PAA公司，美國(guó))；Cell Counting Kit-8(DOJINDO Laboratories公司，日本)；引物(Takara公司，日本)；酶標(biāo)檢測(cè)儀(Bio-TEK公司，美國(guó))；PCR擴(kuò)增儀(Thermo公司，美國(guó))。

1.2 FK506-TH水凝膠的制備

FK506儲(chǔ)存液的制備：使用電子天平在稱量紙上稱取5 mg FK506粉末，放置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于1.22 mL DMSO溶劑中，配置成濃度為5 mmol/L的FK506儲(chǔ)存液，放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

56%β-甘油磷酸鈉溶液的制備：在稱量紙上稱取4.48 g β-甘油磷酸鈉粉末，放置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于8 mL H-DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS、1%青霉素、1%鏈霉素)，0.22 μm濾器過(guò)濾，放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2%殼聚糖鹽酸溶液的制備：在稱量紙上稱取0.8 g CS粉末，放置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于40 mL H-DMEM培養(yǎng)基中，磁力攪拌至顆粒完全溶解，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0， 0.22 μm濾器過(guò)濾，現(xiàn)配現(xiàn)用。

0.5%明膠溶液的制備：在稱量紙上稱取0.05 g明膠粉末，放置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，紫外燈光照射6 h滅菌處理，將粉末溶于10 mL H-DMEM培養(yǎng)基中， 0.22 μm濾器過(guò)濾，放于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將8 mL β-甘油磷酸鈉溶液逐滴地加入到40 mL 2%殼聚糖鹽酸溶液中，產(chǎn)生絮狀沉淀，再加入1 mL明膠，配置成FK506-TH， 0.22 μm濾器過(guò)濾為可注射溫敏水凝膠浸提液。使用過(guò)程中，用可注射溫敏水凝膠浸提液將5 mmol/L的FK506稀釋至10、50、100、500、1 000、1 500、2 000 nmol/mL。

1.3 hDPSCs的分離提取及培養(yǎng)方法

收集2018 年12 月～2019 年1 月吉林大學(xué)口腔醫(yī)院18～30 歲志愿者因埋伏阻生而拔除的無(wú)病變第三磨牙，酶消化法培養(yǎng)hPDSCs，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代hDPSCs以1×105個(gè)/孔的密度接種在6 孔板中(2 mL/孔)，設(shè)置實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組、可注射溫敏水凝膠組、FK506組、載FK506可注射溫敏水凝膠組。

1.4 FK506-TH的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定FK506-TH浸提液濃度為0、 10、 50、 100、 500、 1 000、 1 500、 2 000 nmol/L對(duì)hPDSCs增殖的影響， 平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 FK506-TH促進(jìn)成骨分化實(shí)驗(yàn)

成骨誘導(dǎo)液的制備：可注射溫敏水凝膠浸提液(含10%胎牛血清、50 mg/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、10-8mol/L地塞米松)。

按照上述1.3方法接種細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。貼壁后換為成骨誘導(dǎo)液，分別誘導(dǎo)3、7、14 d， 每3 d換液，未處理的細(xì)胞為陰性對(duì)照。采用Real-time PCR檢測(cè)ALP、COLI1、Runx2、OCN和OPN表達(dá)水平。

1.6 茜素紅染色

按照上述1.3方法接種細(xì)胞，在37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。貼壁后換為成骨誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)21 d，每3 d換液。

染色方法：染色前去除原培養(yǎng)液，PBS沖洗3 次，用3 mL預(yù)冷的95%乙醇溶液在4 ℃條件下固定1 h，三蒸水沖洗3 次，加入茜素紅S染液3 mL放于4 ℃持續(xù)染色30 min，PBS洗凈浮色，觀察并拍照。

茜素紅染色定量：每孔加入1 mL 10%氯化十六烷基吡啶(10 mmol/L PBS配置，pH為7.0)，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，吹打混勻后加入96 孔板內(nèi)，使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果，計(jì)算所有復(fù)孔的平均值，平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 堿性磷酸酶染色

按照上述1.3方法接種細(xì)胞，在37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。貼壁后換為成骨誘導(dǎo)液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，每3 d換液。

染色方法：ALP固定液(檸檬酸-丙酮-甲醛固定液)預(yù)熱至26 ℃，固定細(xì)胞30 s，去離子水輕輕沖洗45 s， 37 ℃ ALP染色液避光染色15 min，去除染液，去離子水沖洗2 min，蘇木精染液復(fù)染2 min，自來(lái)水洗凈浮色，觀察并拍照。

ALP染色定量：培養(yǎng)7 d后，酶消化法收集細(xì)胞，裂解細(xì)胞，收集上清液并與堿性磷酸酶測(cè)定混合，使用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定吸光度，記錄結(jié)果，計(jì)算所有復(fù)孔的平均值，平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 FK506-TH適宜濃度的選擇

單純水凝膠(0 nmol/L)能明顯促進(jìn)hDPSCs增殖(P<0.001)，濃度(10、50、100、500、1 000、1 500、2 000 nmol/L)的載FK506可注射溫敏水凝膠浸提液均可促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)。當(dāng)濃度為500 nmol/L時(shí)促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用更明顯(P<0.01)(圖 1)。因此，選擇500 nmol/L濃度的載FK506可注射溫敏水凝膠浸提液用于后續(xù)檢測(cè)促成骨分化能力的實(shí)驗(yàn)。

圖 1 FK506-TH浸提液對(duì) hDPSCs增殖的影響(*: P<0.5,**: P<0.1, ***: P<0.01)

2.2 FK506-TH對(duì)成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖 2顯示，在hDPSCs培養(yǎng)體系中成骨誘導(dǎo)3 d后，與空白對(duì)照組相比，單純FK506組和FK506-TH組成骨相關(guān)基因ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達(dá)均上調(diào)(P<0.05)，F(xiàn)K506-TH組Runx2、OPN的表達(dá)上調(diào)更明顯(P<0.01)。相對(duì)于單純FK506組，F(xiàn)K506-TH組ALP、COLI1、Runx2的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，OCN、OPN的表達(dá)上調(diào)不明顯(P<0.05)。加入藥物7 d后，與空白對(duì)照組相比，單純FK506組和FK506-TH組ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達(dá)均上調(diào)(P<0.01)，F(xiàn)K506-TH組ALP、COLI1、OCN的表達(dá)上調(diào)更明顯(P<0.001)。FK506-TH組ALP、COLI1、OCN和OPN的表達(dá)均高于單純FK506組(P<0.05)，其中Runx2的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。加入藥物14 d后，與空白對(duì)照組相比，單純FK506組和FK506-TH組ALP、COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達(dá)均上調(diào)(P<0.01)，F(xiàn)K506-TH組ALP的表達(dá)上調(diào)更明顯(P<0.001)。FK506-TH組相對(duì)于單純FK506組，ALP的表達(dá)上調(diào)不明顯(P<0.05)，而COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達(dá)顯著提高(P<0.001)。

2.3 茜素紅染色和定量

成骨誘導(dǎo)21 d，茜素紅染色顯示，空白對(duì)照組與單純水凝膠組、FK506組、FK506-TH組3 組，均可見鮮紅色鈣化結(jié)節(jié)，且與空白對(duì)照組相比，其余3 組形成的鈣結(jié)節(jié)明顯多于空白對(duì)照組，其中FK506-TH組鈣化結(jié)節(jié)形成更多(P<0.001)(圖 3～4)。

2.4 堿性磷酸酶染色和定量

誘導(dǎo)7 d后，ALP染色顯示，空白對(duì)照組與單純水凝膠組、FK506組、FK506-TH組3 組，均可見細(xì)胞核呈藍(lán)色，且與空白對(duì)照組相比，其余3 組較空白對(duì)照組染色細(xì)胞多，其中FK506-TH處理的細(xì)胞中，更多的ALP細(xì)胞簇呈陽(yáng)性(P<0.001)。

圖 3 FK506-TH浸提液對(duì)hDPSCs礦化能力的影響

圖 4 FK506-TH浸提液對(duì)hDPSCs ALP活性的影響

3 討 論

FK506是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種參與NFAT活化的酶。NFATc1是神經(jīng)鈣蛋白的下游底物，在T細(xì)胞活化時(shí)表達(dá)強(qiáng)烈[6]。NFATc1又是破骨細(xì)胞生成所必需的[7]。破骨細(xì)胞是多核的、骨吸收細(xì)胞，在骨重建和鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中是必不可少的[8]。已有學(xué)者提出，F(xiàn)K506可以通過(guò)體外靶向鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶-NFAT途徑抑制破骨細(xì)胞形成[9]。研究結(jié)果的復(fù)雜性表明，對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用只是藥物對(duì)骨影響的一個(gè)部分，成骨細(xì)胞也表達(dá)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶。有研究報(bào)道，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的起源和功能中發(fā)揮作用[10]。FK506可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，包括Runx2、OPN和OCN[11]。水凝膠具有一定的力學(xué)性能，非常適合藥物和細(xì)胞的局部植入[12]，也能形成三維水凝膠結(jié)構(gòu)與適應(yīng)的網(wǎng)格大小，以促進(jìn)藥物傳遞和細(xì)胞移植[13]。

為了明確FK506-TH對(duì)體外成骨細(xì)胞分化及成熟的作用，本研究通過(guò)酶解法提取hDPSCs，并分別在可注射溫敏水凝膠、FK506、FK506-TH 3 種條件下探究不同藥物對(duì)hDPSCs的影響。首先，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，支架材料可注射溫敏水凝膠及FK506-TH(0～2 000 nmol/L濃度)無(wú)細(xì)胞毒性，在體外易于hDPSCs的附著和增殖，具有良好的生物相容性，二者的協(xié)同促進(jìn)作用使他們成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理想材料。RT-PCR顯示成骨誘導(dǎo)3 d時(shí)，F(xiàn)K506-TH作用后，ALP表達(dá)水平上調(diào)顯著，ALP是成骨分化早期的基因，表明成骨細(xì)胞活性高。COLI1和Runx2骨形成標(biāo)志物的顯著增加可以表明培養(yǎng)基中含有較高的骨基質(zhì)。成骨誘導(dǎo)7 d時(shí)，Runx2得表達(dá)顯著增加，說(shuō)明hDPSCs有較高的成骨活性，Runx2是成骨分化過(guò)程中的關(guān)鍵基因，在成骨分化的各個(gè)時(shí)期均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。14 d時(shí)，ALP的表達(dá)上調(diào)不明顯，可能受多種因子的影響，在本實(shí)驗(yàn)中不能明確FK506-TH對(duì)ALP的作用。而COLI1、Runx2、OCN、OPN的表達(dá)顯著提高，OCN和OPN的含量高代表已形成了成熟骨基質(zhì)。綜合以上RT-PCR結(jié)果分析，F(xiàn)K506-TH在成骨分化各期均可明顯促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，因而證實(shí)FK506-TH可以發(fā)揮一定的促成骨作用，并且相對(duì)于單純FK506藥物，其促成骨作用更強(qiáng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RT-PCR的結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行了茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色和堿性磷酸酶活性檢測(cè)。二者的結(jié)果均證實(shí)：可注射溫敏水凝膠、FK506、FK506-TH均可促進(jìn)hDPSCs分化和礦化，且FK506-TH顯示出更強(qiáng)的促成骨分化能力。其臨床應(yīng)用價(jià)值有待體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。